Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להערכת חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. להלן שיטות ציפוי וצביעה מקיפות, כמו גם הליכי כימות מפורטים ואובייקטיביים.
Abstract
Immunofluorescence היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר כדי לדמיין אנטיגנים המטרה עם רגישות גבוהה וספציפיות, המאפשר זיהוי מדויק לוקליזציה של חלבונים, גליקנים, מולקולות קטנות. בעוד טכניקה זו מבוססת היטב בתרבית תאים דו-ממדית (2D), פחות ידוע על השימוש בה במודלים תלת-ממדיים (3D) של תאים. אורגנואידים של סרטן השחלות הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים המשחזרים הטרוגניות של תאי גידול, מיקרו-סביבה של הגידול ואינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים. לפיכך, הם עדיפים על קווי תאים להערכת רגישות לתרופות וסמנים ביולוגיים פונקציונליים. לכן, היכולת לנצל אימונופלואורסנציה על אורגנואידים ראשוניים של סרטן השחלות מועילה ביותר בהבנת הביולוגיה של סרטן זה. המחקר הנוכחי מתאר את הטכניקה של אימונופלואורסנציה לזיהוי חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות (PDOs) שמקורם בחולה סרוס ברמה גבוהה. לאחר חשיפת PDOs לקרינה מייננת, immunofluorescence מבוצעת על אורגנואידים שלמים כדי להעריך חלבונים גרעיניים כמוקדים. התמונות נאספות באמצעות הדמיית z-stack במיקרוסקופ קונפוקלי ומנותחות באמצעות תוכנה אוטומטית לספירת מוקדים. השיטות המתוארות מאפשרות ניתוח של גיוס זמני ומיוחד של חלבונים לתיקון נזקי DNA וקולוקליזציה של חלבונים אלה עם סמנים של מחזור התא.
Introduction
סרטן השחלות הוא סיבת המוות המובילה עקב ממאירות גינקולוגית. רוב החולים מטופלים בתרופות הפוגעות בדנ"א כגון קרבופלטין, ואלה עם גידולים הומולוגיים עם תיקון רקומבינציה הומולוגית (HRR) יכולים לקבל מעכבי פולי (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) 1,2. עם זאת, רוב החולים מפתחים עמידות לטיפולים אלה ומתים תוך 5 שנים מהאבחון. חוסר ויסות של תגובת הנזק לדנ"א (DDR) נקשר להתפתחות סרטן השחלות ולכימותרפיה ולעמידות למעכבי PARP3. לפיכך, מחקר של DDR הוא הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סרטן השחלות, סמנים ביולוגיים פוטנציאליים, וטיפולים ממוקדים חדשניים.
השיטות הנוכחיות להערכת DDR משתמשות באימונופלואורסנציה (IF), מכיוון שהדבר מאפשר זיהוי מדויק ולוקליזציה של חלבונים הפוגעים בדנ"א ואנלוגים לנוקלאוטידים. ברגע שיש שבר דו-גדילי (DSB) בדנ"א, חלבון ההיסטון H2AX עובר זרחן מהיר, ויוצר מוקד שבו חלבונים לתיקון נזקי דנ"א מתכנסים4. זרחן זה ניתן לזהות בקלות באמצעות IF; למעשה, בדיקת ɣ-H2AX שימשה בדרך כלל כדי לאשר את האינדוקציה של DSB 5,6,7,8,9. נזק מוגבר לדנ"א נקשר לרגישות פלטינה וליעילות של חומרים המזיקים לדנ"א 10,11,12, ו-ɣ-H2AX הוצע כסמן ביולוגי הקשור לתגובה כימותרפית בטיפולים אחרים בסרטן 13. ב-DSB, תא המיומן ב-HRR מבצע סדרה של אירועים שמובילים לכך ש-BRCA1 ו-BRCA2 מגייסים את RAD51 כדי להחליף את חלבון השכפול A (RPA) ולהיקשר לדנ"א. תיקון HRR משתמש בתבנית DNA כדי לתקן נאמנה את DSB. עם זאת, כאשר גידולים חסרים HRR, הם מסתמכים על מסלולי תיקון חלופיים כגון חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ). NHEJ ידוע כנוטה לטעויות ויוצר עומס מוטציות גבוה על התא, המשתמש ב- 53BP1 כמווסת חיובי14. חלבונים אלה הפוגעים בדנ"א יכולים להיות מזוהים במדויק כמוקדים באמצעות IF. בנוסף לצביעה של חלבונים, ניתן להשתמש ב-IF כדי לחקור הגנה מפני מזלג והיווצרות פער DNA חד-גדילי. היכולת לקבל מזלגות יציבים נמצאה בקורלציה עם תגובת פלטינה, ולאחרונה, מבחני פער הראו את הפוטנציאל לחזות את התגובה למעכבי PARP 6,15,16,17. לכן, צביעה עבור אנלוגים נוקלאוטידים לאחר הקדמה לתוך הגנום היא דרך נוספת ללמוד את DDR.
