Basado en experimentos in vitro , este estudio reveló el mecanismo de la crocetina en la reparación del daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos al influir en la mitofagia, en la que la vía de señalización PINK1 / Parkin juega un papel importante.
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Artículo de método
Protección de las células miocárdicas H9c2 del estrés oxidativo por crocetina a través de la mitofagia mediada por la vía PINK1 / Parkin
En este artículo
Resumen
Resumen
Este estudio tuvo como objetivo explorar el efecto protector del estrés oxidativo de la crocetina en las células miocárdicas H9c2 mediadas porH2O2 a través de experimentos in vitro, y explorar más a fondo si su mecanismo está relacionado con el impacto de la mitofagia. Este estudio también tuvo como objetivo demostrar el efecto terapéutico del ácido cártamo sobre el estrés oxidativo en cardiomiocitos y explorar si su mecanismo está relacionado con el efecto de la mitofagia. Aquí, se construyó un modelo de estrés oxidativo basado enH2O2y se evaluó el grado de lesión por estrés oxidativo de los cardiomiocitos mediante la detección de los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CK), malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GSH Px). Se emplearon colorantes fluorescentes detectores de especies reactivas de oxígeno (ROS) DCFH-DA, colorante JC-1 y colorante TUNEL para evaluar el daño mitocondrial y la apoptosis. El flujo autofágico se midió mediante la transfección de adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Las proteínas relacionadas con la mitofagia se detectaron a través de Western blot e inmunofluorescencia. Sin embargo, la crocetina (0,1-10 μM) podría mejorar significativamente la viabilidad celular y reducir la apoptosis y el daño por estrés oxidativo causado porH2O2. En células con activación autofágica excesiva, la crocetina también podría reducir el flujo de autofagia y la expresión de proteínas relacionadas con la mitofagia PINK1 y Parkin, y revertir la transferencia de Parkin a las mitocondrias. La crocetina podría reducir el daño por estrés oxidativo mediado porH2O2y la apoptosis de las célulasH9c2, y su mecanismo estaba estrechamente relacionado con la mitofagia.
Introducción
El infarto agudo de miocardio (IAM) es una necrosis miocárdica potencialmente mortal causada por isquemia e hipoxia graves y persistentes en las arterias coronarias 1,2. La intervención coronaria percutánea (ICP) es una de las estrategias terapéuticas de primera línea para el IAM, y generalmente protege a los cardiomiocitos del daño isquémico 3,4. El miocardio distal carecerá de suministro de sangre y oxígeno si no se trata con prontitud y eficacia después del IAM, lo que conduce a necrosis isquémica y complicaciones cardiovasculares adicionales 5,6. Promover la recuperación de cardiomiocitos y minimizar el daño miocárdico irreversible después de perder la oportunidad quirúrgica de ICP ha sido un punto caliente de investigación. Después del IAM, los cardiomiocitos se encuentran en un estado de isquemia e hipoxia, lo que resulta en la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, la reducción de NAD + a NADPH y el aumento de la reducción de un solo electrón7. Como resultado, la reacción de reducción incompleta del oxígeno genera un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) y, en última instancia, conduce al daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos8. Una acumulación excesiva de ROS desencadena la peroxidación lipídica, alterando aún más la estructura y función de las membranas mitocondriales. El resultado es una apertura continua de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial y una disminución del potencial de la membrana mitocondrial, induciendo apoptosis y necrosis.
Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA), los inhibidores de los β receptores adrenérgicos, los antagonistas de la aldosterona y otros fármacos estándar en el IAM pueden ayudar a mejorar la función cardíaca después del infarto de miocardio y prevenir la aparición de eventos malignos, como arritmias y remodelación ventricular izquierda9. Sin embargo, la supervivencia y el pronóstico postinfarto se ven muy afectados por el tamaño del infarto, y no se han logrado resultados satisfactorios para reducir la apoptosis cardiomiocitaria10,11. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos para promover la recuperación de los cardiomiocitos después del infarto de miocardio se ha convertido en un tema urgente.
