Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Mikroorganizmalar gibi bazı uyaranlar, nötrofillerin, temel olarak miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) gibi granül proteinli DNA'dan ve sitoplazmik ve hücre iskeleti proteinlerinden oluşan ağ benzeri yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) serbest bırakmasına neden olur. Son zamanlarda NET'lere olan ilgi artmış olsa da, klinik ortamlarda NET'leri ölçmek için hassas, güvenilir bir test yöntemi mevcut değildir. Bu makalede, NET'lerin spesifik bileşenleri olan ve NET'lerin parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınan dolaşımdaki NET'lerin iki bileşenini, MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi açıklanmaktadır. Test, yakalama antikorları ve DNA'ya özgü bir tespit antikoru olarak MPO veya NE için spesifik monoklonal antikorlar kullanır. MPO veya NE, MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında yakalama antikorunun bir bölgesine bağlanır. Bu tahlil, iyi doğrusallık ve yüksek tahliller arası ve tahlil içi hassasiyet gösterir. Eşlik eden akut solunum sıkıntısı sendromu olan COVID-19'lu 16 hastada kullandık ve MPO-DNA ve NE-DNA'nın plazma konsantrasyonlarının sağlıklı kontrollerden elde edilen plazmadan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk. Bu tespit testi, insan plazması ve kültür süpernatantlarındaki NET'lerin özelliklerini araştırmak için güvenilir, oldukça hassas ve kullanışlı bir yöntemdir.

Introduction

Bu makale, DNA 1,2 ile miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) komplekslerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak biyolojik sıvılarda nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunu ölçmek için bir yöntemi özetlemektedir. NET'ler, nötrofil granüllerinden kaynaklanan antimikrobiyal proteazlarla süslenmiş bir DNA omurgasından oluşur 3,4. Hem MPO-DNA hem de NE-DNA kompleksleri, NET'lerin önemli ve spesifik bileşenleridir ve NET'lerinparçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınır 3,4.

Antimikrobiyal savunmadaki önemli fizyolojik rollerinin3 yanı sıra, NET'lerin trombogenezin6 teşviki ve sepsisinkötüleşmesi 7 dahil olmak üzere çeşitli patolojik etkileri de vardır 4,5. Bu doğrultuda, NET'ler son zamanlarda dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, NET'lerin in vivo kantitifikasyonu, hassas, güvenilir bir kantitatif test yönteminin olmaması nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır.

NET'lerin floresan mikroskobu8,9 ve akış sitometrisi 10 ile doğrudan ölçümü ve dolaşımdaki hücresiz DNA, nükleozomlar ve sitrüline histon H3'ün dolaylı ölçümü dahil olmak üzere birkaç yöntem mevcuttur, ancak her yöntemin kendi avantajları ve sınırlamalarıvardır 11. İmmünofloresan mikroskobik yöntem NET'lere özgü olmasına ve NET oluşumunun lokalizasyonunu ve derecesini net olarak göstermesine rağmen, örnekler biyopsi dokusu ve salgılanan materyallerle sınırlıdır. Üstelik bu yöntemin yetenekli araştırmacılar tarafından yapılması gerekiyor ve sonuçların elde edilmesi uzun zaman alıyor. NET ile ilgili bileşenlerin dolaşımdaki seviyelerinin akış sitometrisi ile ölçülmesi kolaydır ve hızlı bir şekilde sonuç verir; ancak, yöntem NET12'ye özgü değildir.

Biz13 ve diğerleri1,2, yakalama antikorları olarak MPO veya NE için spesifik antikorlar ve DNA'ya özgü bir tespit antikoru kullanan modifiye edilmiş bir ELISA tekniği ile insan plazmasında dolaşımdaki NET bileşenlerini, MPO-konjuge veya NE-konjuge DNA'yı ölçmek için oldukça hassas ve güvenilir bir test geliştirdik. Bu test, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) stimülasyonuna yanıt olarak aktive edilmiş nötrofiller tarafından salınan hücre kültürü süpernatantlarındaki NET bileşenlerini tanımlamak için ex vivo olarak da kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütülmüş ve Aichi Tıp Üniversitesi kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır (2017-H341, 2019-H137). Her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Reaktif hazırlama

NOT: Sandviç ELISA testini gerçekleştirmek için reaktifler aşağıda açıklandığı gibi hazırlanır.

