Summary
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.
Abstract
Immunofluorescentie is een van de meest gebruikte technieken om doelantigenen met een hoge gevoeligheid en specificiteit te visualiseren, waardoor de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van eiwitten, glycanen en kleine moleculen mogelijk is. Hoewel deze techniek goed ingeburgerd is in tweedimensionale (2D) celcultuur, is er minder bekend over het gebruik ervan in driedimensionale (3D) celmodellen. Eierstokkankerorganoïden zijn 3D-tumormodellen die de klonale heterogeniteit van tumorcellen, de micro-omgeving van de tumor en cel-cel- en cel-matrixinteracties samenvatten. Ze zijn dus superieur aan cellijnen voor de evaluatie van medicijngevoeligheid en functionele biomarkers. Daarom is het vermogen om immunofluorescentie te gebruiken op primaire eierstokkankerorganoïden uiterst gunstig voor het begrijpen van de biologie van deze kanker. De huidige studie beschrijft de techniek van immunofluorescentie om DNA-schadehersteleiwitten te detecteren in hoogwaardige sereuze patiënt-afgeleide ovariumkankerorganoïden (PDO's). Na blootstelling van de BOB's aan ioniserende straling, wordt immunofluorescentie uitgevoerd op intacte organoïden om nucleaire eiwitten als foci te evalueren. Beelden worden verzameld met behulp van z-stack imaging op confocale microscopie en geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde foci-telsoftware. De beschreven methoden maken de analyse van temporele en speciale rekrutering van DNA-schadehersteleiwitten en colocalisatie van deze eiwitten met celcyclusmarkers mogelijk.
Introduction
Eierstokkanker is de belangrijkste doodsoorzaak als gevolg van gynaecologische maligniteit. De meerderheid van de patiënten wordt behandeld met DNA-beschadigende geneesmiddelen zoals carboplatine, en degenen met homologe recombinatieherstel (HRR)-deficiënte tumoren kunnen poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -remmers 1,2 krijgen. De meeste patiënten ontwikkelen echter resistentie tegen deze therapieën en sterven binnen 5 jaar na de diagnose. Ontregeling van de DNA-schaderespons (DDR) is in verband gebracht met de ontwikkeling van eierstokkanker en zowel chemotherapie als PARP-remmerresistentie3. Studie van de DDR is dus noodzakelijk om de pathofysiologie van eierstokkanker, potentiële biomarkers en nieuwe gerichte therapieën te begrijpen.
De huidige methoden om de DDR te evalueren maken gebruik van immunofluorescentie (IF), omdat dit de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van DNA-schade-eiwitten en nucleotide-analogen mogelijk maakt. Zodra er een dubbelstrengsbreuk (DSB) in het DNA is, wordt het histoneiwit H2AX snel gefosforyleerd en vormt het een focus waar DNA-schadehersteleiwitten samenkomen4. Deze fosforylering kan eenvoudig worden geïdentificeerd met behulp van IF; in feite is de ɣ-H2AX-test vaak gebruikt om de inductie van een DSB 5,6,7,8,9 te bevestigen. Verhoogde DNA-schade is in verband gebracht met platinagevoeligheid en werkzaamheid van DNA-schadelijke stoffen 10,11,12, en ɣ-H2AX is voorgesteld als een biomarker geassocieerd met chemotherapierespons in andere kankerbehandelingen 13. Bij een DSB voert een cel die bedreven is in HRR een reeks gebeurtenissen uit die ertoe leiden dat BRCA1 en BRCA2 RAD51 rekruteren om replicatie-eiwit A (RPA) te vervangen en aan het DNA te binden. HRR-reparatie maakt gebruik van een DNA-sjabloon om de DSB getrouw te repareren. Wanneer tumoren echter een tekort aan HRR hebben, vertrouwen ze op alternatieve reparatieroutes zoals niet-homologe eindverbinding (NHEJ). Van NHEJ is bekend dat het foutgevoelig is en een hoge mutatiebelasting op de cel creëert, die 53BP1 als positieve regulatorgebruikt 14. Deze DNA-schade-eiwitten kunnen allemaal nauwkeurig worden geïdentificeerd als foci met behulp van IF. Naast kleuring voor eiwitten, kan IF worden gebruikt om vorkbescherming en enkelstrengs DNA-kloofvorming te bestuderen. Het vermogen om stabiele vorken te hebben is gecorreleerd met platinarespons en onlangs hebben gap-assays het potentieel aangetoond om de respons op PARP-remmers 6,15,16,17 te voorspellen. Daarom is kleuring voor de nucleotide-analogen na introductie in het genoom een andere manier om de DDR te bestuderen.