La medicina tradicional ha sido una fuente de inspiración para la investigación farmacéutica moderna durante muchos años12,13,14,15. La medicina tradicional china (MTC) tiene una larga historia en el tratamiento del IAM, y una serie de ensayos controlados aleatorios en los últimos años han confirmado que la MTC puede mejorar el pronóstico de los pacientes16,17. De acuerdo con la teoría de la MTC, el IAM es causado por la estasis sanguínea18,19, por lo que los medicamentos para promover la circulación sanguínea se utilizan generalmente para el tratamiento del IAM en la fase aguda20. Entre ellos, se cree que el azafrán tiene un poderoso efecto sobre la activación y la estasis de la sangre, y se usa a menudo en el tratamiento agudo del IAM. La crocetina, un componente importante del azafrán, puede desempeñar un papel clave en la protección de los cardiomiocitos21.
En este estudio, las células miocárdicas H9c2 fueron inducidas porH2O2para simular isquemia/reperfusión miocárdica, que causa una lesión cardiomiocitaria del IAM, y la crocetina se utilizó como una intervención para investigar su efecto protector contra la lesión miocárdica inducida por el estrés oxidativo. El mecanismo de crocetina que protege a los cardiomiocitos se exploró más a fondo a través de la mitofagia. Más importante aún, este artículo proporciona una referencia para el enfoque técnico para el estudio de la mitofagia y describe todo el procedimiento experimental en detalle.
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Protocolo
Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Fisiología de la Universidad de Medicina China de Beijing, China. Todos los métodos de estudio se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Universidad de Beijing.
1. Cultivo celular
- Agregue 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina al medio básico Eagle medium (DMEM) modificado de Dulbecco (con 4.5 g/L de D-glucosa, 4.g.g/L de L-glutamina y 110 mg/L de piruvato de sodio; ver Tabla de materiales) para preparar el medio completo DMEM.
- Descongele las células miocárdicas H9c2 congeladas con nitrógeno líquido (consulte la Tabla de materiales) en agua tibia a 37 °C con una agitación rápida y uniforme hasta que el hielo se derrita.
- Transfiera las células a un tubo de centrífuga y agregue cuatro veces el volumen del medio completo DMEM. Centrifugar a 358 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Diluir la suspensión celular obtenida con medio de cultivo, soplar suavemente e inocular las células en un matraz de cultivo. Cultivo en incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
2. Determinación de la viabilidad celular
- Disuelva la crocetina (consulte la Tabla de materiales) en dimetilsulfóxido (DMSO) a concentraciones de 0.05 mM, 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM y 200 mM.
- Disociar las células miocárdicas H9c2 por tripsina, luego neutralizar la mezcla con medio completo DMEM.
- Transfiera las células a un tubo de centrífuga y centrifugar a 179 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y mezcle las células en el medio completo DMEM soplando suavemente.
- Contar las células usando una placa de conteo de células sanguíneas22 (ver Tabla de materiales) y diluirlas a 5 × 104 células/ml con medio completo DMEM.
- Divide las celdas en nueve porciones iguales. Agregue DMSO (diluido en una proporción de 1:1,000 con medio completo DMEM) al grupo control y agregue diferentes concentraciones de crocetina a los grupos restantes en una proporción de 1:1,000.
- Sembrar las células en placas de 96 pocillos a 100 μL por pocillo. Desechar el sobrenadante después de la incubación durante 24 h y lavar las células tres veces con PBS.
- Después de agregar 100 μL de medio basal DMEM, incubar las células durante 4 h y agregar 20 μL de MTS (ver Tabla de materiales).
- Incubar las células durante otras 2 h, medir la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm y calcular la viabilidad celular.
NOTA: Viabilidad celular = (OD tratado - OD en blanco) / (control de OD - OD en blanco) × 100.
3. Determinación de lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CK), malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH Px) y catalasa (CAT)
- Sembrar las células H9c2 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 105 células. Recoja el sobrenadante después de la intervención y detecte los niveles de LDH y SOD, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
- Recoja el sobrenadante y lávelo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una vez. Agregue el lisado celular a la placa de cultivo y déjelo reposar en hielo durante 20 minutos. Recoja el líquido de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga.
