Summary
Denne protokol beskriver metoder til evaluering af DNA-skadereparationsproteiner i patientafledte ovariecancerorganoider. Inkluderet her er omfattende pletterings- og farvningsmetoder samt detaljerede, objektive kvantificeringsprocedurer.
Abstract
Immunofluorescens er en af de mest anvendte teknikker til at visualisere målantigener med høj følsomhed og specificitet, hvilket muliggør nøjagtig identifikation og lokalisering af proteiner, glycaner og små molekyler. Mens denne teknik er veletableret i todimensionel (2D) cellekultur, er der mindre kendt om dens anvendelse i tredimensionelle (3D) cellemodeller. Ovariecancerorganoider er 3D-tumormodeller, der rekapitulerer tumorcelleklonal heterogenitet, tumormikromiljøet og celle-celle- og cellematrixinteraktioner. Således er de bedre end cellelinjer til evaluering af lægemiddelfølsomhed og funktionelle biomarkører. Derfor er evnen til at udnytte immunfluorescens på primære ovariecancerorganoider yderst gavnlig for forståelsen af biologien af denne kræft. Den aktuelle undersøgelse beskriver teknikken til immunofluorescens til påvisning af DNA-skadereparationsproteiner i højkvalitets serøse patientafledte ovariecancerorganoider (BDO'er). Efter udsættelse af BDO'erne for ioniserende stråling udføres immunofluorescens på intakte organoider for at evaluere nukleare proteiner som foci. Billeder indsamles ved hjælp af z-stack-billeddannelse på konfokal mikroskopi og analyseres ved hjælp af automatiseret foci-tællingssoftware. De beskrevne metoder muliggør analyse af tidsmæssig og speciel rekruttering af DNA-skadereparationsproteiner og colokalisering af disse proteiner med cellecyklusmarkører.
Introduction
Kræft i æggestokkene er den største dødsårsag på grund af gynækologisk malignitet. De fleste patienter behandles med DNA-skadelige lægemidler såsom carboplatin, og dem med homologe rekombinationsreparationstumorer (HRR) kan gives poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hæmmere 1,2. Imidlertid udvikler de fleste patienter resistens over for disse terapier og dør inden for 5 år efter diagnosen. Dysregulering af DNA-skaderesponsen (DDR) har været forbundet med udviklingen af kræft i æggestokkene og både kemoterapi og PARP-hæmmerresistens3. Således er undersøgelse af DDR afgørende for at forstå patofysiologien af kræft i æggestokkene, potentielle biomarkører og nye målrettede terapier.
Nuværende metoder til evaluering af DDR anvender immunofluorescens (IF), da dette muliggør nøjagtig identifikation og lokalisering af DNA-skadeproteiner og nukleotidanaloger. Når der er et dobbeltstrenget brud (DSB) i DNA'et, fosforyleres histonproteinet H2AX hurtigt og danner et fokus, hvor DNA-skadereparationsproteiner samles4. Denne fosforylering kan let identificeres ved hjælp af IF; faktisk er ɣ-H2AX-analysen almindeligvis blevet anvendt til at bekræfte induktionen af en DSB 5,6,7,8,9. Øget DNA-skade har været forbundet med platinfølsomhed og effektivitet af DNA-skadelige stoffer 10,11,12, og ɣ-H2AX er blevet foreslået som en biomarkør forbundet med kemoterapirespons i andre kræftbehandlinger 13. Efter en DSB udfører en celle, der er dygtig i HRR, en række begivenheder, der fører til, at BRCA1 og BRCA2 rekrutterer RAD51 til at erstatte replikationsprotein A (RPA) og binde til DNA'et. HRR-reparation bruger en DNA-skabelon til trofast reparation af DSB. Men når tumorer mangler HRR, er de afhængige af alternative reparationsveje såsom ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ). NHEJ er kendt for at være fejlbehæftet og skaber en høj mutationsbyrde på cellen, der bruger 53BP1 som en positiv regulator14. Disse DNA-skadeproteiner kan alle identificeres nøjagtigt som foci ved hjælp af IF. Ud over farvning til proteiner kan IF bruges til at studere gaffelbeskyttelse og enkeltstrenget DNA-gapdannelse. Evnen til at have stabile gafler er blevet korreleret med platinrespons, og for nylig har gap-assays vist potentialet til at forudsige responset på PARP-hæmmere 6,15,16,17. Derfor er farvning for nukleotidanalogerne efter introduktion i genomet en anden måde at studere DDR på.