Tot op heden is de evaluatie van de DDR bij eierstokkanker grotendeels beperkt gebleven tot homogene 2D-cellijnen die de klonale heterogeniteit, micro-omgeving of architectuur van in vivo tumoren niet samenvatten18,19. Recent onderzoek suggereert dat organoïden superieur zijn aan 2D-cellijnen bij het bestuderen van complexe biologische processen zoals DDR-mechanismen6. De huidige methodologie evalueert RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA en geminin in BOB's. Deze methoden beoordelen de intacte organoïde en maken de studie van DDR-mechanismen mogelijk in een omgeving die meer lijkt op de in vivo tumormicro-omgeving. Samen met confocale microscopie en geautomatiseerde foci-telling kan deze methodologie helpen bij het begrijpen van de DDR-route bij eierstokkanker en het personaliseren van behandelplannen voor patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorweefsel en ascites werden verkregen na het verkrijgen van toestemming van de patiënt als onderdeel van een gynaecologische oncologische biorepository die werd goedgekeurd door de Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Patiënten werden geïncludeerd als ze een vergevorderd stadium hadden van hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur op de bank, tenzij anders aangegeven. Alle reagentia werden bereid bij kamertemperatuur (tenzij anders aangegeven) en bewaard bij 4 °C.
1. Organoïde generatie
- Genereer de organoïden volgens het eerder gepubliceerde rapport20.
2. Beplating en bestraling van organoïden
- Gebruik organoïden in cultuur en maak de tabbladen van de organoïden los van de kweekschaal door handmatige manipulatie van een pipetpunt. Verzamel de organoïden in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de conische buis bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig met behulp van een pipet het supernatant voorzichtig af.
- Voeg 1.000 μL van een dierlijk, recombinant enzym toe aan de pellet (zie materiaaltabel). Meng de oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig af te zuigen.
- Na centrifugeren en aspiratie, resuspendeerde de pellet in 1.000 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
- Breng 10 μL van de oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng met 10 μL trypan blauw.
- Neem 10 μL van de trypan blue cell solution in een celtelkamerschuif en steek deze in de celtelmachine (zie Tabel met materialen).
- Plaat 40.000 cellen per 20 μL keldermembraanextract (BME) in een 8-well glazen kamerschuif (zie Materiaaltabel). Dit houdt de organoïden gedurende 3-5 dagen in stand om de cellen organoïden te laten vormen en tot een geschikte grootte te laten groeien.
- Om dubbelstrengs DNA-breuken te induceren, straalt u de vergulde organoïden uit met 10 grijze (Gy) ɣ-bestraling (zie materiaaltabel voor bestralingsdetails).
OPMERKING: Dit kan tot 5-10 minuten duren. - Incubeer de organoïden in hun kweekmedia in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 uur.
3. Immunofluorescentiekleuring
OPMERKING: Volumes verwijzen naar de hoeveelheid per put van de 8-well chamber slide (~300 μL).
- Na bestraling en incubatie van de organoïden, zuig de media op met een pipet, voorzichtig om de 3D-matrix niet te verstoren. Wassen met 300 μL PBS.
- Fixeer de organoïden in 300 μL van 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten.
OPMERKINGEN: Laat niet te lang staan, omdat de BME zal depolymeriseren en kan worden afgezogen. - Was de organoïden met 300 μL kleuringsbuffer (zie materiaaltabel). Plaats gedurende 5 minuten op een shaker.
- Voeg voor permeabilisatie voorzichtig 300 μL permeabilisatiebuffer toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 20 minuten. Wassen met 300 μL kleurbuffer. Plaats gedurende 5 minuten op een shaker.
- Voeg 300 μL kleuringsbuffer toe om de permeabilisatiestap te blokkeren. Plaats op een shaker gedurende 30 min. Zuig de vlekbuffer af met behulp van een pipet.