- Detecte los niveles de CK, MDA, GSH-Px y CAT de acuerdo con las instrucciones del fabricante23 (consulte la Tabla de materiales y el archivo complementario 1).
- Detectar la concentración total de proteínas de la lisis mediante el método de ácido bicinchonínico (BCA) para corregir la concentración de CK, MDA, GSH-Px y CAT24 (ver Tabla de materiales).
4. Determinación de ROS
- Sembrar las células H9c2 en una placa de 48 pocillos a una densidad de 5 × 103 células. Diluir DCFH-DA (ver Tabla de materiales) en una proporción de 1:1,000 con el medio libre de suero. Deseche el sobrenadante celular y lave la célula dos veces con un medio sin suero.
- Añadir 150 μL de DCFH-DA diluido en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 20 min. Lave las células tres veces con un medio sin suero y capture imágenes bajo un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
5. Detección del potencial de membrana mitocondrial
- Detectar el potencial de membrana mitocondrial utilizando un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrialJC-1 25 (ver Tabla de materiales). Deseche el medio de cultivo y lávelos una vez con un medio sin suero.
- Agregue una solución de trabajo JC-1 a cada tubo y mézclelos bien. Incubar a 37 °C durante 20 min y lavar las células dos veces con tampón de tinción JC-1. Agregue un medio completo a cada pocillo y capture fotografías bajo un microscopio de fluorescencia.
6. Ensayo de tinción TUNEL
- Utilice un kit de ensayo de apoptosis TUNEL (ver Tabla de materiales) para determinar las tasas de apoptosis26. Deseche el sobrenadante y lave el pellet una vez con un medio sin suero.
- Agregue la solución de fijación celular y lávelas con PBS una vez después de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Agregue tritón-100 al 0,3% a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Lave las celdas con PBS dos veces. Añadir la solución de trabajo de detección TUNEL e incubar a 37 °C en la oscuridad durante 60 min.
- Agregue una tableta de sellado antifluorescencia que contenga 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; consulte la Tabla de materiales) y capture fotografías bajo un microscopio de fluorescencia.
7. Monitorización del flujo autofágico por transfección del adenovirus mCherry GFP-LC3B
- Reemplace la mitad del medio en cada pocillo con medio fresco. Agregue el adenovirus Ad-mCherry GFP-LC3B (multiplicidad de infección [MOI] de 2) al medio de cultivo y agregue 5 μg/ml de porodeno (consulte la Tabla de materiales) para mejorar la eficiencia de la infección.
- Reemplace el medio fresco después de 24 h y observe la expresión de la proteína fluorescente bajo un microscopio confocal.
- Cultivar las células con las mismas condiciones que la sección 1 después de confirmar el éxito de la infección viral y capturar imágenes bajo el microscopio confocal27.
NOTA: Más del 20% de las células mostraron fluorescencia de proteína fluorescente verde (GFP), lo que indica una infección exitosa.
8. Análisis de Western blot
- Recoja células para la extracción de proteínas enteras y líselas (RIPA, inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa = 100: 1: 1; consulte la Tabla de materiales) en hielo durante 30 minutos.
- Agregue 5x tampón de carga de proteínas a la muestra de proteína después de la cuantificación de proteínas y hierva las muestras durante 10 minutos.
- Electroforese las muestras que contienen cantidades iguales de proteína con geles de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE)28. Luego, transfiera las muestras a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
- Bloquear las membranas de PVDF durante 1 h con leche desnatada en polvo al 5% e incubar con el anticuerpo primario (PINK1, Parkin; ver Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche y el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h.
- Detecte las bandas objetivo utilizando la solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y el sistema de detección de quimioluminiscencia. Utilice el software Image J para cuantificar las bandas mediante densitometría28.
9. Detección de la translocación mitocondrial de Parkin por inmunofluorescencia
- Observar la colocalización de Parkin con mitocondrias mediante tinción de doble inmunofluorescencia. Deseche el sobrenadante celular de cada grupo y lávelos tres veces con PBS.