Hidtil har evaluering af DDR i kræft i æggestokkene stort set været begrænset til homogene 2D-cellelinjer, der ikke rekapitulerer den klonale heterogenitet, mikromiljø eller arkitektur af in vivo-tumorer18,19. Nyere forskning tyder på, at organoider er bedre end 2D-cellelinjer til at studere komplekse biologiske processer såsom DDR-mekanismer6. Den nuværende metode evaluerer RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA og geminin i BDO'er. Disse metoder vurderer den intakte organoid og giver mulighed for undersøgelse af DDR-mekanismer i en indstilling, der mere ligner in vivo-tumormikromiljøet. Sammen med konfokal mikroskopi og automatiseret focitælling kan denne metode hjælpe med at forstå DDR-vejen i kræft i æggestokkene og tilpasse behandlingsplaner for patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorvæv og ascites blev opnået efter at have opnået patientens samtykke som en del af et gynækologisk onkologisk biorepository, der blev godkendt af Washington University i St. Louis Institutional Review Board (IRB). Patienterne blev inkluderet, hvis de havde avanceret stadium serøs ovariecancer (HGSOC). Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur på bænken, medmindre andet er angivet. Alle reagenser blev fremstillet ved stuetemperatur (medmindre andet er angivet) og opbevaret ved 4 °C.
1. Organoid generation
- Generer organoiderne efter den tidligere offentliggjorte rapport20.
2. Plating og bestråling af organoider
- Brug organoider i kultur til at løsne organoidernes faner fra kulturskålen gennem manuel manipulation af en pipettespids. Saml organoiderne i et 15 ml konisk rør.
- Det koniske rør centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges forsigtigt af med en pipette.
- Tilsæt 1.000 μL af et animalsk oprindelsesfrit, rekombinant enzym til pellet (se materialetabel). Opløsningen blandes og inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
- Opløsningen centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Opsug forsigtigt supernatanten med en pipette.
- Efter centrifugering og aspiration resuspenderes pellet i 1.000 μL fosfatbufret saltvand.
- 10 μL af opløsningen overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas og blandes med 10 μL trypanblåt.
- Tag 10 μL af trypan blue cell-opløsningen ind i et celletællekammerobjektglas og indsæt det i celletællemaskinen (se materialetabel).
- Plade 40.000 celler pr. 20 μL kældermembranekstrakt (BME) i et 8-brønds glaskammerglas (se materialetabel). Dette opretholder organoiderne i 3-5 dage for at give cellerne mulighed for at danne organoider og vokse til en passende størrelse.
- For at fremkalde dobbeltstrengede DNA-brud udstråles de belagte organoider med 10 grå (Gy) ɣ-bestråling (se materialetabel for bestrålingsdetaljer).
BEMÆRK: Dette kan tage op til 5-10 min. - Organoiderne inkuberes i deres kulturmedier i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 4 timer.
3. Immunofluorescensfarvning
BEMÆRK: Volumener henviser til mængden pr. brønd af 8-brønds kammerobjektglas (~ 300 μL).
- Efter bestråling og inkubation af organoiderne aspireres medierne omhyggeligt med en pipette for ikke at forstyrre 3D-matrixen. Der vaskes med 300 μL PBS.
- Fastgør organoiderne i 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i 10 min.
BEMÆRK: Lad ikke stå for længe, da BME depolymeriseres og kan suges af. - Organoiderne vaskes med 300 μL farvningsbuffer (se materialetabel). Sæt på en ryster i 5 min.