- Voeg 300 μL primaire antilichamen toe (konijn anti-RAD51, muis anti-Geminin, konijn anti-RPA, muis anti-ɣH2AX, konijn anti-Geminin, muis anti-53BP1; zie Tabel van Materialen) verdund in kleuringsbuffer. Incubeer bij 4 °C gedurende 16 uur.
OPMERKING: Vermijd co-kleuring met hetzelfde gastheerdier. Laat het deksel eraf om te voorkomen dat de antilichamen zich mengen in naburige putten. - Verwijder de primaire antilichaamoplossing. Voer drie wasbeurten uit met 300 μL kleuringsbuffer gedurende 5 minuten elk op de shaker.
- Voeg 300 μL secundaire antilichaam (geit anti-muis Alexa fluor 488 en geit anti-konijn Alexa fluor 647; zie tabel met materialen) oplossing verdund in kleurbuffer en incubeer gedurende 1 uur in het donker.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten in het donker worden uitgevoerd. - Zuig de secundaire antilichaamoplossing op. Voeg 300 μL verdunde DAPI toe. Plaats gedurende 5 minuten op een shaker.
- Voer drie wasbeurten uit met 300 μL kleuringsbuffer gedurende 5 minuten elk op de shaker. Verwijder de vlekbuffer en maak de kamers los met behulp van de verwijderingskit die bij de kamerglaasjes is geleverd (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet te ver naar voren duwt om de 3D-matrix te verstoren. - Gebruik een p200-pipetpunt met de punt afgesneden punt om montagemedium toe te voegen (zie materiaaltabel) om elk putje te bedekken met een organoïde lipje (bijvoorbeeld 20-30 μL voor elk organoïde tabblad).
- Plaats een coverslip over het monster en vermijd bubbels.
- Neem doorzichtige nagellak en verf deze op de zijkanten van het dekglas om de dia af te dichten. Laat het 1 uur uitharden en zet het op -20 °C.
OPMERKING: Na beeldvorming kan de dia ten minste 6 maanden worden bewaard met minimaal verlies van fluorescentie.
4. Beeldvorming
- Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop (zie Materiaaltabel) op 63x objectief met dompelolie.
OPMERKING: Als u nucleaire eiwitten afbeeldt, is 63x voordelig, maar 40x is ook acceptabel. - Gebruik DAPI om de organoïden door het oculair te lokaliseren. Selecteer de juiste filters voor microscopie op basis van de gebruikte fluoroforen. Stel de parameters in voor het vastleggen van de z-stack-afbeeldingen.
OPMERKING: De fluoroforen die in de studie werden gebruikt, waren DAPI, 488 en 647. De lasers 405, 488 en 638 werden ingeschakeld om de kleuring te visualiseren.
OPMERKING: De aanbevolen z-stack is afhankelijk van het oplossend vermogen van het doel. - Pas het live beeld aan: stel focus in, laserintensiteit, etc.
OPMERKING: Hoe hoger de laserintensiteit, hoe groter de kans dat het monster fotobleekt. Kies daarom een optimale laserintensiteit. - Verkrijg de z-stack.
OPMERKING: Dit kan tot 5-10 minuten duren. - Van de afbeeldingen die in de z-stack zijn verzameld, screenshot ten minste drie afbeeldingen per stapel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u screenshots in de hele stapel verkrijgt om de kernen niet te dupliceren bij het kwantificeren. - Sla elk bestand op als een TIFF en ga verder met de analyse (stap 5).
5. Analyse
OPMERKING: Gebruik JCountPro voor alle beeldanalyse na het eerder gepubliceerde rapport21. Om deze software te verkrijgen, raadpleegt u de bijbehorende publicatie.
- Selecteer onder het deelvenster objectanalyse (boven aan het programma) op het tabblad bestandsselectie (onder aan het programma) de TIFF-bestanden .
- Klik op Toevoegen om de geselecteerde bestanden naar de geselecteerde bestandengroep te verplaatsen. Selecteer Beeldscherm.
- Selecteer op het tabblad Segmentatie de optie blauw als de kleur van de kernen. Selecteer Automatische segmentatie om de drempel van de kernen te optimaliseren.