עד כה, הערכת ה- DDR בסרטן השחלות הוגבלה במידה רבה לקווי תאים דו-ממדיים הומוגניים שאינם משחזרים את ההטרוגניות השבט, המיקרו-סביבה או הארכיטקטורה של גידולי in vivo 18,19. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאורגנואידים עדיפים על קווי תאים דו-ממדיים בחקר תהליכים ביולוגיים מורכבים כגון מנגנוני DDR6. המתודולוגיה הנוכחית מעריכה RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA וגמינין במחשבי PDO. שיטות אלה מעריכות את האורגנואיד השלם ומאפשרות לחקור מנגנוני DDR בסביבה דומה יותר למיקרו-סביבה של הגידול in vivo. יחד עם מיקרוסקופ קונפוקלי וספירת מוקדים אוטומטית, מתודולוגיה זו יכולה לסייע בהבנת מסלול DDR בסרטן השחלות והתאמה אישית של תוכניות הטיפול למטופלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמת הגידול ומיימת התקבלו לאחר קבלת הסכמת המטופל כחלק ממאגר ביולוגי אונקולוגי אונקולוגי שאושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ועדת הביקורת המוסדית (IRB). המטופלות נכללו אם היה להן סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה בשלב מתקדם (HGSOC). כל ההליכים בוצעו בטמפרטורת החדר על הספסל, אלא אם כן צוין אחרת. כל הריאגנטים הוכנו בטמפרטורת החדר (אלא אם צוין אחרת) ואוחסנו ב -4 מעלות צלזיוס.
1. דור אורגנואידים
- צור את האורגנואידים בעקבות הדו"ח שפורסם בעבר20.
2. ציפוי והקרנה של אורגנואידים
- באמצעות אורגנואידים בתרבית, עקרו את לשוניות האורגנואידים מתבשיל התרבית באמצעות מניפולציה ידנית של קצה פיפטה. לאסוף את האורגנואידים בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בעזרת פיפטה, שואפים בזהירות מהסופרנאטנט.
- הוסיפו לגלולה 1,000 מיקרוליטר של אנזים רקומביננטי ללא מקור מן החי (ראו טבלת חומרים). מערבבים את התמיסה ודגרים במשך 15 דקות בחום של 37°C.
- צנטריפוגה את התמיסה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בעזרת פיפטה, בזהירות לשאוף את supernatant.
- לאחר צנטריפוגה ושאיפה, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1,000 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט.
- מעבירים 10 μL של התמיסה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ומערבבים עם 10 μL של כחול טריפאן.
- קח 10 μL של תמיסת התא הכחול טריפאן לתוך תא ספירת תאים לשקופית והכנס אותו למכונת ספירת התאים (ראה טבלת חומרים).
- צלחת 40,000 תאים לכל 20 מיקרוליטר של תמצית קרום מרתף (BME) לתוך שקופית תא זכוכית 8 בארות (ראה טבלה של חומרים). זה שומר על האורגנואידים במשך 3-5 ימים כדי לאפשר לתאים ליצור אורגנואידים ולגדול לגודל מתאים.