  1. Kaplama tamponu:
    1. 0,1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponu yapmak için 10,6 g susuz sodyum karbonat (moleküler ağırlık, 106 g/mol) ve 8,4 g sodyum bikarbonat (moleküler ağırlık, 84 g/mol) tartın.
    2. Bir beherde yaklaşık 900 mL damıtılmış suya ekleyin.
    3. Gerekli miktarda seyreltilmiş hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ekleyerek tamponun pH'ını 9.6'ya ayarlayın.
    4. pH'ı bir pH metre ile kontrol edin.
    5. Ardından, toplam 1.000 mL hacim elde etmek için gerekli hacimde damıtılmış su ekleyin.
    6. Bu 0.1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponunu buzdolabında 4 °C'de saklayın.
  2. Engelleme tamponu:
    1. 137 mmol/L NaCl, 8.1 mmol/LNa2HPO4, 2.68 mmol/L KCl ve 1.47 mol/L KH2PO 4 (pH 7.4) ve 1.47 mol/L KH'den oluşan 70 mL fosfat tamponlu saline (PBS) yaklaşık 250 μL %20 sodyum azid ve 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
    2. Toplam 100 mL hacim elde etmek için damıtılmış su ekleyin. Sığır serum albümini ve sodyum azidin nihai konsantrasyonları sırasıyla% 1 ve% 0.05'tir. 10 dakika bekleyin, ardından çözelti kullanıma hazırdır.
  3. Yıkama çözeltisi: Damıtılmış suda% 0.5 t-oktilfenoksipolietoksietanol, polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton X-100) hazırlayın.
    1. % 100 Triton X-100'ü% 10'a damıtılmış suyla seyreltin ve% 10'luk çözeltiyi kullanmadan önce 1 gün bekletin.
    2. Ardından, %0,5'lik bir konsantrasyon elde etmek için %10'luk Triton X-100 çözeltisini 20 kat damıtılmış suyla yeniden seyreltin.
  4. Antikor dilüsyon:
    1. Yakalama antikorunu (anti-MPO antikoru [1 mg / mL] veya anti-NE antikoru [1 mg / mL]) testin 1. gününde kullanmadan önce kaplama tamponunda (pH 9.6) 1: 2.000'e seyreltin (aşağıya bakınız) ve tespit antikoru (peroksidaz-konjuge anti-DNA antikoru) testin 3. gününde kullanmadan önce PBS ile 1:40'a kadar (aşağıya bakınız).
      NOT: Ön deney için, izo-tipi antikorları (IgG tavşanı [5 mg / mL] ve IgG1 fare klonu Ci4 [0.5 mg / mL]) kaplama tamponunda 1: 10.000 ve 1: 1.000'e seyreltin (pH 9.6).
  5. ABTS substrat çözeltisi: Numune sayısına bağlı olarak, bir, iki veya üç 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) tabletini 5 mL, 10 mL veya 15 mL ABTS tamponunda çözün (sodyum perborat, sitrik asit ve disodyum hidrojen fosfat içerir); numune başına 100 μL gereklidir. Hazırlanan çözeltiyi ışıktan koruyarak 2-8 ° C'de saklayın. Çözelti 3 aya kadar stabildir.