OPMERKING: Als de automatische segmentatie de objecten niet nauwkeurig identificeert, kan de gebruiker de fijnafstelling en onbewerkte afstemming op de afbeelding aanpassen of de gebruikershandleiding raadplegen om de segmentatie verder te optimaliseren. - Selecteer onder het deelvenster Objecten de optie Grote objecten automatisch splitsen en optimaliseer de grootte van de kernen.
OPMERKING: De kernen hebben meestal een onvoorwaardelijke grootte van 5.000 pixels, terwijl de voorwaardelijke grootte 1.500 pixels is. Zie de gebruikershandleiding om de grootte van de objecten verder te optimaliseren. - Selecteer Objecten identificeren om de parameters te testen.
OPMERKING: Als deze parameters niet nauwkeurig zijn, kunnen de grootte en afstemming samen met andere instellingen worden aangepast. Zie de gebruikershandleiding voor instructies met betrekking tot verdere optimalisatie. - Nadat u de parameters voor de afbeelding hebt aangepast, selecteert u Objecten in alle afbeeldingen identificeren om de kernen in alle geselecteerde afbeeldingen te identificeren.
- Selecteer het deelvenster Foci-analyse (boven aan het programma).
- Selecteer op het tabblad Bestanden selecteren (onder aan het programma) de TIFF-bestanden die zijn gebruikt voor objectanalyse en selecteer de pijlknoppen (>>) om de afbeeldingen naar de groep afbeeldingsbestanden te verplaatsen.
- Dubbelklik in de mapgroep onder de verplaatste afbeeldingsbestanden op de map Handmatig bewerken en selecteer deze optie om de ioc-bestanden naar de groep objectverzamelingsbestanden te verplaatsen.
OPMERKING: Alle geselecteerde TIFF's moeten overeenkomen met ioc-bestanden. - Druk op Selecteren om de bestanden naar de geselecteerde bestandengroep te verplaatsen. Selecteer het tabblad Foci-telling onder aan het programma.
- Optimaliseer de parameters door de onderstaande stappen te volgen.
- Top hat instellingen index: 12.
- Focuskanaal: Selecteer de kleur van de foci (groen: ɣ-H2AX; rood: RAD51).
- H-koepelinstellingen: koepelhoogte %: 30; drempel %: 28 en 28.
- Vorm/grootte instelling: Min focus grootte, pixels: 5. Selecteer Vorm/Grootte toepassen. Maximale scherpstelgrootte (voorwaardelijk): 32. Min rondheid, x100: 96. Maximale scherpstelling, pixels: 60.
- Ruisfilter: maat 1.
OPMERKING: Als u bepaalt of een kern positief is voor gemininekleuring, selecteert u onder het tweede kanaal groen en selecteert u onder analyse intensiteit.
- Om de ingestelde parameters te testen, selecteert u de onderstaande knoppen in volgorde: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
OPMERKING: Als deze parameters niet werken, kunnen de grootte en afstemming samen met andere instellingen worden aangepast. Raadpleeg de gebruikershandleiding voor meer informatie over hoe de afbeelding verder kan worden geoptimaliseerd. - Zodra de parameters zijn geoptimaliseerd voor de geselecteerde afbeeldingen, selecteert u Automatisch tellen om de foci in elke afbeelding per kern te tellen . Als het tweede kanaal gewenst is, bepaalt het programma de intensiteit die kan worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gepresenteerde protocol kan met succes nucleaire DNA-schadehersteleiwitten in organoïden kleuren, visualiseren en kwantificeren. Deze techniek werd gebruikt om BOB's zowel voor als na de bestraling te kleuren en te evalueren. BOB's werden blootgesteld aan 10 Gy straling en geëvalueerd op de volgende biomarkers: ɣ-H2AX (figuur 1), een marker van DNA-schade; RAD51 (figuur 2), een marker voor HRR; 53BP1, een marker van NHEJ; RPA, een marker van replicatiestress (figuur 3); en geminine, een G2/S fase celcyclus marker14. De dosis van 10 Gy werd gekozen op basis van eerder gepubliceerd onderzoek naar DNA-schade bij eierstokkanker 6,22. JCountPro-software werd gebruikt om de kern te identificeren en het aantal foci binnen de kern te kwantificeren met geïllustreerde parameters13 (figuur 4). De software identificeert de kern (figuur 4A, B), vervolgens nucleaire foci (figuur 4C) en filtert de foci van geminine-positieve cellen (figuur 4D).
