Summary
本协议描述了在患者来源的卵巢癌类器官中评估DNA损伤修复蛋白的方法。这里包括全面的电镀和染色方法，以及详细、客观的定量程序。
Abstract
免疫荧光是使用最广泛的技术之一，用于以高灵敏度和特异性可视化靶抗原，从而可以准确鉴定和定位蛋白质、聚糖和小分子。虽然该技术在二维（2D）细胞培养中已经成熟，但对其在三维（3D）细胞模型中的使用知之甚少。卵巢癌类器官是3D肿瘤模型，概括了肿瘤细胞克隆异质性，肿瘤微环境以及细胞-细胞和细胞-基质相互作用。因此，它们在评估药物敏感性和功能生物标志物方面优于细胞系。因此，在原发性卵巢癌类器官上利用免疫荧光的能力对于理解这种癌症的生物学非常有益。目前的研究描述了免疫荧光技术，以检测高级别浆液性患者来源的卵巢癌类器官（PDO）中的DNA损伤修复蛋白。将PDO暴露于电离辐射后，对完整的类器官进行免疫荧光以评估核蛋白作为病灶。在共聚焦显微镜上使用z-stack成像收集图像，并使用自动病灶计数软件进行分析。所描述的方法允许分析DNA损伤修复蛋白的时间和特殊募集，以及这些蛋白质与细胞周期标记物的共定位。
Introduction
卵巢癌是妇科恶性肿瘤导致死亡的主要原因。大多数患者使用卡铂等 DNA 损伤药物治疗，同源重组修复 （HRR） 缺陷肿瘤患者可给予聚 （ADP-核糖） 聚合酶 （PARP） 抑制剂1，2。然而，大多数患者对这些疗法产生耐药性，并在诊断后 5 年内死亡。DNA损伤反应（DDR）失调与卵巢癌的发展以及化疗和PARP抑制剂耐药有关3。因此，研究DDR对于了解卵巢癌的病理生理学，潜在的生物标志物和新的靶向疗法至关重要。
目前评估DDR的方法利用免疫荧光（IF），因为这可以准确鉴定和定位DNA损伤蛋白和核苷酸类似物。一旦DNA中出现双链断裂（DSB），组蛋白H2AX就会迅速磷酸化，形成DNA损伤修复蛋白聚集的焦点4。这种磷酸化可以很容易地利用IF识别;事实上，ɣ-H2AX测定通常用于确认DSB5，6，7，8，9的诱导。DNA损伤的增加与DNA损伤剂10，11，12的铂敏感性和功效有关，并且ɣ-H2AX已被提议作为与其他癌症治疗中的化疗反应相关的生物标志物13。在DSB上，精通HRR的细胞执行一系列事件，导致BRCA1和BRCA2招募RAD51以取代复制蛋白A（RPA）并与DNA结合。HRR修复使用DNA模板来忠实地修复DSB。然而，当肿瘤缺乏HRR时，它们依赖于替代修复途径，例如非同源末端连接（NHEJ）。众所周知，NHEJ容易出错，并且对细胞产生高突变负担，细胞使用53BP1作为正调节因子14。这些DNA损伤蛋白都可以使用IF准确地识别为病灶。除了蛋白质染色外，IF还可用于研究叉保护和单链DNA间隙形成。具有稳定叉的能力与铂反应相关，最近，间隙测定已显示出预测对PARP抑制剂6，15，16，17的反应的潜力。因此，在引入基因组后对核苷酸类似物进行染色是研究DDR的另一种方法。
迄今为止，卵巢癌中DDR的评估主要局限于同质2D细胞系，这些细胞系不能概括体内肿瘤的克隆异质性，微环境或结构18，19。最近的研究表明，类器官在研究复杂的生物过程（如DDR机制）方面优于2D细胞系6。本方法评估PDO中的RAD51，ɣ-H2AX，53BP1，RPA和geminin。这些方法评估完整的类器官，并允许在更类似于体内肿瘤微环境中研究DDR机制。结合共聚焦显微镜和自动病灶计数，这种方法可以帮助了解卵巢癌的DDR途径并为患者制定个性化的治疗计划。
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Protocol
肿瘤组织和腹水是在获得患者同意后获得的，作为圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会 （IRB） 批准的妇科肿瘤学生物储存库的一部分。如果患者患有晚期高级别浆液性卵巢癌（HGSOC），则纳入患者。除非另有说明，否则所有程序均在室温下在工作台上进行。所有试剂均在室温下制备（除非另有说明）并储存在4°C。
1. 类器官生成
- 按照先前发表的报告20 生成类器官。
2. 类器官的电镀和辐照
- 在培养中使用类器官，通过手动操作移液器吸头将类器官的片片从培养皿中取出。将类器官收集在 15 mL 锥形管中。
- 将锥形管在4°C下以1，650× g 离心5分钟。 使用移液管小心地吸出上清液。
- 向沉淀中加入 1，000 μL 无动物源性重组酶（参见 材料表）。混合溶液并在37°C孵育15分钟。