2. Numune toplama ve saklama

  1. Plazma izolasyonu:
    1. 22 G'lik bir şırınga ile damar delinerek bir lityum heparin kan alma tüpüne 4 mL periferik kan örneği toplayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin.
    2. Süpernatanı 2 mL'lik güvenli kilitli bir numune tüpüne aktarın.
    3. Kalıntı hücreleri çıkarmak için süpernatanı 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı, tüpün altındaki peleti bozmadan yeni bir güvenli kilitli numune tüpüne toplayın.
    5. Elde edilen plazmayı daha fazla kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
      NOT: Bu tahlil ile yüksek verimli sonuçlar elde etmek için kaliteli numuneler gereklidir. Plazma örnekleri kullanılıyorsa, kalan hücreleri çıkarmak için ikinci bir santrifüjleme gerçekleştirin. Numunelerin tekrar tekrar çözülmesinden kaçının. Antikoagülan olarak heparin kullanın, çünkü EDTA DNaz aktivitesini etkiler.
  2. Polimorfonükleer nötrofillerin izolasyonu
    1. Periferik kan örneklerini 22 G'lik bir şırınga ile damar delinerek bir lityum heparin kan alma tüpüne toplayın.
    2. 6 mL kanı 6 mL tek adımlı polimorflar üzerine katmanlayın ve tüpleri oda sıcaklığında (RT) 45 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
    3. Nötrofiller içeren üçüncü buffy coat tabakasını hasat edin ve RT'de 10 dakika boyunca fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta 400 x g'da üç kez yıkayın.
    4. Nötrofilleri, %6 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile desteklenmiş 2 mM L-glutamin içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta yeniden süspanse edin ve mikroskop alanındaki hücreleri bir hemositometre ile sayın.
      NOT: Bu yöntem, tripan mavisi boya hariç tutma ile değerlendirildiği gibi, %95'ten fazla canlılık ile %96 ila %98 saflık sağlar.
  3. Polimorfonükleer nötrofillerin ve NETosis'in in vitro aktivasyonu
    1. Taze izole edilmiş polimorfonükleer nötrofilleri, %6 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 2 mM L-glutamin içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta 1 ×10 5 hücre/mL'ye seyreltin ve 35 mm'lik kültür kaplarında tohumlayın.
    2. NET'leri indüklemek için, polimorfonükleer nötrofilleri 25 nM PMA ile 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2/95% havada uyarın.
    3. 4 saatlik inkübasyondan sonra, RT'de 15 dakika boyunca doğrudan kültür kaplarına 0.6 μg/mL DNaz I ekleyerek NET'leri kısmen sindirin ve 5 mM EDTA ekleyerek DNaz I aktivitesini durdurun.
    4. Sentezlenen NET'leri içeren ortamı toplayın ve hücre kalıntılarını gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
    5. Süpernatanları dört sağlıklı kontrolden alın, karıştırın ve kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
      NOT: Dört sağlıklı kontrolden elde edilen DNaz sindirilmiş PMA ile uyarılmış nötrofiller, NET standardı 1,14,15 olarak kullanılır. PBS ile seri olarak seyreltilmiş bir NET standardından bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve seyreltilmemiş bir NET standardından elde edilen optik yoğunluk (OD) değerlerini %100 NET olarak atayın.

3. Tahlil yöntemi

NOT: Testi gerçekleştirme adımları aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