Figuur 1: ɣ-H2AX foci in BOB's voor en na bestraling. Representatieve beelden van DAPI en ɣ-H2AX foci in BOB's voor en na bestraling bij 10x met 63x inzetstukken. Schaalstaven: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RAD51-foci en geminine in BOB's voor en na bestraling. Representatieve beelden van DAPI, geminine, RAD51 en co-kleuring van geminine / RAD51 foci PDO's voor en na bestraling bij 10x met 63x inzetstukken. Schaalstaven: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: RPA en 53BP1 in BOB's voor en na bestraling. Representatieve beelden van (A) DAPI, RPA; (B) geminine, 53BP1, en co-kleuring van geminine/53BP1 foci bij 10x met 63x inzetstukken. Schaalstaven: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De kwantificeringsworkflow van de JCountPro-software . (A) Bij de objectanalyse wordt het blauwe kanaal geselecteerd om de blauwe objecten, kernen te identificeren, waarna het automatisch wordt geoptimaliseerd door de automatische segmentatie (rode pijl) te selecteren. (B) Bij automatische splitsing wordt de objectgrootte (kernen) aangepast aan de grootte van het beeld en de vergroting. De knop object identificeren is geselecteerd om de parameters te testen (1) en de knop objecten identificeren in alle afbeeldingen (rode pijl) is geselecteerd om objecten (kernen) voor elke afbeelding te identificeren. (C) Onder het tabblad foci-analyse worden de beelden ingevoerd en worden de parameters voor het tellen van foci ingesteld: eerst wordt de kleur van de foci geselecteerd onder het focuskanaal, groen; De Top Hat Index is ingesteld op 12; de H-koepelinstellingen zijn ingesteld op een koepelhoogtepercentage van 30 en een drempelpercentage van 28; de vorm en grootte van de foci zijn geoptimaliseerd voor de beeldgrootte met de handmatige parameters van maximale focusgrootte pixels bij 60 en minimale ronding x 100 bij 96; Tot slot wordt het ruisfilter toegepast. De instellingen worden getest door de hoge hoed, H-koepel en foci-telling (1-3) toe te passen. Om de ɣ-H2AX foci per cel te kwantificeren, drukt u op start (rode pijl). (D) Voor de RAD51-foci worden de instellingen toegepast zoals geïllustreerd voor ɣ-H2AX-foci, behalve het scherpstelkanaal dat in rood is veranderd; Om echter kernen te identificeren die zijn gekleurd met geminine, wordt het tweede kanaal geselecteerd voor groen en wordt de analyse gewijzigd in intensiteit. De parameters worden getest door de hoge hoed, H-koepel en foci-telling (1-3) toe te passen en vervolgens op start (rode pijl) te drukken om alle RAD51-foci te kwantificeren en de intensiteit van groen per cel in elke afbeelding te evalueren. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De DNA-schaderespons speelt een integrale rol bij zowel de ontwikkeling van eierstokkanker als chemotherapieresistentie. Daarom is een grondig begrip van DNA-reparatiemechanismen noodzakelijk. Hier wordt een methodologie gepresenteerd om DNA-schadehersteleiwitten in 3D, intacte organoïden te bestuderen. Een reproduceerbaar, betrouwbaar protocol wordt ontwikkeld met behulp van kenmerkende antilichamen om DNA-schade, homologe recombinatie, niet-homologe eindverbinding en replicatiestress te evalueren. Belangrijk is dat deze methoden worden gevalideerd met behulp van genetisch gemodificeerde controles die de specificiteit en gevoeligheid van deze methoden aantonen.
De meest kritische stap in dit protocol is de plating en fixatie van de organoïden. Dit protocol incubeert specifiek organoïden in 2% PFA gedurende 10 minuten met nauwlettende monitoring van het keldermembraanextract (BME) tijdens het fixatieproces. Dit verschilt van andere immunofluorescentieprotocollen in organoïden die suggereren 4% PFA te gebruiken gedurende 10-60 min23,24,25. Het is gebleken dat als de tabs van de BME te lang in een geconcentreerde hoeveelheid PFA zitten, de tabs depolymeriseren en onderhevig zijn aan aspiratie. Van belang is dat fabrikanten van specifieke BME's vaak suggesties doen met betrekking tot fixatie. Een ander belangrijk discussiepunt is de beplating van de organoïden. Het kleuringsproces kan resulteren in het verliezen van een deel of alle organoïden. Daarom, hoe meer confluent het tabblad op het moment van plating, hoe groter de kans dat het monster met succes de stappen van kleuring zal doorstaan.