- Fije las células durante 10 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% y agregue tritón-100 al 0,1% en PBS.
- Bloquear con solución de bloque libre de animales (ver Tabla de materiales) durante 1 h para evitar la unión no específica entre proteínas y anticuerpos y reducir el fondo de fluorescencia.
- Incubar con un anticuerpo primario (Parkin y Tom20; ver Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche.
- Añadir un anticuerpo secundario fluorescente (ver Tabla de materiales) e incubar en la oscuridad durante 1 h.
- Agregue las tabletas antifluorescentes que contienen DAPI y capture imágenes bajo el microscopio confocal.
10. Análisis estadístico
- Realice análisis estadísticos utilizando software de gráficos y análisis (consulte la Tabla de materiales).
- Compare variables continuas entre grupos utilizando ANOVA unidireccional. p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
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Resultados
Efectos de la crocetina sobre la viabilidad celular
La crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM y 100 μM tuvo un efecto proliferativo significativo en las células, mientras que la crocetina en concentraciones superiores a 200 μM inhibió significativamente la proliferación de células H9c2 (Figura 1A). Después de 4 h de tratamiento con 400 μMH2O2, la viabilidad celular se redujo considerablemente, y la crocetina pudo revertir este cambio en...
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Discusión
La exploración de ingredientes efectivos a partir de compuestos complejos de medicamentos naturales a través de tecnología avanzada ha sido un punto caliente de la investigación de la MTC29, y puede proporcionar evidencia de laboratorio para el desarrollo futuro de medicamentos después de la verificación. El cártamo es un fármaco representativo en el tratamiento de "promover la circulación sanguínea y minimizar la estasis sanguínea" y es ampliamente utilizado en el tratamiento del infarto de mioca...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (No. 7202119) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82274380).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicilina-estreptomicina | Sigma | V900929 | |
| 5x tampón de carga de proteínas | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugado cabra anti-conejo IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugado cabra anti-ratón IgG (H + L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Solución bloqueante sin animales | CST | 15019s | |
| Anticuerpo anti-parkina | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anticuerpo anti-PINK1 | ABclonal | A11435 | |
| Anticuerpo anti-TOM20 | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actina anticuerpo | ABclonal | AC026 | |
| kit de ensayo de proteínas BCA | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Placa de recuento de glóbulos | Servicebio | WG607 | |
| Kits de ensayo CAT | Bioingeniería de Nanjing Jiancheng | A007-1-1 | |
| Sistema de detección de quimioluminiscencia | Shanghai Qinxiang Fábrica de instrumentos científicos | ChemiScope 6100 | |
| CK kits de ensayo | Nanjing Jiancheng Instituto de Bioingeniería | A032-1-1 | |
| Coenzima Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetina | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| Tabletas de enfriamiento antifluorescente que contienen DAPI | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL) | NCM Biotech | P10100 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| Prisma GraphPad 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| Kits de ensayo GSH-Px | Nanjing Jiancheng Instituto de Bioingeniería | A005-1-2 | |
| H9c2 células miocárdicas | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Peroxidasa de rábano picante (HRP)-anti-cabra conjugada IgG (H + L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Peroxidasa de rábano picante (HRP)-conjugada de cabra anti-ratón IgG (H + L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 JC-1 kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial | LABLEAD | J22202 | |
| Kits de ensayo LDH | Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng | A020-2-2 | |
| MDA kit de ensayo | Nanjing Jiancheng Instituto de Bioingeniería | A003-2-2 | |
| Metanol | Aladdin | A2114057 | |
| Ensayo MTS | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clon | CS7730 | |
| Inhibidor de la fosfatasa | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) | Millipore | ISEQ00010 | |
| Tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE geles Shanghai | Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE tampón de funcionamiento | en polvo Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE polvo tampón de transferencia | Servicebio | G2017-1L | |
| Kits de ensayo SOD | Nanjing Jiancheng Instituto de Bioingeniería | A001-2-2 | |
| Polvo de solución salina tamponado Tris | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL, kit de ensayo de apoptosis | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
Referencias
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