- Til permeabilisering tilsættes forsigtigt 300 μL permeabiliseringsbuffer (se materialetabel) og inkuberes i 20 min. Vask med 300 μL farvningsbuffer. Sæt på en ryster i 5 min.
- Tilsæt 300 μL farvningsbuffer for at blokere permeabiliseringstrinnet. Sæt på en ryster i 30 min. Opsug farvningsbufferen ved hjælp af en pipette.
- Tilsæt 300 μL primære antistoffer (kaninanti-RAD51, muse-anti-Geminin, kanin-anti-RPA, muse-anti-ɣH2AX, kanin-anti-Geminin, muse-anti-53BP1; se materialetabel) fortyndet i farvningsbuffer. Der inkuberes ved 4 °C i 16 timer.
BEMÆRK: Undgå farvning sammen med det samme værtsdyr. Lad låget være af for at undgå, at antistofferne blandes ind i nabobrønde. - Fjern den primære antistofopløsning. Udfør tre vaske med 300 μL farvningsbuffer i 5 minutter hver på rysteren.
- Der tilsættes 300 μL sekundært antistof (gede-anti-mus Alexa fluor 488 og gede-antikanin Alexa fluor 647; se materialetabel) opløsning fortyndet i farvningsbuffer og inkuberes i 1 time i mørke.
BEMÆRK: Alle efterfølgende trin skal udføres i mørke. - Opsug den sekundære antistofopløsning. Tilsæt 300 μL fortyndet DAPI. Sæt på en ryster i 5 min.
- Udfør tre vaske med 300 μL farvningsbuffer i 5 minutter hver på rysteren. Fjern farvningsbufferen, og afmonter kamrene ved hjælp af fjernelsessættet, der følger med kammerobjektglassene (se materialetabellen).
BEMÆRK: Sørg for ikke at skubbe for langt fremad for at forstyrre 3D-matrixen. - Brug en p200-pipettespids med spidsen afskåret til at tilføje monteringsmedium (se materialetabel) for at dække hvert hul med en organoidfane (f.eks. 20-30 μL for hver organoidtlig).
- Placer et dæksel over prøven, undgå bobler.
- Tag klar neglelak og mal den på siderne af dækglasset for at forsegle diaset. Lad det hærde i 1 time og anbring det ved -20 °C.
BEMÆRK: Efter billeddannelse kan diaset opbevares i mindst 6 måneder med minimalt tab af fluorescens.
4. Billedbehandling
- Tag billeder ved hjælp af et konfokalmikroskop (se materialetabel) ved 63x mål med nedsænkningsolie.
BEMÆRK: Ved billeddannelse af nukleare proteiner er 63x fordelagtigt, men 40x er også acceptabelt. - Brug DAPI til at lokalisere organoiderne gennem okularet. Vælg de passende filtre til mikroskopi baseret på de anvendte fluoroforer. Indstil parametrene til optagelse af z-stack-billederne.
BEMÆRK: De fluoroforer, der blev anvendt i undersøgelsen, var DAPI, 488 og 647. 405, 488 og 638 lasere blev tændt for at visualisere farvningen.
BEMÆRK: Den anbefalede z-stack afhænger af målets opløsningsevne. - Juster livebilledet: indstil fokus, laserintensitet osv.
BEMÆRK: Jo højere laserintensiteten er, desto mere sandsynligt er det, at prøven fotobleges. Vælg derfor en optimal laserintensitet. - Anskaf z-stakken.
BEMÆRK: Dette kan tage op til 5-10 min. - Fra de billeder, der er indsamlet i z-stakken, skærmbillede mindst tre billeder pr. Stak.
BEMÆRK: Sørg for at få skærmbilleder i hele stakken for ikke at duplikere kernerne, når du kvantificerer. - Gem hver fil som en TIFF, og fortsæt til analyse (trin 5).
5. Bedømmelse
BEMÆRK: Brug JCountPro til al billedanalyse efter den tidligere offentliggjorte rapport21. Du kan hente denne software i den tilknyttede publikation.