- כדי לגרום לשברי דנ"א דו-גדיליים, הקרינו את האורגנואידים המצופים ב-10 קרינת קרינה אפורה (Gy) (ראו טבלת חומרים לפרטים על הקרן).
הערה: פעולה זו עשויה להימשך עד 5-10 דקות. - לדגור על האורגנואידים במדיה התרבית שלהם באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 4 שעות.
3. צביעה immunofluorescence
הערה: נפחים מתייחסים לכמות לבאר של שקופית תא 8 בארות (~ 300 μL).
- לאחר הקרנה ודגירה של אורגנואידים, לשאוף את התקשורת עם פיפטה, בזהירות כדי לא לשבש את המטריצה 3D. יש לשטוף עם 300 μL של PBS.
- תקן את האורגנואידים ב 300 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) למשך 10 דקות.
הערות: אל תעזוב זמן רב מדי, מכיוון שה- BME יתפרק ועלול להישאף. - שטפו את האורגנואידים עם 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה (ראו טבלת חומרים). מניחים על שייקר למשך 5 דקות.
- לחדירה, הוסיפו בעדינות 300 מיקרוליטר של חיץ חדירות (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך 20 דקות. יש לשטוף עם 300 μL של חיץ צביעה. מניחים על שייקר למשך 5 דקות.
- הוסף 300 μL של חיץ צביעה כדי לחסום את שלב החדירה. מניחים על שייקר למשך 30 דקות. יש לשאוף את חיץ הכתמים באמצעות פיפטה.
- הוסף 300 μL של נוגדנים ראשוניים (ארנב נגד RAD51, עכבר אנטי Geminin, ארנב anti-RPA, עכבר anti-ɣH2AX, ארנב anti-Geminin, עכבר anti-53BP1; ראה טבלה של חומרים) מדולל במאגר צביעה. לדגור ב 4 ° C במשך 16 שעות.
הערה: הימנעו מכתמים משותפים עם אותה חיה מארחת. השאירו את המכסה כדי למנוע מהנוגדנים להתערבב בבארות שכנות. - הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית. יש לבצע שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים למשך 5 דקות כל אחת על השייקר.
- הוסף 300 μL של נוגדן משני (עז נגד עכבר Alexa fluor 488 ו עז נגד ארנב Alexa fluor 647; ראה טבלה של חומרים) פתרון מדולל בחיץ צביעה לדגור במשך 1 שעה בחושך.
הערה: יש לבצע את כל השלבים הבאים בחושך. - לשאוף את פתרון הנוגדנים המשני. הוסף 300 μL של DAPI מדולל. מניחים על שייקר למשך 5 דקות.
- יש לבצע שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים למשך 5 דקות כל אחת על השייקר. הסר את חיץ הצביעה ונתק את התאים באמצעות ערכת ההסרה המצורפת לשקופיות התא (ראה טבלת חומרים).
הערה: הקפד לא לדחוף יותר מדי קדימה כדי לשבש את המטריצה התלת-ממדית. - בעזרת קצה פיפטה p200 עם קצה חתוך, הוסיפו אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) כדי לכסות כל באר בלשונית אורגנואיד (למשל, 20-30 מיקרוליטר לכל לשונית אורגנואידים).
- הניחו כיסוי מעל הדגימה, והימנעו מבועות.
- יש לקחת לק שקוף ולצבוע אותו על צידי זכוכית הכיסוי כדי לאטום את המגלשה. תן לו להתקשות במשך 1 שעה ומניחים אותו ב -20 ° C.
הערה: לאחר ההדמיה, ניתן לאחסן את השקופית למשך 6 חודשים לפחות עם אובדן מינימלי של פלואורסצנטיות.
4. הדמיה
- קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) במטרה של 63x עם שמן טבילה.