- 将溶液在4°C下以1，650× g 离心5分钟。 使用移液管，小心地吸出上清液。
- 离心和抽吸后，将沉淀重悬于 1，000 μL 磷酸盐缓冲盐水中。
- 将 10 μL 溶液转移到 1.5 mL 微量离心管中，并与 10 μL 台盼蓝混合。
- 取 10 μL 台盼蓝细胞溶液放入细胞计数室载玻片中，并将其插入细胞计数机（参见 材料表）。
- 将每 20 μL 基底膜提取物 （BME） 中的 40，000 个细胞板到 8 孔玻璃室载玻片中（参见 材料表）。这样可以将类器官维持3-5天，以使细胞形成类器官并生长到合适的大小。
- 为了诱导双链DNA断裂，用10格雷（Gy）的ɣ辐照辐射电镀的类器官（辐照器的详细信息参见 材料表 ）。
注意：这最多可能需要 5-10 分钟。 - 将类器官在其培养基中的类器官在37°C和5%CO2 的加湿培养箱中孵育4小时。
3. 免疫荧光染色
注意：体积是指8孔室载玻片的每孔量（~300μL）。
- 在类器官的照射和孵育后，小心地用移液管吸出培养基，以免破坏3D基质。用 300 μL PBS 洗涤。
- 将类器官固定在 300 μL 2% 多聚甲醛 （PFA） 中 10 分钟。
注意：不要放置太久，因为BME会解聚并可能被吸走。 - 用 300 μL 染色缓冲液洗涤类器官（参见 材料表）。放在摇床上5分钟。
- 对于透化，轻轻加入 300 μL 透化缓冲液（参见 材料表）并孵育 20 分钟。用 300 μL 染色缓冲液洗涤。放在摇床上5分钟。
- 加入 300 μL 染色缓冲液以阻断透化步骤。放在摇床上30分钟。使用移液管吸出染色缓冲液。
- 加入300μL在染色缓冲液中稀释的一抗（兔抗RAD51，小鼠抗双蛋白，兔抗RPA，小鼠抗ɣH2AX，兔抗双子蛋白，小鼠抗53BP1;参见 材料表）。在4°C孵育16小时。
注意：避免与同一宿主动物共染色。盖上盖子以避免抗体混入相邻孔中。 - 取出一抗溶液。在摇床上用 300 μL 染色缓冲液进行三次洗涤，每次 5 分钟。
- 加入300μL二抗（山羊抗小鼠Alexa fluor 488和山羊抗兔Alexa fluor 647;参见 材料表）溶液稀释在染色缓冲液中，并在黑暗中孵育1小时。
注意：所有后续步骤必须在黑暗中执行。 - 吸出二抗溶液。加入 300 μL 稀释的 DAPI。放在摇床上5分钟。
- 在摇床上用 300 μL 染色缓冲液进行三次洗涤，每次 5 分钟。取出染色缓冲液并使用腔室载玻片随附的去除套件拆下腔室（参见 材料表）。
注意：确保不要向前推得太远，以免破坏 3D 矩阵。 - 使用切断吸头的p200移液器吸头，添加封口剂（参见 材料表），用类器官片覆盖每个孔（例如，每个类器官片20-30 μL）。
- 将盖玻片放在标本上，避免气泡。
- 取透明指甲油并将其涂在盖玻片的侧面以密封载玻片。让它硬化1小时，并将其置于-20°C。
注意：成像后，载玻片可以保存至少6个月，荧光损失最小。
4. 成像
- 使用共聚焦显微镜（见 材料表）在63倍物镜下用浸油采集图像。
注意：如果对核蛋白进行成像，63倍是有利的，但40倍也是可以接受的。 - 使用 DAPI 通过目镜定位类器官。根据所使用的荧光团选择合适的滤光片进行显微镜检查。设置用于捕获 z 堆栈图像的参数。
注意：研究中使用的荧光团是DAPI，488和647。打开405、488和638激光以可视化染色。
注意：推荐的z轴堆栈取决于物镜的分辨能力。 - 调整实时图像：设置焦点、激光强度等。
注意：激光强度越高，样品越有可能光漂白。因此，请选择最佳的激光强度。 - 获取 z 堆栈。
注意：这最多可能需要 5-10 分钟。 - 从 z 堆栈中收集的图像中，每个堆栈至少截取三张图像。
注意：确保在整个堆栈中获取屏幕截图，以便在量化时不会重复细胞核。 - 将每个文件另存为 TIFF 并继续分析（步骤 5）。
5. 分析
注意：使用 JCountPro 按照之前发布的报告21 进行所有图像分析。要获取此软件，请参阅相关出版物。
- 在文件选择选项卡（程序底部）的对象分析面板（程序顶部）下，选择 TIFF 文件。
- 单击“ 添加 ”将所选文件移动到所选文件组。选择 显示。
- 在分割选项卡下，选择 蓝色 作为细胞核的颜色。选择 自动分割 以优化细胞核的阈值。
注意：如果自动分割不能准确识别对象，则用户可以根据图像调整微调和原始调谐或查看用户手册以进一步优化分割。 - 在对象面板下，选择 自动拆分大型 对象并优化原子核的大小。