- Under objektanalysepanelet (øverst i programmet) i fanen til valg af fil (nederst i programmet) skal du vælge TIFF-filerne .
- Klik på Tilføj for at flytte de markerede filer til gruppen Valgte filer. Vælg Skærm.
- Under segmenteringsfanen skal du vælge blå som kernens farve. Vælg Automatisk segmentering for at optimere tærsklen for kernerne.
BEMÆRK: Hvis den automatiske segmentering ikke identificerer objekterne nøjagtigt, kan brugeren justere finjusteringen og den rå melodi til billedet eller se brugervejledningen for yderligere at optimere segmenteringen. - Under objektpanelet skal du vælge Opdel store objekter automatisk og optimere størrelsen på kernerne.
BEMÆRK: Kernerne har typisk en ubetinget størrelse på 5.000 pixels, mens den betingede størrelse er 1.500 pixels. Se brugervejledningen for yderligere at optimere størrelsen på objekterne. - Vælg Identificer objekter for at teste parametrene.
BEMÆRK: Hvis disse parametre ikke er nøjagtige, kan størrelsen og indstillingen justeres sammen med andre indstillinger. Se brugervejledningen for instruktioner vedrørende yderligere optimering. - Når du har justeret parametrene til billedet, skal du vælge Identificer objekter i alle billeder for at identificere kernerne i alle de valgte billeder.
- Vælg panelet Foci-analyse (øverst i programmet).
- Under fanen Vælg filer (nederst i programmet) skal du vælge de TIFF-filer , der blev brugt til objektanalyse, og vælge pileknapperne (>>) for at flytte billederne til billedfilgruppen.
- I mappegruppen under de billedfiler, der blev flyttet, skal du dobbeltklikke på mappen Manuel redigering og vælge at flytte ioc-filerne til gruppen med objektsamlingsfiler.
BEMÆRK: Alle valgte TIFF'er skal have matchede ioc-filer. - Tryk på Vælg for at flytte filerne til den valgte filgruppe. Vælg fanen Foci-tælling nederst i programmet.
- Optimer parametrene ved at følge nedenstående trin.
- Top hat indstillinger indeks: 12.
- Fokuskanal: Vælg farven på foci (grøn: ɣ-H2AX; rød: RAD51).
- H-kuppelindstillinger: kuppelhøjde %: 30; tærskel %: 28 og 28.
- Indstilling af form/størrelse: Min fokusstørrelse, pixels: 5. Vælg Anvend form/størrelse. Max fokusstørrelse (betinget): 32. Min rundhed, x100: 96. Maks. fokus, pixels: 60.
- Støjfilter: størrelse 1.
BEMÆRK: Hvis du bestemmer, om en kerne er positiv for gemininfarvning, skal du under den anden kanal vælge grøn og under analyse vælge intensitet.
- For at teste de indstillede parametre skal du vælge nedenstående knapper i rækkefølge: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
BEMÆRK: Hvis disse parametre ikke virker, kan størrelsen og tuningen justeres sammen med andre indstillinger. Se brugervejledningen for at lære mere om, hvordan billedet kan optimeres yderligere. - Når parametrene er optimeret for de valgte billeder, skal du vælge Automatisk optælling for at tælle foci i hvert billede pr. kerne. Hvis den anden kanal ønskes, bestemmer programmet intensiteten, der kan bruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede protokol kan med succes plette, visualisere og kvantificere nukleare DNA-skadereparationsproteiner i organoider. Denne teknik blev brugt til at plette og evaluere BOB'er både før og efter bestråling. BDO'er blev udsat for 10 Gy stråling og evalueret for følgende biomarkører: ɣ-H2AX (figur 1), en markør for DNA-skade; RAD51 (figur 2), en markør for HRR; 53BP1, en markør for NHEJ; RPA, en markør for replikationsspænding (figur 3); og geminin, en G2/S fasecellecyklusmarkør14. Dosis på 10 Gy blev valgt på baggrund af tidligere offentliggjort forskning, der undersøgte DNA-skader ved ovariecancer 6,22. JCountPro-software blev brugt til at identificere kernen og kvantificere antallet af foci i kernen med illustrerede parametre13 (figur 4). Softwaren identificerer kernen (figur 4A, B), derefter nukleare foci (figur 4C) og filtrerer foci fra geminin-positive celler (figur 4D).