De sterke punten van dit protocol zijn de validatie van nucleaire antilichaamkleuring, het vermogen om immunofluorescentie en beeldvorming van intacte 3D-organoïden uit te voeren en het aanpassingsvermogen van het protocol aan elke behandeling of molecuul van belang.
De antilichamen die in deze experimenten werden gebruikt, werden streng gevalideerd voor specificiteit met behulp van genetisch gemodificeerde eierstokkankercellen. De methoden werden verder gevalideerd voor gevoeligheid door BOB's bloot te stellen aan toenemende doses straling. Dit resulteerde in toenemende ɣ-H2AX, RAD51 en RPA foci in HRR-vaardige PDO's. Ten slotte vergemakkelijken de objectieve kwantificeringsmethoden de reproduceerbaarheid van deze bepaling en vermijden ze de subjectieve vertekening van handmatige kwantificering.
Traditionele methoden om de DDR te verkennen zijn door middel van 2D-kweekomstandigheden die bekend staan als cellijnen, maar ze hebben niet het vermogen om de genetische heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor te behouden. De micro-omgeving van de tumor is van vitaal belang bij tumorigenese en chemotherapieresistentie bij eierstokkanker 26,27,28, daarom bieden deze modellen een voordeel voor 2D-homogene celculturen bij het bestuderen van de DDR. Bij het bestuderen van de DDR is het noodzakelijk om te controleren op celcyclus om verkeerde classificatie te voorkomen van het onvermogen om specifieke soorten DNA-reparatie uit te voeren die celcyclusspecifiek zijn (d.w.z. HRR). Toekomstig werk is gericht op het bestuderen van specifieke soorten DNA-laesies veroorzaakt door platinachemotherapie, poly (ADP-ribose) polymeraseremmers of hydroxyurea.
Ten slotte is dit protocol aanpasbaar om elk antigeen te bestuderen dat kan worden aangepast aan traditionele immunofluorescentie en kan het de studie van nieuwe medicamenteuze therapieën mogelijk maken. Het gepresenteerde protocol richt zich op DDR-eiwitten, maar met een eenvoudige verandering van antilichamen kan dit protocol worden aangepast om andere eiwitten, glycanen en kleine moleculen te bestuderen. Bovendien, omdat de organoïden heterogene 3D-modellen zijn die in vitro zijn gekweekt, is elke behandeling van de organoïden mogelijk, inclusief immunotherapie, antiangiogene therapie, metabolomics-therapie en andere nieuwe therapieën die moeilijk te evalueren zijn in homogene cellijnen 29,30,31.
Beperkingen van deze methode zijn het gebruik van een BME met inconsistente samenstelling en niet-specifieke kleuring. Omdat commerciële BME's worden geproduceerd uit cellijnen, kan de samenstelling van elke eenheid enorm variëren. Deze verschillen kunnen van invloed zijn op de fixatie en kleuring, evenals op de productie van organoïden. Bovendien kan er, afhankelijk van het monster, niet-specifieke kleuring van de BME zijn, die het eiwit van belang kan belemmeren. Niettemin is de nucleaire kleuring zeer specifiek en vertoont duidelijke nucleaire foci die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd.
Tot slot wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om DDR-eiwitten in organoïden te evalueren. Naarmate de technologie vordert, wordt verwacht dat organoïden kunnen worden gebruikt om het herstel van dna-schade door levende cellen in deze 3D-modellen te evalueren. Bovendien, als de meest effectieve methode om te kweken, zullen de organoïden worden vastgesteld en zullen meer geavanceerde assays zoals DNA-vezel- en replicatiegap-assays mogelijk zijn32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de begeleiding van Pavel Lobatsjevski, PhD bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation en het Reproductive Scientist Development Program bedanken voor hun steun aan dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
