Summary
Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde DNA hasarı onarım proteinlerini değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada kapsamlı kaplama ve boyama yöntemlerinin yanı sıra ayrıntılı, objektif niceleme prosedürleri de bulunmaktadır.
Abstract
İmmünofloresan, proteinlerin, glikanların ve küçük moleküllerin doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna olanak sağlayan, yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip hedef antijenleri görselleştirmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu teknik iki boyutlu (2D) hücre kültüründe iyi kurulmuş olsa da, üç boyutlu (3D) hücre modellerinde kullanımı hakkında daha az şey bilinmektedir. Yumurtalık kanseri organoidleri, tümör hücresi klonal heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetleyen 3D tümör modelleridir. Bu nedenle, ilaç duyarlılığının ve fonksiyonel biyobelirteçlerin değerlendirilmesinde hücre hatlarından üstündürler. Bu nedenle, primer yumurtalık kanseri organoidlerinde immünofloresan kullanma yeteneği, bu kanserin biyolojisini anlamada son derece faydalıdır. Bu çalışmada, yüksek dereceli seröz hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde (PDO'lar) DNA hasarı onarım proteinlerini tespit etmek için immünofloresan tekniği açıklanmaktadır. PDO'ları iyonlaştırıcı radyasyona maruz bıraktıktan sonra, nükleer proteinleri odak olarak değerlendirmek için sağlam organoidler üzerinde immünofloresan yapılır. Görüntüler konfokal mikroskopide z-yığın görüntüleme kullanılarak toplanır ve otomatik odak sayım yazılımı kullanılarak analiz edilir. Tarif edilen yöntemler, DNA hasar onarım proteinlerinin zamansal ve özel olarak işe alınmasının analizine ve bu proteinlerin hücre döngüsü belirteçleri ile kolokalizasyonuna izin verir.
Introduction
Yumurtalık kanseri jinekolojik maligniteye bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastaların çoğunluğu karboplatin gibi DNA'ya zarar veren ilaçlarla tedavi edilir ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR) eksikliği olan tümörleri olanlara poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleriverilebilir 1,2. Bununla birlikte, çoğu hasta bu tedavilere direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür. DNA hasar yanıtının (DDR) düzensizliği, yumurtalık kanseri gelişimi ve hem kemoterapi hem de PARP inhibitörü direnci ile ilişkilendirilmiştir3. Bu nedenle, DDR'nin incelenmesi, yumurtalık kanserinin patofizyolojisini, potansiyel biyobelirteçleri ve yeni hedefe yönelik tedavileri anlamada zorunludur.
DDR'yi değerlendirmek için mevcut yöntemler, DNA hasar proteinlerinin ve nükleotid analoglarının doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna izin verdiği için immünofloresan (IF) kullanır. DNA'da çift sarmallı bir kırılma (DSB) olduğunda, histon proteini H2AX hızla fosforile edilir ve DNA hasarı onarım proteinlerinin4'ü bir araya getirdiği bir odak oluşturur. Bu fosforilasyon, IF kullanılarak kolayca tanımlanabilir; Aslında, ɣ-H2AX testi, bir DSB 5,6,7,8,9'un indüksiyonunu doğrulamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Artmış DNA hasarı, DNA'ya zarar veren ajanların platin duyarlılığı ve etkinliği ile ilişkilendirilmiştir 10,11,12 ve ɣ-H2AX, diğer kanser tedavilerinde kemoterapi yanıtı ile ilişkili bir biyobelirteç olarak önerilmiştir13. Bir DSB üzerine, HRR'de yetkin bir hücre, BRCA1 ve BRCA2'nin replikasyon proteini A'nın (RPA) yerini alması ve DNA'ya bağlanması için RAD51'i işe almasına yol açan bir dizi olay gerçekleştirir. HRR onarımı, DSB'yi sadık bir şekilde onarmak için bir DNA şablonu kullanır. Bununla birlikte, tümörler HRR'de eksik olduğunda, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) gibi alternatif onarım yollarına güvenirler. NHEJ'nin hataya eğilimli olduğu bilinmektedir ve hücre üzerinde yüksek mutasyonel bir yük oluşturur, bu da 53BP1'i pozitif bir düzenleyici14 olarak kullanır. Bu DNA hasarı proteinlerinin hepsi IF kullanılarak odaklar olarak doğru bir şekilde tanımlanabilir. Proteinler için boyamaya ek olarak, IF çatal korumasını ve tek sarmallı DNA boşluğu oluşumunu incelemek için kullanılabilir. Stabil çatallara sahip olma yeteneği platin yanıtı ile ilişkilendirilmiştir ve son zamanlarda, boşluk testleri PARP inhibitörlerine 6,15,16,17 yanıtını tahmin etme potansiyelini göstermiştir. Bu nedenle, genoma girdikten sonra nükleotid analogları için boyama, DDR'yi incelemenin başka bir yoludur.