Figur 1: ɣ-H2AX foci i BOB'er før og efter bestråling. Repræsentative billeder af DAPI og ɣ-H2AX foci i BDO'er før og efter bestråling ved 10x med 63x indsatser. Vægtstænger: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: RAD51-foci og geminin i BOB'er før og efter bestråling. Repræsentative billeder af DAPI, geminin, RAD51 og co-farvning af geminin / RAD51 foci PDO'er før og efter bestråling ved 10x med 63x indsatser. Vægtstænger: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: RPA og 53BP1 i BOB før og efter bestråling. Repræsentative billeder af (A) DAPI, RPA; (B) geminin, 53BP1 og co-farvning af geminin/53BP1 foci ved 10x med 63x indsatser. Vægtstænger: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: JCountPro-softwarekvantificeringsworkflowet. (A) Under objektanalysen vælges den blå kanal for at identificere de blå objekter, kerner, derefter optimeres den automatisk ved at vælge den automatiske segmentering (rød pil). (B) Under automatisk opdeling tilpasses objektstørrelsen (kernerne) til billedets størrelse og forstørrelse. Knappen Identificer objekt vælges for at teste parametrene (1), og knappen Identificer objekter i alle billeder (rød pil) vælges for at identificere objekter (kerner) for hvert billede. (C) Under fanen focianalyse indtastes billederne, og foci-tælleparametrene indstilles: først vælges fociens farve under fokuskanalen, grøn; det øverste hatindeks er indstillet til 12; H-kuppelindstillingerne er indstillet til at have en kuppelhøjdeprocent på 30 og en tærskelprocent på 28; Fociens form og størrelse er optimeret til billedstørrelsen med de manuelle parametre for maksimal fokusstørrelse pixels ved 60 og minimum rundhed x 100 ved 96; Endelig anvendes støjfilteret. Indstillingerne testes ved at anvende tophat, H-kuppel og foci-antal (1-3). For at kvantificere ɣ-H2AX-foci pr. celle skal du trykke på start (rød pil). (D) For RAD51-foci anvendes indstillingerne som illustreret for ɣ-H2AX-foci, undtagen fokuskanalen, der ændres til rød; For at identificere kerner, der er farvet med geminin, vælges den anden kanal imidlertid til grøn, og analysen ændres til intensitet. Parametrene testes ved at anvende tophat, H-kuppel og foci-antal (1-3) og derefter trykke på start (rød pil) for at kvantificere alle RAD51-foci og evaluere intensiteten af grønt pr. celle i hvert billede. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-skaderesponsen spiller en integreret rolle i både udviklingen af kræft i æggestokkene og kemoterapiresistens. Derfor er en grundig forståelse af DNA-reparationsmekanismer afgørende. Her præsenteres en metode til at studere DNA-skadereparationsproteiner i 3D, intakte organoider. En reproducerbar, pålidelig protokol udvikles ved hjælp af kendetegnende antistoffer til evaluering af DNA-skader, homolog rekombination, ikke-homolog endesammenføjning og replikationsstress. Det er vigtigt, at disse metoder valideres ved hjælp af genetisk modificerede kontroller, der viser disse metoders specificitet og følsomhed.