הערה: אם הדמיה של חלבונים גרעיניים, 63x הוא יתרון, אבל 40x הוא גם מקובל. - השתמש ב- DAPI כדי לאתר את האורגנואידים דרך העינית. בחר את המסננים המתאימים למיקרוסקופ בהתבסס על הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש. קבעו את הפרמטרים ללכידת תמונות z-stack.
הערה: הפלואורופורים ששימשו במחקר היו DAPI, 488 ו-647. הלייזרים 405, 488 ו-638 הופעלו כדי להמחיש את הצביעה.
הערה: מחסנית z המומלצת תלויה בעוצמת הפתרון. - התאם את התמונה החיה: הגדר מיקוד, עוצמת לייזר וכו '.
הערה: ככל שעוצמת הלייזר גבוהה יותר, כך גדל הסיכוי שהדגימה תצלם אקונומיקה. לכן, בחר עוצמת לייזר אופטימלית. - רכוש את ערימת z.
הערה: פעולה זו עשויה להימשך עד 5-10 דקות. - מתוך התמונות שנאספו בערימת z, צילום מסך לפחות שלוש תמונות לכל ערימה.
הערה: הקפד להשיג צילומי מסך בכל הערימה כדי לא לשכפל את הגרעינים בעת הכימות. - שמור כל קובץ כ- TIFF והמשך לניתוח (שלב 5).
5. ניתוח
הערה: השתמש ב- JCountPro לכל ניתוח תמונות בעקבות דוח21 שפורסם בעבר. כדי להשיג תוכנה זו, עיין בפרסום המשויך.
- תחת לוח ניתוח האובייקטים (החלק העליון של התוכנית) בכרטיסייה בחירת קבצים (בחלק התחתון של התוכנית), בחר את קבצי TIFF .
- לחץ על הוסף כדי להעביר את הקבצים שנבחרו לקבוצת הקבצים שנבחרה. בחר תצוגה.
- תחת הכרטיסיה סגמנטציה, בחר כחול כצבע הגרעינים. בחר סגמנטציה אוטומטית כדי למטב את סף הגרעינים.
הערה: אם הסגמנטציה האוטומטית אינה מזהה במדויק את האובייקטים, המשתמש יכול להתאים את הכוונון העדין והגולמי לתמונה או לעיין במדריך למשתמש כדי למטב עוד יותר את הסגמנטציה. - בחלונית 'אובייקטים', בחרו 'פיצול אוטומטי של עצמים גדולים' ומיטוב גודל הגרעינים.
הערה: לגרעינים יש בדרך כלל גודל בלתי מותנה של 5,000 פיקסלים, בעוד שהגודל המותנה הוא 1,500 פיקסלים. עיין במדריך למשתמש כדי למטב עוד יותר את גודל האובייקטים. - בחר זהה אובייקטים כדי לבדוק את הפרמטרים.
הערה: אם פרמטרים אלה אינם מדויקים, ניתן להתאים את הגודל והכוונון יחד עם הגדרות אחרות. עיין במדריך למשתמש לקבלת הוראות בנוגע למיטוב נוסף. - לאחר התאמת הפרמטרים לתמונה, בחרו 'זהה עצמים בכל התמונות ' כדי לזהות את הגרעינים בכל התמונות שנבחרו.
- בחר בחלונית ניתוח מוקדים (בחלק העליון של התוכנית).
- תחת הכרטיסיה בחירת קבצים (תחתית התוכנית), בחר את קובצי TIFF ששימשו לניתוח אובייקטים ובחר בלחצני החצים (>>) כדי להעביר את התמונות לקבוצה קבצי תמונה.
- בקבוצת הספריות שמתחת לקובצי התמונה שהועברו, לחצו פעמיים על התיקייה Manual Edit ובחרו להעביר את קובצי ioc לקבוצה 'קובצי אוסף אובייקטים'.
הערה: כל קובצי ה- TIFF שנבחרו חייבים להיות תואמים. - הקש Select כדי להעביר את הקבצים לקבוצת הקבצים שנבחרה. בחר את הכרטיסייה ספירת מוקדים בתחתית התוכנית.