  1. 1. Gün
    1. Boş kuyucuk da dahil olmak üzere plakanın her bir oyuğuna toplam 100 μL seyreltilmiş anti-MPO veya 0.05 μg antikor içeren anti-NE antikoru uygulayın.
      NOT: Kaplama tamponu herhangi bir deterjan içermemelidir, aksi takdirde antikorlar her bir oyuğun duvarlarına eşit ve düzgün bir şekilde bağlanmayabilir. Kanca etkisini önlemek için, kaplama proteini konsantrasyonu 20 μg/mL'den fazla olmamalıdır, çünkü bu seviyenin üzerindeki konsantrasyonlar mikrotitre plakasındaki mevcut bölgelerin çoğunu doyuracaktır. Protein kaplama çözeltilerinin tipik konsantrasyon aralığı 2-10 μg/mL'dir. Ön deney için, MPO'ya karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine kaplama için seyreltilmiş izo-tip kontrol antikoru IgG tavşanı kullanın. NE'ye karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine kaplama için seyreltilmiş izo tipi kontrol antikoru IgG1 faresi kullanın.
    2. Numunenin buharlaşmasını önlemek için plakayı yapışkan plastik bir kapakla örtün ve yakalama antikorlarının bağlanmasına izin vermek için gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün
    1. Seyreltilmiş antikor çözeltisini kuyucuklardan atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama çözeltisi pipetleyin ve bu yıkama prosedürünü üç ila dört kez tekrarlayın.
    2. Plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak fazla PBS'yi çıkarın.
    3. ELISA plakasının her bir kuyusunu 200 μL bloke edici tampon ile bloke edin.
    4. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla sıkıca örtün ve kuyucukları tıkamak için RT'de 1.5-2 saat inkübe edin.
    5. Engelleme solüsyonunu kuyucuklardan tamamen atın ve ardından kuyucuk başına 300 μL yıkama solüsyonu pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.
    6. Plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak fazla PBS'yi çıkarın.
    7. Boş kuyu hariç her bir oyuğa toplam 25 μL plazma veya ortam uygulayın ve son hacmi 100 μL yapmak için seyreltici olarak 75 μL PBS ekleyin; boş kuyuya 100 μL PBS ekleyin.
    8. Ardından, plakayı 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri RT'de 10 saniye karıştırın.
    9. Boş kuyucuk da dahil olmak üzere her bir oyuğa 2 μL 100 kat seyreltilmiş DNaz I (0.03 mg/mL) uygulayın (reaksiyon karışımındaki DNaz I'in nihai konsantrasyonu: 0.6 μg/mL).
    10. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla kapatın ve plakayı 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri RT'de 10 saniye boyunca iyice karıştırın.
      NOT: DNA sindirimi için optimum koşulları değerlendirmek için, testi geliştirirken, COVID-19'lu hastalardan MPO ile ilişkili DNA içeren numuneleri RT'de 0-0.9 μg/mL DNaz I ile 15 dakika inkübe ettik ve MPO için spesifik yakalama antikoru veya türle uyumlu bir izo tipi kontrol antikoru ile kaplanmış plakalar kullandık.
    11. Numuneleri RT'de 15 dakika inkübe edin.
    12. Yapışkan plastik kapağı çıkarın ve DNaz reaksiyonunu durdurmak için her bir oyuğa 1 μL 0,5 M EDTA uygulayın.
    13. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla tekrar kapatın ve 250 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirerek RT'de 15 saniye çalkalayın.
    14. Daha sonra, NET'lerin protein bileşenlerinin yakalama antikorlarına bağlanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  3. 3. Gün
    1. Yapışkan plastik kapağı çıkarın ve çözeltiyi kuyulardan atın.
    2. Çözeltiyi kuyucuklardan tamamen atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama solüsyonu pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.
    3. Her bir oyuğa toplam 100 μL seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DNA tespit antikoru uygulayın.
    4. Plakayı yapışkan plastik bir kapakla sıkıca kapatın ve RT'de 1,5 saat inkübe edin.
    5. Çözeltiyi kuyulardan tamamen atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama çözeltisi pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.
    6. Kalan çözeltiyi dikkatlice çıkarın.
    7. Her bir oyuğa toplam 100 μL ABTS substrat çözeltisi uygulayın ve plakayı yapışkan plastik bir örtü ile örtün.
    8. Plakayı karanlıkta RT'de 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 20-30 dakika inkübe edin.
      NOT: İstenen OD okumaları elde edilene kadar plakayı 5 dakikalık aralıklarla izleyin.
    9. Reaksiyonu durdurmak için toplam 50 μL 2 M sülfürik asit ekleyin.
    10. Kuyucukların sıvı içeriğini, plakanın kenarına dikkatlice vurarak karıştırın.
    11. Mikroplaka okuyucuyu açın ve bilgisayara bağlayın.
    12. Bilgisayardaki yazılım uygulamasını açın.
    13. Durum çubuğundan yeni bir deneme oluşturun ve adlandırın.
    14. Plaka okuması için aşağıdaki tüm parametreleri ayarlayın: Okuma tipi, Absorbans; Okuma modu, Uç nokta; Dalga boyları, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Otomatik karıştırma ve Boşaltma öncesi, Kapalı; Ön okuma plakası, Kapalı; Otomatik kalibrasyon, Açık; Şeritler, Tüm plakayı okuyun; Kolon dalga boyu önceliği, Kolon önceliği; Taşıma hızı, Normal; ve Otomatik okuma, Kapalı.
    15. Ardından, numuneleri içeren 96 oyuklu plakayı çekmeceye koyun ve kapatın.
    16. Son olarak, plakanın hemen okunması için Oku düğmesini seçin.
    17. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun absorbansını 405 nm dalga boyunda okuyun (bu aşamada referans olarak 490 nm dalga boyu kullanın).
    18. Bilinmeyen tüm numunelerden tek başına tahlil ortamının absorbans değerinin otomatik olarak çıkarılmasını sağlayın ve verileri kaydedin.
      NOT:Örnek 1,14,15'teki NET'in nispi konsantrasyonunu hesaplamak için seri olarak seyreltilmiş NET standardından elde edilen standart bir eğri kullanın. Burada, nihai sonuçlar "MPO- veya NE-DNA kompleksleri (NET standardının %'si)" olarak sunulur. Algılama limiti (LOD), standart sapmadan (SD) ve kalibrasyon eğrisinin eğiminden (S) aşağıdaki gibi hesaplandı: LOD = 3.3(SD/S).