Bugüne kadar, yumurtalık kanserinde DDR'nin değerlendirilmesi büyük ölçüde klonal heterojenliği, mikroçevreyi veya in vivo tümörlerin mimarisini özetlemeyen homojen 2D hücre hatları ile sınırlandırılmıştır18,19. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, organoidlerin DDRmekanizmaları 6 gibi karmaşık biyolojik süreçleri incelemede 2D hücre hatlarından daha üstün olduğunu göstermektedir. Mevcut metodoloji PDO'larda RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA ve geminin'i değerlendirmektedir. Bu yöntemler bozulmamış organoidi değerlendirir ve DDR mekanizmalarının in vivo tümör mikroçevresine daha benzer bir ortamda incelenmesine izin verir. Konfokal mikroskopi ve otomatik odak sayımı ile birlikte, bu metodoloji yumurtalık kanserinde DDR yolunun anlaşılmasına ve hastalar için tedavi planlarının kişiselleştirilmesine yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tümör dokusu ve asit, St. Louis Kurumsal İnceleme Kurulu'ndaki (IRB) Washington Üniversitesi tarafından onaylanan jinekolojik onkoloji biyodeposunun bir parçası olarak hasta onayı alındıktan sonra elde edildi. İleri evre yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC) olan hastalar dahil edildi. Tüm prosedürler aksi belirtilmedikçe tezgahta oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Tüm reaktifler oda sıcaklığında (aksi belirtilmedikçe) hazırlandı ve 4 ° C'de saklandı.
1. Organoid üretimi
- Daha önce yayınlanan rapor20'yi izleyerek organoidleri oluşturun.
2. Organoidlerin kaplanması ve ışınlanması
- Kültürde organoidleri kullanarak, bir pipet ucunun manuel manipülasyonu yoluyla organoidlerin tırnaklarını kültür kabından çıkarın. Organoidleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
- Konik tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Pelet için 1.000 μL hayvansal kökenli olmayan, rekombinant enzim ekleyin (bkz. Çözeltiyi karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Çözeltiyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice aspire edin.
- Santrifüjleme ve aspirasyondan sonra, peleti 1.000 μL fosfat tamponlu salin içinde yeniden askıya alın.
- Çözeltinin 10 μL'sini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 μL tripan mavisi ile karıştırın.
- Tripan mavi hücre çözeltisinin 10 μL'sini bir hücre sayma odası slaytına alın ve hücre sayma makinesine yerleştirin (bkz.
- 8 delikli bir cam hazne kaydırağına 20 μL bazal membran ekstraktı (BME) başına 40.000 hücre plakalayın (bkz. Bu, hücrelerin organoidler oluşturmasına ve uygun bir boyuta büyümesine izin vermek için organoidleri 3-5 gün boyunca korur.
- Çift sarmallı DNA kırılmalarını indüklemek için, kaplanmış organoidleri 10 Gri (Gy) ɣ-ışınlama ile ışınlayın (ışınlayıcı ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Bu işlem 5-10 dakika kadar sürebilir. - Kültür ortamlarındaki organoidleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve 4 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
3. İmmünofloresan boyama
NOT: Hacimler, 8 delikli hazneli kızağın (~300 μL) kuyucuk başına miktarını ifade eder.
- Organoidlerin ışınlanması ve inkübasyonundan sonra, 3D matrisi bozmamak için ortamı bir pipetle dikkatlice aspire edin. 300 μL PBS ile yıkayın.
- Organoidleri 10 dakika boyunca 300 μL% 2 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
NOTLAR: BME depolimerize olacağından ve aspire edilebileceğinden çok uzun süre ayrılmayın. - Organoidleri 300 μL boyama tamponu ile yıkayın (bkz. 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Geçirgenlik için, nazikçe 300 μL geçirgenlik tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 20 dakika boyunca inkübe edin. 300 μL boyama tamponu ile yıkayın. 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Geçirgenlik adımını engellemek için 300 μL boyama tamponu ekleyin. 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bir pipet kullanarak boyama tamponunu aspire edin.
- Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 μL birincil antikor (tavşan anti-RAD51, fare anti-Geminin, tavşan anti-RPA, fare anti-H2AX, tavşan anti-Geminin, fare anti-53BP1; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. 16 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
NOT: Aynı konakçı hayvanla birlikte lekelenmeyi önleyin. Antikorların komşu kuyucuklara karışmasını önlemek için kapağı kapalı bırakın. - Birincil antikor çözeltisini çıkarın. Çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 300 μL boyama tamponu ile üç yıkama yapın.
- Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 μL ikincil antikor (keçi anti-fare Alexa fluor 488 ve keçi anti-tavşan Alexa fluor 647; bakınız Malzeme Tablosu) çözeltisi ekleyin ve karanlıkta 1 saat inkübe edin.
NOT: Sonraki tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir. - İkincil antikor çözeltisini aspire edin. 300 μL seyreltilmiş DAPI ekleyin. 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 300 μL boyama tamponu ile üç yıkama yapın. Boyama tamponunu çıkarın ve hazne kızaklarıyla birlikte verilen sökme kitini kullanarak odaları ayırın (bkz.
NOT: 3B matrisi bozmak için çok ileri itmediğinizden emin olun. - Ucu kesilmiş bir p200 pipet ucu kullanarak, her bir kuyucuğu bir organoid tırnakla (ör. her organoid tırnak için 20-30 μL) örtmek için montaj ortamı ekleyin (bkz.
- Kabarcıklardan kaçınarak numunenin üzerine bir kapak kayması yerleştirin.
- Şeffaf oje alın ve slaytı kapatmak için kapak camının kenarlarına boyayın. 1 saat sertleşmesine izin verin ve -20 ° C'ye yerleştirin.
NOT: Görüntülemeden sonra, slayt en az floresan kaybıyla en az 6 ay saklanabilir.
4. Görüntüleme
- Daldırma yağı ile 63x hedefte bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Nükleer proteinleri görüntülüyorsanız, 63x avantajlıdır, ancak 40x de kabul edilebilir. - Organoidleri göz merceğinden bulmak için DAPI kullanın. Kullanılan floroforlara göre mikroskopi için uygun filtreleri seçin. Z-stack görüntülerini yakalamak için parametreleri ayarlayın.
NOT: Çalışmada kullanılan floroforlar DAPI, 488 ve 647 idi. Boyama işlemini görselleştirmek için 405, 488 ve 638 lazerler açıldı.
NOT: Önerilen z-yığını, hedefin çözme gücüne bağlıdır. - Canlı görüntüyü ayarlayın: odağı, lazer yoğunluğunu vb. Ayarlayın.
NOT: Lazer yoğunluğu ne kadar yüksek olursa, numunenin foto-ağartma olasılığı o kadar yüksek olur. Bu nedenle, optimum bir lazer yoğunluğu seçin. - Z-yığınını edinin.
NOT: Bu işlem 5-10 dakika kadar sürebilir. - Z-yığınında toplanan görüntülerden, yığın başına en az üç görüntünün ekran görüntüsünü alın.
NOT: Niceleme sırasında çekirdekleri çoğaltmamak için yığın boyunca ekran görüntüleri aldığınızdan emin olun. - Her dosyayı TIFF olarak kaydedin ve çözümlemeye devam edin (adım 5).
5. Analiz
NOT: Daha önce yayınlanan rapor21'i izleyen tüm görüntü analizleri için JCountPro kullanın. Bu yazılımı edinmek için, ilişkili yayına başvurun.
- Dosya seçimi sekmesindeki (programın alt kısmındaki) nesne analizi panelinin altında (programın üst kısmı), TIFF dosyalarını seçin.
- Seçili dosyaları seçili dosyalar grubuna taşımak için Ekle'yi tıklatın. Ekran'ı seçin.
- Segmentasyon sekmesinin altında, çekirdeklerin rengi olarak maviyi seçin. Çekirdeklerin eşiğini optimize etmek için Otomatik segmentasyon'u seçin.
NOT: Otomatik segmentasyon nesneleri doğru bir şekilde tanımlamazsa, kullanıcı ince ayarı ve ham ayarı görüntüye ayarlayabilir veya segmentasyonu daha da optimize etmek için kullanım kılavuzuna bakabilir. - Nesneler panelinin altında, Büyük nesneleri otomatik böl'ü seçin ve çekirdeklerin boyutunu en iyi duruma getirin.