- מטב את הפרמטרים לפי השלבים הבאים.
- מדד הגדרות הכובע העליון: 12.
- ערוץ מיקוד: בחר את צבע המוקדים (ירוק: ɣ-H2AX; אדום: RAD51).
- הגדרות כיפה H: גובה הכיפה %: 30; אחוז חסימה %: 28 ו-28.
- הגדרת צורה/גודל: גודל מיקוד מינימלי, פיקסלים: 5. בחר החל צורה/גודל. גודל מיקוד מרבי (מותנה): 32. מעוגלות מינימלית, x100: 96. מיקוד מרבי, פיקסלים: 60.
- מסנן רעש: גודל 1.
הערה: אם קובעים אם גרעין חיובי לצביעת גמינין, תחת הערוץ השני בחר ירוק, ותחת ניתוח בחר עוצמה.
- כדי לבדוק את הגדרת הפרמטרים, בחר את הלחצנים הבאים לפי הסדר: כובע עליון > H-Dome > Foci Count.
הערה: אם פרמטרים אלה אינם פועלים, ניתן להתאים את הגודל והכוונון יחד עם הגדרות אחרות. עיין במדריך למשתמש כדי ללמוד עוד על האופן שבו ניתן למטב את התמונה עוד יותר. - לאחר מיטוב הפרמטרים לתמונות שנבחרו, בחרו 'ספירה אוטומטית ' כדי לספור את המוקדים בכל תמונה לכל גרעינים. אם רוצים את הערוץ השני, התוכנית תקבע את העוצמה שבה ניתן להשתמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג יכול להכתים, לדמיין ולכמת בהצלחה חלבונים לתיקון נזקי DNA גרעיניים באורגנואידים. טכניקה זו שימשה כדי להכתים ולהעריך PDOs הן לפני ואחרי הקרנה. PDOs נחשפו לקרינה של 10 Gy והוערכו עבור הסמנים הביולוגיים הבאים: ɣ-H2AX (איור 1), סמן של נזק לדנ"א; RAD51 (איור 2), סמן עבור HRR; 53BP1, סמן של NHEJ; RPA, סמן של עקה שכפול (איור 3); וג'מינין, סמן מחזור תא פאזה G2/S14. המינון של 10 Gy נבחר על סמך מחקר שפורסם בעבר בדק נזק לדנ"א בסרטן השחלות 6,22. תוכנת JCountPro שימשה לזיהוי הגרעין ולכימות מספר המוקדים בתוך הגרעין באמצעות פרמטרים מאוירים13 (איור 4). התוכנה מזהה את הגרעין (איור 4A,B), ולאחר מכן את המוקדים הגרעיניים (איור 4C), ומסננת את המוקדים מתאים חיוביים לגמינין (איור 4D).