4. İstatistik

  1. Uygun istatistiksel analiz yazılımını kullanarak tüm istatistiksel analizleri gerçekleştirin. Burada SigmaPlot v14.5 kullanıldı. Yüzdeler ve sürekli değişkenler, parametrelerin çoğunun çarpık dağılımı nedeniyle çeyrekler arası aralığa sahip medyan olarak gösterilir.
  2. Wilcoxon sıra toplamı testini kullanarak COVID-19 hastaları ve sağlıklı kontroller arasındaki plazma MPO-DNA ve NE-DNA düzeylerini karşılaştırın. Optik yoğunluk ile NET standardının yüzdesi arasındaki ilişkiyi keşfetmek için korelasyon analizini kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntem, MPO ile ilişkili ve NE ile ilişkili DNA'yı ölçmek için anti-MPO, anti-NE ve anti-DNA monoklonal antikorları olan bir sandviç ELISA kullandı (Şekil 1). Bu yöntemde, bir mikrotitre plakasının kuyucukları, DNA ile ilişkili MPO ve DNA ile ilişkili NE'nin yanı sıra DNA ile ilişkili olmayan MPO ve NE'yi yakalamak için MPO'ya özgü veya NE'ye özgü bir monoklonal antikor ile kaplandı. Test içi değişkenlik katsayısını (CV) hesaplamak için, COVID-19'lu hastalardan ve sağlıklı kontrollerden toplanan 30 örnek için aynı plaka içinde mükerrer ölçümler yapıldı ve mükerrer ölçümlerin ortalaması olarak %CV hesaplandı; tahliller arası CV'yi (yani plakadan tabağa tutarlılığı) hesaplamak için, COVID-19 hastalarından ve sağlıklı kontrollerden iki tip numune 10 farklı plaka üzerinde dörtlü olarak ölçüldü; bu testin özgüllüğünü göstermek için, MPO ve NE'ye karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine izo-tipi kontrol antikorları ile kaplanmış plakalar kullanılarak çeşitli konsantrasyonlarda MPO-DNA ve NE-DNA kompleksleri test edildi; ve testin duyarlılığını ve doğrusallığını hesaplamak için, izole insan nötrofillerinin PMA ve hafif DNaz sindirimi ile uyarılmasıyla yapılan seri olarak seyreltilmiş bir NET standardı test edildi ve korelasyon katsayısı ve tespit limiti (LOD) hesaplandı.

Seri olarak seyreltilmiş bir NET standardından alınan MPO-DNA ve NE-DNA için kalibrasyon eğrileri Şekil 2'de gösterilmektedir. MPO-DNA ve NE-DNA için güvenilir standart eğriler (sırasıylaR2 = 0.958 ve 0.963), absorbans değerleri sırasıyla 0.93 ve 0.90 konsantrasyonlarını aşmadığında elde edilir. SD'den hesaplanan LOD değerleri ve kalibrasyon eğrisinin eğimi MPO-DNA ve NE-DNA (%NET standardı) için sırasıyla %0.132 ve %0.126 idi.