注意：细胞核的无条件大小通常为 5，000 像素，而条件大小为 1，500 像素。请参阅用户手册以进一步优化对象的大小。 - 选择“ 标识对象 ”以测试参数。
注意：如果这些参数不准确，则可以调整大小和调整以及其他设置。有关进一步优化的说明，请参阅用户手册。 - 调整图像参数后，选择“识别所有图像中的对象”以 识别所有选定图像中的 细胞核。
- 选择 “焦点分析”面板（程序顶部）。
- 在选择文件选项卡（程序底部）下，选择用于对象分析的 TIFF 文件，然后选择 箭头按钮 （>>） 将图像移动到图像文件组。
- 在已移动的图像文件下的目录组中，双击 “手动编辑 ”文件夹，然后选择将 ioc 文件移动到对象集合文件组中。
注意：所有选定的 TIFF 必须具有匹配的 ioc 文件。 - 按 “选择” 将文件移动到所选文件组中。选择程序底部的焦点 计数 选项卡。
- 按照以下步骤优化参数。
- 礼帽设置索引：12。
- 对焦通道：选择焦点的颜色（绿色：ɣ-H2AX;红色：RAD51）。
- H 圆顶设置：圆顶高度 %： 30;阈值 %：28 和 28。
- 形状/大小设置：最小焦点大小，像素：5。 选择 应用形状/大小。最大对焦尺寸（有条件）：32。最小圆度，x100：96。最大焦点，像素：60。
- 噪声滤波器：尺寸 1。
注意：如果确定细胞核是否为Geminin染色阳性，请在第二个通道下选择绿色，在分析下选择强度。
- 要测试参数集，请按顺序选择以下按钮： 礼帽> H 穹顶>焦点计数。
注意：如果这些参数不起作用，则可以调整大小和调整以及其他设置。请参阅用户手册以了解有关如何进一步优化图像的更多信息。 - 针对所选图像优化参数后，选择 自动计数 以计算每个细胞核中每个图像中的焦点。如果需要第二个通道，程序将确定可以使用的强度。
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Representative Results
所提出的方案可以成功地对类器官中的核DNA损伤修复蛋白进行染色、可视化和定量。该技术用于在照射前后对PDO进行染色和评估。PDO暴露于10 Gy的辐射下，并评估以下生物标志物：ɣ-H2AX（图1），DNA损伤的标志物;RAD51（图2），HRR的标志物;53BP1，NHEJ的标志物;RPA，复制压力的标志物（图3）;和 geminin，一种 G2/S 期细胞周期标志物14。10 Gy的剂量是根据先前发表的研究卵巢癌DNA损伤的研究选择的6，22。JCountPro软件用于识别细胞核并使用图示参数13量化细胞核内的病灶数量（图4）。该软件识别细胞核（图4A，B），然后识别核病灶（图4C），并从Geminin阳性细胞中过滤病灶（图4D）。
图1：照射前后PDO中的ɣ-H2AX病灶。 PDO中DAPI和ɣ-H2AX病灶在10倍和63倍插图照射前后的代表性图像。比例尺：10 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图2：照射前后PDO中的RAD51病灶和宝石蛋白。 DAPI、geminin、RAD51 的代表性图像，以及 10x 照射前后 63x 插图的 geminin/RAD51 病灶 PDO 共染色。比例尺：10 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 3：照射前后 PDO 中的 RPA 和 53BP1。 （A）DAPI，RPA的代表性图像;（B） 宝石蛋白，53BP1，以及 10x 与 63x 插图的 geminin/53BP1 病灶共染色。比例尺：10 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 4：JCountPro 软件量化工作流程 。 （A）在对象分析下，选择蓝色通道以识别蓝色对象，原子核，然后通过选择自动分割（红色箭头）自动优化。（B）在自动分割下，物体大小（原子核）适应图像的大小和放大倍率。选择识别对象按钮以测试参数（1），选择识别所有图像中的对象（红色箭头）按钮以识别每个图像的对象（细胞核）。（C）在焦点分析选项卡下，输入图像并设置焦点计数参数：首先，在焦点通道下选择焦点的颜色，绿色;礼帽指数设置为 12;H 圆顶设置设置为圆顶高度百分比为 30，阈值百分比为 28;焦点的形状和大小根据图像大小进行优化，手动参数最大焦点尺寸像素为60，最小圆度x 100为96;最后，应用噪声滤波器。通过应用礼帽、H 圆顶和焦点计数 （1-3） 来测试设置。要量化每个单元格的 ɣ-H2AX 焦点，请按开始（红色箭头）。（D）对于RAD51焦点，设置如图所示应用于ɣ-H2AX焦点，但对焦通道更改为红色;但是，为了鉴定用Geminin染色的细胞核，选择第二个通道为绿色，并将分析更改为强度。通过应用顶帽、H 圆顶和焦点计数 （1-3），然后按开始（红色箭头）量化所有 RAD51 焦点并评估每个图像中每个细胞的绿色强度来测试参数。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
DNA损伤反应在卵巢癌和化疗耐药性的发展和中起着不可或缺的作用。因此，彻底了解DNA修复机制势在必行。在这里，提出了一种研究3D完整类器官中DNA损伤修复蛋白的方法。利用标志性抗体开发了一种可重复、可靠的方案，以评估 DNA 损伤、同源重组、非同源末端连接和复制应激。重要的是，这些方法使用转基因对照进行了验证，证明了这些方法的特异性和敏感性。
该方案中最关键的步骤是类器官的电镀和固定。该方案专门将类器官在2%PFA中孵育10分钟，并在固定过程中密切监测基底膜提取物（BME）。这与类器官中的其他免疫荧光方案不同，后者建议使用4%PFA10-60分钟23，24，25。已经发现，如果BME的片剂在PFA的浓缩量中时间过长，片剂会解聚并被吸入。值得注意的是，特定BME的制造商通常会提供有关固定的建议。另一个重要的讨论点是类器官的电镀。染色过程可能导致部分或全部类器官丢失。因此，电镀时片的汇合度越高，样品成功承受染色步骤的可能性就越高。
该方案的优势包括核抗体染色的验证，对完整的3D类器官进行免疫荧光和成像的能力，以及该方案对任何治疗或目标分子的适应性。
这些实验中使用的抗体使用转基因卵巢癌细胞进行了严格的特异性验证。通过将PDO暴露于增加剂量的辐射中，进一步验证了这些方法的灵敏度。这导致精通HRR的PDO中的ɣ-H2AX，RAD51和RPA病灶增加。最后，客观定量方法有助于该测定的可重复性，并避免手动定量的主观偏差。
探索DDR的传统方法是通过称为细胞系的2D培养条件，但它们不具备维持原始肿瘤的遗传异质性的能力。肿瘤微环境对卵巢癌的肿瘤发生和化疗耐药性至关重要26，27，28，因此，在研究DDR时，这些模型为2D均质细胞培养提供了优势。在研究DDR时，有必要控制细胞周期，以避免无法执行细胞周期特异性的特定类型的DNA修复（即HRR）的错误分类。未来的工作重点是研究由铂类化疗、聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂或羟基脲引起的特定类型的 DNA 损伤。
最后，该协议适用于研究任何可修正为传统免疫荧光的抗原，并且可以适应新型药物治疗的研究。所介绍的方案侧重于DDR蛋白，但通过简单的抗体变化，可以修改该方案以研究其他蛋白质，聚糖和小分子。此外，由于类器官是体外培养的异质3D模型，因此类器官的任何处理都是可能的，包括免疫疗法，抗血管生成疗法，代谢组学疗法和其他难以在同质细胞系中评估的新疗法29，30，31。
该方法的局限性包括使用成分不一致的BME和非特异性染色。由于商业BME是由细胞系生产的，因此每个单元的组成可能会有很大差异。这些差异可能会影响固定和染色，以及类器官的生成。此外，根据样品的不同，BME可能存在非特异性染色，这可能会阻碍目标蛋白。尽管如此，核染色非常具体，并且显示出清晰的核病灶，可以很容易地量化。
总之，提出了评估类器官中DDR蛋白的详细方案。随着技术的进步，预计类器官将能够用于评估这些3D模型中的活细胞DNA损伤修复。此外，作为最有效的培养方法，将建立类器官，并且可以进行更复杂的测定，例如DNA纤维和复制间隙测定32。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Pavel Lobachevsky博士在建立该协议方面的指导。我们还要感谢华盛顿大学圣路易斯医学院妇产科和妇科肿瘤科、华盛顿大学院长学者计划、妇科肿瘤学小组基金会和生殖科学家发展计划对这个项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
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