איור 1: מוקדי ɣ-H2AX ב-PDO לפני ואחרי הקרנה. תמונות מייצגות של מוקדי DAPI ו-ɣ-H2AX במוקדי PDO לפני ואחרי הקרנה ב-10x עם כניסות 63x. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מוקדי RAD51 וגמינין ב-PDO לפני ואחרי הקרנה. תמונות מייצגות של DAPI, geminin, RAD51 וצביעה משותפת של מוקדי geminin/RAD51 PDO לפני ואחרי הקרנה ב-10x עם כניסות 63x. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: RPA ו-53BP1 ב-PDOs לפני ואחרי הקרנה. תמונות מייצגות של (A) DAPI, RPA; (B) גמינין, 53BP1, וצביעה משותפת של מוקדי גמינין/53BP1 ב-10x עם כניסות 63x. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זרימת העבודה לכימות תוכנת JCountPro. (A) תחת ניתוח האובייקטים, הערוץ הכחול נבחר כדי לזהות את העצמים הכחולים, גרעינים, ואז הוא ממוטב אוטומטית על ידי בחירת הסגמנטציה האוטומטית (חץ אדום). (B) תחת פיצול אוטומטי, גודל האובייקט (גרעינים) מותאם לגודל התמונה ולהגדלה. הלחצן 'זהה עצמים' נבחר כדי לבדוק את הפרמטרים (1), והלחצן 'זהה עצמים בכל התמונות' (חץ אדום) נבחר כדי לזהות עצמים (גרעינים) לכל תמונה. (C) תחת כרטיסיית ניתוח מוקדים, התמונות מוזנות ופרמטרים של ספירת מוקדים מוגדרים: ראשית, צבע המוקדים נבחר מתחת לערוץ המיקוד, ירוק; מדד הכובעים המובילים נקבע על 12; הגדרות כיפת H נקבעות להיות בעלות אחוז גובה כיפה של 30 ואחוז סף של 28; הצורה והגודל של המוקדים ממוטבים לגודל התמונה עם הפרמטרים הידניים של גודל מיקוד מרבי פיקסלים ב- 60 ומעוגלות מינימלית x 100 ב- 96; לבסוף, מסנן הרעש מוחל. ההגדרות נבדקות על ידי החלת הכובע העליון, כיפת H וספירת מוקדים (1-3). כדי לכמת את מוקדי ɣ-H2AX לכל תא, הקש על התחל (חץ אדום). (D) עבור מוקדי RAD51, ההגדרות מוחלות כפי שמודגם עבור מוקדי ɣ-H2AX, למעט ערוץ המיקוד שמשתנה לאדום; עם זאת, כדי לזהות גרעינים המוכתמים בגמינין, הערוץ השני נבחר לירוק, והניתוח משתנה לעוצמה. הפרמטרים נבדקים על ידי החלת הכובע העליון, כיפת H וספירת המוקדים (1-3), ולאחר מכן לחיצה על התחל (חץ אדום) כדי לכמת את כל מוקדי RAD51 ולהעריך את עוצמת הירוק לכל תא בכל תמונה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תגובת הנזק לדנ"א ממלאת תפקיד אינטגרלי הן בהתפתחות סרטן השחלות והן בעמידות לכימותרפיה. לכן, הבנה מעמיקה של מנגנוני תיקון DNA היא הכרחית. כאן מוצגת מתודולוגיה לחקר חלבונים לתיקון נזקי דנ"א באורגנואידים תלת-ממדיים שלמים. פרוטוקול אמין הניתן לשחזור פותח תוך שימוש בנוגדנים סימן היכר להערכת נזק לדנ"א, רקומבינציה הומולוגית, חיבור קצה לא הומולוגי ועקה של שכפול. חשוב לציין, שיטות אלה מאומתות באמצעות בקרות מהונדסות-גנטית המדגימות את הספציפיות והרגישות של שיטות אלה.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא ציפוי וקיבוע של האורגנואידים. פרוטוקול זה דוגר באופן ספציפי על אורגנואידים ב-2% PFA למשך 10 דקות עם ניטור צמוד של תמצית קרום המרתף (BME) במהלך תהליך הקיבוע. זה שונה מפרוטוקולים אחרים של אימונופלואורסנציה באורגנואידים המציעים שימוש ב-4% PFA למשך 10-60 דקות23,24,25. נמצא כי אם הכרטיסיות של BME נמצאות בכמות מרוכזת של PFA במשך זמן רב מדי, הכרטיסיות מתפרקות ונתונות לשאיפה. יש לציין כי יצרנים של BME ספציפיים מציעים לעתים קרובות הצעות לגבי קיבוע. נקודה חשובה נוספת לדיון היא ציפוי האורגנואידים. תהליך הצביעה יכול לגרום לאיבוד חלק או את כל האורגנואידים. לכן, ככל שהלשונית מתמזגת יותר בזמן הציפוי, כך גדל הסיכוי שהמדגם יעמוד בהצלחה בשלבי הצביעה.
נקודות החוזק של פרוטוקול זה כוללות אימות של צביעת נוגדנים גרעיניים, היכולת לבצע immunofluorescence והדמיה של אורגנואידים 3D שלם, ואת ההתאמה של הפרוטוקול לכל טיפול או מולקולה של עניין.
הנוגדנים ששימשו בניסויים אלה אומתו בקפדנות לספציפיות באמצעות תאי סרטן שחלות מהונדסים גנטית. השיטות אומתו עוד יותר לרגישות על ידי חשיפת PDO למינונים הולכים וגדלים של קרינה. זה הביא להגדלת מוקדי ɣ-H2AX, RAD51 ו-RPA ב-PDO מיומנים ב-HRR. לבסוף, שיטות הכימות האובייקטיביות מקלות על יכולת השחזור של בדיקה זו ונמנעות מההטיה הסובייקטיבית של כימות ידני.
שיטות מסורתיות לחקור את ה- DDR הן באמצעות תנאי תרבית דו-ממדיים הידועים כקווי תאים, אך אין להם את היכולת לשמור על ההטרוגניות הגנטית של הגידול המקורי. המיקרו-סביבה של הגידול חיונית בגידולים ובעמידות לכימותרפיה בסרטן השחלות26,27,28, ולכן, מודלים אלה מציעים יתרון לתרביות תאים הומוגניות דו-ממדיות בעת לימוד ה- DDR. כאשר לומדים את ה- DDR, יש צורך לשלוט במחזור התא על מנת למנוע סיווג שגוי של חוסר היכולת לבצע סוגים ספציפיים של תיקון DNA שהם ספציפיים למחזור התא (כלומר, HRR). עבודה עתידית מתמקדת בחקר סוגים ספציפיים של נגעי DNA הנגרמים על ידי כימותרפיה פלטינה, מעכבי פולימראז (ADP-ריבוז) פולימראז, או הידרוקסיוריאה.
לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאמה לחקר כל אנטיגן הניתן לשינוי לאימונופלואורסנציה מסורתית ויכול להתאים לחקר טיפולים תרופתיים חדשניים. הפרוטוקול המוצג מתמקד בחלבוני DDR, אך עם שינוי פשוט של נוגדנים, פרוטוקול זה יכול להשתנות כדי לחקור חלבונים אחרים, גליקנים ומולקולות קטנות. בנוסף, מכיוון שהאורגנואידים הם מודלים תלת-ממדיים הטרוגניים המתורבתים במבחנה, כל טיפול באורגנואידים אפשרי, כולל אימונותרפיה, טיפול אנטי-אנגיוגנטי, טיפול מטבולומי וטיפולים חדשניים אחרים שקשה להעריך בקווי תאים הומוגניים 29,30,31.
מגבלות שיטה זו כוללות שימוש ב- BME עם הרכב לא עקבי וצביעה לא ספציפית. כמו BMEs מסחריים מיוצרים קווי תאים, ההרכב של כל יחידה יכול להשתנות מאוד. הבדלים אלה יכולים להשפיע על הקיבוע והצביעה, כמו גם על יצירת אורגנואידים. בנוסף, בהתאם לדגימה, יכול להיות צביעה לא ספציפית של BME, אשר יכול לחסום את החלבון של עניין. עם זאת, הכתם הגרעיני הוא ספציפי מאוד ומדגים מוקדים גרעיניים ברורים שניתן לכמת בקלות.
לסיכום, מוצג פרוטוקול מפורט להערכת חלבוני DDR באורגנואידים. ככל שהטכנולוגיה תתקדם, צפוי כי אורגנואידים יוכלו לשמש להערכת תיקון נזק לדנ"א של תאים חיים במודלים תלת-ממדיים אלה. בנוסף, כשיטה היעילה ביותר לתרבית, יתבססו האורגנואידים, ויתאפשרו בדיקות מתוחכמות יותר כגון סיבי DNA ומבחני פער שכפול32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה על הדרכתו של פאבל לובצ'בסקי, PhD בהקמת פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון, לקרן קבוצת אונקולוגיה גינקולוגית ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