En yüksek OD 0.6 μg/mL DNaz I uygulandığında elde edildi (Şekil 3). Bu nedenle, DNA sindirimi, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca DNaz I'in 0.6 μg/mL reaksiyon karışımının eklenmesiyle sınırlıydı. Plakalar MPO'ya karşı spesifik monoklonal antikor yerine izo-tipi kontrol antikoru ile kaplandığında, DNaz I'in çeşitli konsantrasyonlarında çok düşük OD değerleri (<0.09 absorbans birimi [AU]) tespit edildi.

MPO-DNA ve NE-DNA için test içi değişkenlik katsayısını (CV) hesaplamak için, COVID-19 hastalarından ve sağlıklı kontrollerden alınan 30 örnekte aynı plakada mükerrer ölçümler yapıldı; %CV, yinelenen ortalama kullanılarak hesaplandı. MPO-DNA ve NE-DNA için test içi CV'ler sağlıklı kontrollerde sırasıyla 1.871 ve 0.987 ve COVID-19 hastalarında sırasıyla 2.532 ve 2.010 idi (Tablo 1). MPO-DNA ve NE-DNA'nın ortalama tahlil içi CV'leri sırasıyla 2.202 ± 0.467 ve 1.497 ± 0.723 idi (ortalama ± SD) (Tablo 1).

MPO-DNA ve NE-DNA için tahliller arası CV'yi hesaplamak için, COVID-19 hastalarından ve sağlıklı kontrollerden toplanan iki tip numune, plakadan tabağa tutarlılığı izlemek için 10 farklı plaka üzerinde dörtlü olarak ölçüldü. MPO-DNA ve NE-DNA'nın ortalama tahliller arası CV'leri sırasıyla 6.524 ± 2.672 ve 4.389 ± 0.923 idi (ortalama ± SD) (Tablo 2).

Yakalama antikorlarının MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerine özgüllüğünü değerlendirmek için, MPO ve NE'ye karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine izo-tipi kontrol antikorları ile kaplanmış plakalar kullanarak çeşitli konsantrasyonlarda MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerini test ettik. Tablo 3 , izo-tipi kontrol antikorlarının çeşitli konsantrasyonlarda (0.035 AU ila 0.078 AU ve -0.007 AU ila 0.096 AU) MPO-DNA ve NE-DNA kompleksleri ile çok az reaksiyona girdiğini göstermektedir. sırasıyla).