NOT: Çekirdekler genellikle koşulsuz boyutu 5.000 pikseldir, koşullu boyutu ise 1.500 pikseldir. Nesnelerin boyutunu daha da optimize etmek için kullanım kılavuzuna bakın. - Parametreleri test etmek için Nesneleri tanımla'yı seçin.
NOT: Bu parametreler doğru değilse, boyut ve ayar diğer ayarlarla birlikte ayarlanabilir. Daha fazla optimizasyonla ilgili talimatlar için kullanım kılavuzuna bakın. - Parametrelerin görüntüyü ayarladıktan sonra, seçilen tüm görüntülerdeki çekirdekleri tanımlamak için Tüm Görüntülerdeki Nesneleri Tanımla'yı seçin.
- Odak Analizi panelini seçin (programın üst kısmı).
- Dosya seç sekmesinin altında (programın alt kısmında), nesne çözümlemesi için kullanılan TIFF dosyalarını seçin ve görüntüleri görüntü dosyaları grubuna taşımak için Ok Düğmelerini (>>) seçin.
- Taşınan görüntü dosyalarının altındaki dizin grubunda, El İle Düzenle klasörünü çift tıklatın ve ioc dosyalarını nesne koleksiyonu dosyaları grubuna taşımayı seçin.
NOT: Seçilen tüm TIFF'ler ioc dosyalarıyla eşleşmiş olmalıdır. - Dosyaları seçili dosyalar grubuna taşımak için Select (Seç ) düğmesine basın. Programın altındaki Odak sayımı sekmesini seçin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek parametreleri optimize edin.
- Üst şapka ayarları dizini: 12.
- Netleme kanalı: Odakların rengini seçin (yeşil: ɣ-H2AX; kırmızı: RAD51).
- H kubbe ayarları: kubbe yüksekliği %: 30; eşik %: 28 ve 28.
- Şekil/boyut ayarı: Minimum odak boyutu, piksel: 5. Şekil/Boyut Uygula'yı seçin. Maksimum odak boyutu (koşullu): 32. Minimum yuvarlaklık, x100: 96. Maksimum odak, piksel: 60.
- Gürültü filtresi: boyut 1.
NOT: Bir çekirdeğin geminin boyanması için pozitif olup olmadığını belirlerseniz, ikinci kanalın altında yeşili seçin ve analiz altında yoğunluğu seçin.
- Ayarlanan parametreleri test etmek için aşağıdaki düğmeleri sırayla seçin: Üst Şapka > H-Kubbe > Odak Sayısı.
NOT: Bu parametreler işe yaramazsa, boyut ve ayar diğer ayarlarla birlikte ayarlanabilir. Görüntünün nasıl daha da optimize edilebileceği hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanım kılavuzuna bakın. - Parametreler seçilen görüntüler için optimize edildikten sonra, çekirdek başına her görüntüdeki odakları saymak için Otomatik say'ı seçin. İkinci kanal istenirse, program kullanılabilecek yoğunluğu belirleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan protokol, organoidlerdeki nükleer DNA hasar onarım proteinlerini başarılı bir şekilde boyayabilir, görselleştirebilir ve ölçebilir. Bu teknik, ışınlamadan önce ve sonra PDO'ları boyamak ve değerlendirmek için kullanıldı. PDO'lar 10 Gy radyasyona maruz bırakıldı ve aşağıdaki biyobelirteçler için değerlendirildi: ɣ-H2AX (Şekil 1), DNA hasarının bir belirteci; HRR için bir belirteç olan RAD51 (Şekil 2); 53BP1, NHEJ'nin bir belirteci; RPA, çoğaltma geriliminin bir belirteci (Şekil 3); ve ikizler, bir G2 / S faz hücre döngüsü belirteci14. 10 Gy dozu, yumurtalık kanserinde DNA hasarını inceleyen daha önce yayınlanmış araştırmalara dayanarak seçildi 6,22. JCountPro yazılımı, çekirdeği tanımlamak ve resimli parametreler13 ile çekirdek içindeki odak sayısını ölçmek için kullanıldı (Şekil 4). Yazılım, çekirdeği (Şekil 4A, B), ardından nükleer odakları (Şekil 4C) tanımlar ve odakları ikizler-pozitif hücrelerden filtreler (Şekil 4D).