Det mest kritiske trin i denne protokol er plettering og fiksering af organoiderne. Denne protokol inkuberer specifikt organoider i 2% PFA i 10 minutter med tæt overvågning af kældermembranekstraktet (BME) under fikseringsprocessen. Dette adskiller sig fra andre immunfluorescensprotokoller i organoider, der foreslår at bruge 4% PFA i 10-60 min23,24,25. Det har vist sig, at hvis fanerne i BME er i en koncentreret mængde PFA for længe, depolymeriserer fanerne og udsættes for aspiration. Bemærk, at producenter af specifikke BME'er ofte tilbyder forslag vedrørende fiksering. Et andet vigtigt diskussionspunkt er pletteringen af organoiderne. Farvningsprocessen kan resultere i at miste en del eller alle organoiderne. Derfor, jo mere sammenflydende fanen på pletteringstidspunktet, jo større sandsynlighed vil prøven med succes modstå farvningstrinnene.
Styrkerne ved denne protokol inkluderer validering af nuklear antistoffarvning, evnen til at udføre immunofluorescens og billeddannelse af intakte 3D-organoider og protokollens tilpasningsevne til enhver behandling eller molekyle af interesse.
Antistofferne, der blev anvendt i disse eksperimenter, blev strengt valideret for specificitet ved hjælp af genetisk modificerede ovariecancerceller. Metoderne blev yderligere valideret for følsomhed ved at udsætte BOB'er for stigende strålingsdoser. Dette resulterede i stigende ɣ-H2AX, RAD51 og RPA-foci i HRR-dygtige PDO'er. Endelig letter de objektive kvantificeringsmetoder reproducerbarheden af dette assay og undgår den subjektive skævhed ved manuel kvantificering.
Traditionelle metoder til at udforske DDR er gennem 2D-dyrkningsbetingelser kendt som cellelinjer, men de har ikke evnen til at opretholde den genetiske heterogenitet af den oprindelige tumor. Tumormikromiljøet er afgørende for tumorigenese og kemoterapiresistens i ovariecancer 26,27,28, derfor giver disse modeller en fordel for 2D homogene cellekulturer, når man studerer DDR. Når man studerer DDR, er det nødvendigt at kontrollere for cellecyklus for at undgå fejlklassificering af manglende evne til at udføre specifikke typer DNA-reparation, der er cellecyklusspecifikke (dvs. HRR). Fremtidigt arbejde er fokuseret på at studere specifikke typer DNA-læsioner forårsaget af platinkemoterapi, poly (ADP-ribose) polymerasehæmmere eller hydroxyurea.
Endelig kan denne protokol tilpasses til at studere ethvert antigen, der kan ændres til traditionel immunfluorescens, og kan rumme undersøgelsen af nye lægemiddelterapier. Den præsenterede protokol fokuserer på DDR-proteiner, men med en simpel ændring af antistoffer kan denne protokol modificeres til at studere andre proteiner, glycaner og små molekyler. Da organoiderne desuden er heterogene 3D-modeller dyrket in vitro, er enhver behandling af organoiderne mulig, herunder immunterapi, antiangiogen terapi, metabolomicsterapi og andre nye terapier, der er vanskelige at evaluere i homogene cellelinjer 29,30,31.
Begrænsninger ved denne metode inkluderer anvendelse af en BME med inkonsekvent sammensætning og ikke-specifik farvning. Da kommercielle BME'er fremstilles af cellelinjer, kan sammensætningen af hver enhed variere enormt. Disse forskelle kan påvirke fiksering og farvning samt organoidgenerering. Afhængigt af prøven kan der desuden være ikke-specifik farvning af BME, hvilket kan hindre proteinet af interesse. Ikke desto mindre er den nukleare farvning meget specifik og viser klare nukleare fokus, som let kan kvantificeres.
Afslutningsvis præsenteres en detaljeret protokol til evaluering af DDR-proteiner i organoider. Efterhånden som teknologien skrider frem, forventes det, at organoider vil kunne bruges til at evaluere reparation af levende celle-DNA-skader i disse 3D-modeller. Derudover vil organoiderne som den mest effektive metode til dyrkning blive etableret, og mere sofistikerede assays såsom DNA-fiber og replikationsgabassays vil være mulige32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for vejledning fra Pavel Lobachevsky, ph.d., i etableringen af denne protokol. Vi vil også gerne anerkende Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