DNaz ile sindirilmiş PMA ile uyarılmış nötrofillerin süpernatantındaki MPO-DNA ve NE-DNA seviyeleri %100 NET standardı olarak tanımlandı ve plazma örneği verileri %NET-standardı olarak ifade edildi. COVID-19 hastalarından alınan plazmada MPO-DNA (%net-standart) düzeyleri (n = 16; %29.1 [IQR, 25.8, 41.5]) sağlıklı kontrollerden alınan plazmaya göre anlamlı olarak daha yüksekti (n = 10; %13.4 [IQR, 12.4, 14.8]) ve NE-DNA (%NET-standardı) seviyeleri (%46.4 [IQR, 32.7, 53.7] vs. %12.1 [IQR, 9.9, 14.7], sırasıyla, P < 0.01; Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1: Örneklerde miyeloperoksidaz-DNA veya nötrofil elastaz-DNA'yı ölçmek için sandviç enzime bağlı immünosorbent test yönteminin temel aşamaları. (A) Kuyucuklar bir anti-miyeloperoksidaz (MPO) veya anti-nötrofil elastaz (NE) yakalama antikoru ile kaplanmıştır. (B) Kalan protein bağlanma bölgeleri, bloke edici ajanlar tarafından bloke edilir. (C) NE-konjuge ve MPO-konjuge DNA içeren numuneler eklenir. (D) Sınırlı DNaz sindirimi gerçekleştirilir ve numune, yakalama antikoru ile bağlanmak için kuyucuklarda inkübe edilir. (E) İkincil bir peroksidaz etiketli anti-DNA antikoru eklenir. (F) Bağlanmamış sekonder peroksidaz etiketli anti-DNA antikoru çıkarılır. (G) Substrat 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) eklenir ve renk gelişimi izlenir. Kısaltmalar: ABTS = 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit); MPO = miyeloperoksidaz; NE = nötrofil elastaz Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Yoğunluk değerleri ile nötrofil hücre dışı tuzak standardının çeşitli dilüsyonları arasındaki ilişkilerin doğrusallığı. DNaz ile sindirilmiş forbol 12-miristat 13-asetat ile uyarılan nötrofillerin süpernatantı seri olarak seyreltildi ve bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için miyeloperoksidaz-DNA ve nötrofil elastaz-DNA seviyeleri test edildi. Seyreltilmemiş nötrofil hücre dışı tuzak standardından (NET-standardı) elde edilen absorbans birimleri (AU) %100 NET olarak atandı ve yoğunluk değerinin %NET-standardına karşı 405 nm'de çizilmesi doğrusal bir ilişki ortaya çıkardı. Kısaltmalar: MPO = miyeloperoksidaz; NE = nötrofil elastaz; NET = nötrofil hücre dışı tuzak Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Nötrofil hücre dışı tuzak-DNA sindiriminde DNaz I'in doz yanıtı. Örnek, miyeloperoksidaz kaplı kuyucuklara yerleştirildi. Daha sonra DNaz I (0 μg/mL, 0.3 μg/mL, 0.6 μg/mL veya 0.9 μg/mL) ilave edildi. 15 dakikalık sindirimden sonra, enzim aktivitesi durduruldu ve sandviç enzime bağlı immünosorbent testinin kalan adımları buna göre gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilir. N = 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: COVID-19 hastalarında miyeloperoksidaz-DNA ve nötrofil elastaz-DNA komplekslerinin plazma seviyeleri. Veriler, nötrofil hücre dışı tuzak standardı (NET standardı) içeriğinin yüzdeleri olarak ifade edilir ve medyanlar ve çeyrekler arası aralıklar olarak sunulur. COVID-19 hastaları, n = 16; sağlıklı kontroller, n = 10. ** P < 0.01 ve sağlıklı kontroller. Kısaltmalar: HC = sağlıklı kontroller; NET = nötrofil hücre dışı tuzak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Test içi değişkenlik katsayısı. Bireysel değişkenlik katsayılarını izlemek ve böylece tahlil içi değişkenlik katsayısını belirlemek için otuz numune iki kez ölçüldü. Kısaltmalar: AU = absorbans birimleri; CV = değişkenlik katsayıları Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Tahliller arası değişkenlik katsayısı. Numuneler, plakadan plakaya varyasyonu izlemek ve böylece tahliller arası değişkenlik katsayısını belirlemek için 10 farklı plaka üzerinde dörtlü olarak ölçüldü. Kısaltmalar: AU = absorbans birimleri; CV = değişkenlik katsayısı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Yakalama antikorları için özgüllük testi. Plakalar, MPO-DNA ve NE-DNA kompleksleri için yakalama antikorlarının özgüllüğünü değerlendirmek için anti-miyeloperoksidaz (MPO) ve anti-nötrofil elastaz (NE) için izo-tipi kontrol antikorları ile kaplandı. Kısaltmalar: AU = absorbans birimleri; MPO = miyeloperoksidaz; NE = nötrofil elastaz Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında MPO veya NE'nin yakalama antikorunun bir bölgesine bağlandığı bir sandviç ELISA yöntemini tanımladık. Yıkandıktan sonra, numunelerin peroksidaz ile ilişkili bir anti-DNA monoklonal antikoru ile inkübe edilmesiyle "sandviç" tamamlanır. Bağlanmamış sekonder antikorun çıkarılmasından sonra, bağlı peroksidaz konjugatı, 405 nm'de spektrofotometrik olarak okunabilen çözünür bir son ürün veren bir kromojenik ABTS peroksidaz substratının eklenmesiyle tespit edilir. İyi doğrusallık ve yüksek tahliller arası ve tahlil içi hassasiyet, bu yazıda ve diğerleri 1,2'de açıklanan ELISA testinin klinik uygulama için güvenilir ve uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, DNaz ile muamele edilen PMA ile uyarılmış nötrofillerin süpernatantı NET standardı için maksimum bir sinyal olarak atandığında, bu ELISA testi yarı kantitatif bir yöntem olarak kullanılabilir 1,14,15.