Resim 1: Işınlama öncesi ve sonrası PDO'larda ɣ-H2AX odakları. PDO'larda DAPI ve ɣ-H2AX odaklarının 63x insetlerle 10x'te ışınlama öncesi ve sonrası temsili görüntüleri. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Işınlama öncesi ve sonrası PDO'larda RAD51 odakları ve ikizler. DAPI, geminin, RAD51'in temsili görüntüleri ve geminin/RAD51 odaklarının 63x insetlerle 10x'te ışınlamadan önce ve sonra birlikte boyanması. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Işınlama öncesi ve sonrası PDO'larda RPA ve 53BP1. (A) DAPI, RPA'nın temsili görüntüleri; (B) ikizler, 53BP1 ve geminin/53BP1 odaklarının 10x'te 63x insetlerle birlikte boyanması. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: JCountPro yazılımı niceleme iş akışı . (A) Nesne analizi altında, mavi nesneleri, çekirdekleri tanımlamak için mavi kanal seçilir, ardından otomatik segmentasyon (kırmızı ok) seçilerek otomatik olarak optimize edilir. (B) Otomatik bölme altında, nesne boyutu (çekirdekler) görüntünün boyutuna ve büyütmeye uyarlanır. Parametreleri test etmek için nesneyi tanımla düğmesi seçilir (1) ve her görüntünün nesnelerini (çekirdekleri) tanımlamak için Tüm görüntülerdeki nesneleri tanımla (kırmızı ok) düğmesi seçilir. (C) Odak analizi sekmesi altında, görüntüler girilir ve odak sayma parametreleri ayarlanır: ilk olarak, odakların rengi odak kanalının altında seçilir, yeşil; üst şapka endeksi 12 olarak ayarlanır; H kubbe ayarları, kubbe yükseklik yüzdesi 30 ve eşik yüzdesi 28 olacak şekilde ayarlanmıştır; odakların şekli ve boyutu, 60'ta maksimum odak boyutu pikselleri ve 96'da minimum yuvarlaklık x 100 manuel parametreleri ile görüntü boyutuna göre optimize edilir; Son olarak, gürültü filtresi uygulanır. Ayarlar, üst şapka, H kubbesi ve odak sayısı (1-3) uygulanarak test edilir. Hücre başına ɣ-H2AX odaklarını ölçmek için, başlat düğmesine basın (kırmızı ok). (D) RAD51 odakları için ayarlar, kırmızıya değiştirilen netleme kanalı hariç, ɣ-H2AX odakları için gösterildiği gibi uygulanır; Bununla birlikte, ikizler ile boyanmış çekirdekleri tanımlamak için, ikinci kanal yeşil olarak seçilir ve analiz yoğunluğa değiştirilir. Parametreler, üst şapka, H kubbesi ve odak sayısı (1-3) uygulanarak, ardından tüm RAD51 odaklarını ölçmek için başlat düğmesine (kırmızı ok) basılarak ve her görüntüde hücre başına yeşilin yoğunluğu değerlendirilerek test edilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA hasarı yanıtı hem yumurtalık kanseri gelişiminde hem de kemoterapi direncinde ayrılmaz bir rol oynar. Bu nedenle, DNA onarım mekanizmalarının tam olarak anlaşılması zorunludur. Burada, DNA hasarı onarım proteinlerini 3D, bozulmamış organoidlerde incelemek için bir metodoloji sunulmaktadır. DNA hasarını, homolog rekombinasyonu, homolog olmayan uç birleştirmeyi ve replikasyon stresini değerlendirmek için ayırt edici antikorlar kullanılarak tekrarlanabilir, güvenilir bir protokol geliştirilmiştir. Önemli olarak, bu yöntemler, bu yöntemlerin özgüllüğünü ve duyarlılığını gösteren genetiği değiştirilmiş kontroller kullanılarak doğrulanır.
Bu protokoldeki en kritik adım, organoidlerin kaplanması ve sabitlenmesidir. Bu protokol, fiksasyon işlemi sırasında bazal membran ekstraktının (BME) yakından izlenmesiyle organoidleri 10 dakika boyunca% 2 PFA'da spesifik olarak inkübe eder. Bu, organoidlerdeki 10-60 dakika23,24,25 için% 4 PFA kullanılmasını öneren diğer immünofloresan protokollerinden farklıdır. BME'nin tırnakları çok uzun süre konsantre miktarda PFA içindeyse, tırnakların depolimerize olduğu ve aspirasyona maruz kaldığı bulunmuştur. Not olarak, belirli BME'lerin üreticileri genellikle fiksasyonla ilgili önerilerde bulunur. Bir diğer önemli tartışma noktası organoidlerin kaplanmasıdır. Boyama işlemi, organoidlerin bir kısmını veya tamamını kaybetmeye neden olabilir. Bu nedenle, kaplama sırasında tırnağın ne kadar akıcı olursa, numunenin boyama adımlarına başarılı bir şekilde dayanma olasılığı o kadar yüksek olur.
Bu protokolün güçlü yönleri, nükleer antikor boyamasının doğrulanmasını, immünofloresan ve bozulmamış 3D organoidlerin görüntülenmesini ve protokolün ilgilenilen herhangi bir tedaviye veya moleküle uyarlanabilirliğini içerir.
Bu deneylerde kullanılan antikorlar, genetiği değiştirilmiş yumurtalık kanseri hücreleri kullanılarak özgüllük için sıkı bir şekilde doğrulandı. Yöntemler, PDO'ları artan radyasyon dozlarına maruz bırakarak duyarlılık açısından daha da doğrulandı. Bu, HRR yetkin PDO'larda ɣ-H2AX, RAD51 ve RPA odaklarının artmasına neden oldu. Son olarak, nesnel niceleme yöntemleri bu tahlilin tekrarlanabilirliğini kolaylaştırır ve manuel nicelemenin öznel önyargısından kaçınır.
DDR'yi keşfetmek için geleneksel yöntemler, hücre hatları olarak bilinen 2D kültürleme koşullarıdır, ancak orijinal tümörün genetik heterojenliğini koruma yeteneğine sahip değildirler. Tümör mikroçevresi, yumurtalık kanserinde tümör mikroçevresinin ve kemoterapi direncinin 26,27,28 yılında hayati önem taşıdığından, bu modeller DDR'yi incelerken 2D homojen hücre kültürlerine avantaj sağlar. DDR'yi incelerken, hücre döngüsüne özgü (yani HRR) spesifik DNA onarımı türlerini gerçekleştirememenin yanlış sınıflandırılmasını önlemek için hücre döngüsünü kontrol etmek gerekir. Gelecekteki çalışmalar, platin kemoterapi, poli (ADP-riboz) polimeraz inhibitörleri veya hidroksiüre neden olan spesifik DNA lezyonları tiplerini incelemeye odaklanmıştır.
Son olarak, bu protokol geleneksel immünofloresansa göre değiştirilebilen herhangi bir antijeni incelemek için uyarlanabilir ve yeni ilaç tedavilerinin çalışmasına uyum sağlayabilir. Sunulan protokol DDR proteinlerine odaklanır, ancak basit bir antikor değişikliği ile bu protokol diğer proteinleri, glikanları ve küçük molekülleri incelemek için değiştirilebilir. Ek olarak, organoidler in vitro kültürlenmiş heterojen 3D modeller olduğundan, immünoterapi, antianjiyojenik tedavi, metabolomik terapi ve homojen hücre hatlarında değerlendirilmesi zor olan diğer yeni tedaviler de dahil olmak üzere organoidlerin herhangi bir tedavisi mümkündür 29,30,31.
Bu yöntemin sınırlamaları, tutarsız bileşime ve spesifik olmayan boyama ile bir BME kullanımını içerir. Ticari BME'ler hücre hatlarından üretildiğinden, her birimin bileşimi büyük ölçüde değişebilir. Bu farklılıklar fiksasyon ve boyama ile organoid oluşumunu etkileyebilir. Ek olarak, numuneye bağlı olarak, BME'nin spesifik olmayan boyanması olabilir, bu da ilgilenilen proteini engelleyebilir. Bununla birlikte, nükleer boyama çok spesifiktir ve kolayca ölçülebilen net nükleer odakları gösterir.
Sonuç olarak, organoidlerde DDR proteinlerini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Teknoloji ilerledikçe, organoidlerin bu 3D modellerde canlı hücre DNA hasarı onarımını değerlendirmek için kullanılabileceği tahmin edilmektedir. Ek olarak, kültüre en etkili yöntem olarak, organoidler kurulacak ve DNA lifi ve replikasyon boşluğu testleri gibi daha sofistike testler mümkün olacaktır32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu protokolün oluşturulmasında Pavel Lobachevsky, PhD'nin rehberliği için minnettarız. Ayrıca, St. Louis'in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne, Washington Üniversitesi Dekan'ın Akademik Programına, Jinekolojik Onkoloji Grubu Vakfı'na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı'na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