NET'lerin uzun kromatin iplikleri MPO ve NE proteinleri ile süslenmiştir. Yakalama antikoru ile MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri arasındaki bağlanmayı arttırmak için, iplikler DNaz enzimi ile sınırlı DNA sindirimi ile daha kısa parçalara bölünür; çok yüksek bir DNaz konsantrasyonunun eklenmesi, DNA'nın aşırı sindirimine ve dolayısıyla absorbansta bir azalmaya yol açabilir. Bir ön deneyin sonuçları (bkz. Şekil 3), NET'lerden elde edilen kalıntıları gevşetmek için uygun miktarda DNaz ilavesinin gerekli olduğunu göstermiştir. Spesifik yakalama antikorları yerine izo-tipi kontrol antikorlarının kullanıldığı deneyler, bu tahlilde kullanılan yakalama antikorlarının MPO-DNA ve NE-DNA kompleksleri için spesifik olduğunu gösterdi.

NET oluşumunun erken aşaması, yoğunlaştırılmış kromatin ve plazma zarınınyoğunluğunun korunması ile karakterize edilir 9,16,17. Yoğunlaştırılmış çekirdeğe sahip nötrofiller, NET oluşumu geçiren nötrofiller olarak tanımlanmıştır ve akış sitometrisi10 ile ölçülebilir. Akış sitometrisi, hücrelerden çok sayıda görüntüyü kısa sürede analiz edebilse de, hücre zarı rüptürü ve kromatin ekstrüzyonundan sonra NET oluşumunun sonraki aşamalarını değerlendirmek için kullanılamaz. NET'e özgü belirteçler olduğu bilinen sitrüline histonlar H3, western blotlama18 ve ELISA19 ile tespit edilebilir; ancak, bu yöntemler sadece PAD4 ile ilişkili NET oluşumuna özgüdür ve PAD4'ten bağımsız NET'leri değerlendirmek için kullanılamaz20.

COVID-19 hastalarında serum NET kalıntılarının seviyelerinin sağlıklı kontrollere göre daha yüksek olduğu bulgusu önceki raporlarlauyumludur 21,22. Bu bulgu, NET oluşumu da dahil olmak üzere nötrofil aktivasyonunun COVID-19 patogenezinde önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Bu tahlilin bir sınırlaması vardır. Son raporlar, sırasıyla MPO ve NE'yi kodlayan MPO ve ELANE dahil olmak üzere bağışıklıkla ilişkili genlerin, kontrolsüz enflamatuar koşullar altında yüksek oranda eksprese edildiğinigöstermiştir 23 ve hastalık şiddeti ve mortalite24 ile pozitif korelasyon göstermektedir. MPO ve NE, bu enzimatik aktivitelerden bağımsız olarak NET'lerin oluşumunda rol oynadığından15, nötrofillerdeki NE ve MPO'nun artan protein seviyeleri bu testin sonuçlarını etkileyebilir.

Bu sandviç ELISA yönteminin, NET oluşumuna özgü NE ve MPO dahil olmak üzere granül proteinleri ile hücre dışı DNA'yı doğrudan ölçtüğü sonucuna vardık. Bu tespit testi, insan örneklerinde ve kültür süpernatantlarında NET'lerin özelliklerini araştırmak için güvenilir, oldukça hassas ve kullanışlı bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu çalışma sırasında üretilen ve/veya analiz edilen tüm veriler bu yayınlanan makalede yer almaktadır. Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, makalenin gözden geçirilmesinde yardımcı olduğu için Dr. Huq Muhammad Aminul'a teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 195
Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter