Protección de las células miocárdicas H9c2 del estrés oxidativo por crocetina a través de la mitofagia mediada por la vía PINK1 / Parkin

El infarto agudo de miocardio (IAM) es una necrosis miocárdica potencialmente mortal causada por isquemia e hipoxia graves y persistentes en las arterias coronarias ^1,2. La intervención coronaria percutánea (ICP) es una de las estrategias terapéuticas de primera línea para el IAM, y generalmente protege a los cardiomiocitos del daño isquémico ^3,4. El miocardio distal carecerá de suministro de sangre y oxígeno si no se trata con prontitud y eficacia después del IAM, lo que conduce a necrosis isquémica y complicaciones cardiovasculares adicionales ^5,6. Promover la recuperación de cardiomiocitos y minimizar el daño miocárdico irreversible después de perder la oportunidad quirúrgica de ICP ha sido un punto caliente de investigación. Después del IAM, los cardiomiocitos se encuentran en un estado de isquemia e hipoxia, lo que resulta en la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, la reducción de NAD + a NADPH y el aumento de la reducción de un solo electrón⁷. Como resultado, la reacción de reducción incompleta del oxígeno genera un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) y, en última instancia, conduce al daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos⁸. Una acumulación excesiva de ROS desencadena la peroxidación lipídica, alterando aún más la estructura y función de las membranas mitocondriales. El resultado es una apertura continua de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial y una disminución del potencial de la membrana mitocondrial, induciendo apoptosis y necrosis.

Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA), los inhibidores de los β receptores adrenérgicos, los antagonistas de la aldosterona y otros fármacos estándar en el IAM pueden ayudar a mejorar la función cardíaca después del infarto de miocardio y prevenir la aparición de eventos malignos, como arritmias y remodelación ventricular izquierda⁹. Sin embargo, la supervivencia y el pronóstico postinfarto se ven muy afectados por el tamaño del infarto, y no se han logrado resultados satisfactorios para reducir la apoptosis cardiomiocitaria^10,11. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos para promover la recuperación de los cardiomiocitos después del infarto de miocardio se ha convertido en un tema urgente.

La medicina tradicional ha sido una fuente de inspiración para la investigación farmacéutica moderna durante muchos años^12,13,14,15. La medicina tradicional china (MTC) tiene una larga historia en el tratamiento del IAM, y una serie de ensayos controlados aleatorios en los últimos años han confirmado que la MTC puede mejorar el pronóstico de los pacientes^16,17. De acuerdo con la teoría de la MTC, el IAM es causado por la estasis sanguínea^18,19, por lo que los medicamentos para promover la circulación sanguínea se utilizan generalmente para el tratamiento del IAM en la fase aguda²⁰. Entre ellos, se cree que el azafrán tiene un poderoso efecto sobre la activación y la estasis de la sangre, y se usa a menudo en el tratamiento agudo del IAM. La crocetina, un componente importante del azafrán, puede desempeñar un papel clave en la protección de los cardiomiocitos²¹.

En este estudio, las células miocárdicas H9c2 fueron inducidas por_H2O2para simular isquemia/reperfusión miocárdica, que causa una lesión cardiomiocitaria del IAM, y la crocetina se utilizó como una intervención para investigar su efecto protector contra la lesión miocárdica inducida por el estrés oxidativo. El mecanismo de crocetina que protege a los cardiomiocitos se exploró más a fondo a través de la mitofagia. Más importante aún, este artículo proporciona una referencia para el enfoque técnico para el estudio de la mitofagia y describe todo el procedimiento experimental en detalle.

Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Fisiología de la Universidad de Medicina China de Beijing, China. Todos los métodos de estudio se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Universidad de Beijing.

1. Cultivo celular

1. Agregue 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina al medio básico Eagle medium (DMEM) modificado de Dulbecco (con 4.5 g/L de D-glucosa, 4.g.g/L de L-glutamina y 110 mg/L de piruvato de sodio; ver Tabla de materiales) para preparar el medio completo DMEM.
2. Descongele las células miocárdicas H9c2 congeladas con nitrógeno líquido (consulte la Tabla de materiales) en agua tibia a 37 °C con una agitación rápida y uniforme hasta que el hielo se derrita.
3. Transfiera las células a un tubo de centrífuga y agregue cuatro veces el volumen del medio completo DMEM. Centrifugar a 358 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con una pipeta.
4. Diluir la suspensión celular obtenida con medio de cultivo, soplar suavemente e inocular las células en un matraz de cultivo. Cultivo en incubadora a 37 °C con 5% de_CO2.

2. Determinación de la viabilidad celular

1. Disuelva la crocetina (consulte la Tabla de materiales) en dimetilsulfóxido (DMSO) a concentraciones de 0.05 mM, 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM y 200 mM.
2. Disociar las células miocárdicas H9c2 por tripsina, luego neutralizar la mezcla con medio completo DMEM.
3. Transfiera las células a un tubo de centrífuga y centrifugar a 179 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y mezcle las células en el medio completo DMEM soplando suavemente.
4. Contar las células usando una placa de conteo de células sanguíneas²² (ver Tabla de materiales) y diluirlas a 5 × 10⁴ células/ml con medio completo DMEM.
5. Divide las celdas en nueve porciones iguales. Agregue DMSO (diluido en una proporción de 1:1,000 con medio completo DMEM) al grupo control y agregue diferentes concentraciones de crocetina a los grupos restantes en una proporción de 1:1,000.
6. Sembrar las células en placas de 96 pocillos a 100 μL por pocillo. Desechar el sobrenadante después de la incubación durante 24 h y lavar las células tres veces con PBS.
7. Después de agregar 100 μL de medio basal DMEM, incubar las células durante 4 h y agregar 20 μL de MTS (ver Tabla de materiales).
8. Incubar las células durante otras 2 h, medir la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm y calcular la viabilidad celular.
   NOTA: Viabilidad celular = (OD tratado - OD en blanco) / (control de OD - OD en blanco) × 100.

3. Determinación de lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CK), malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH Px) y catalasa (CAT)

1. Sembrar las células H9c2 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10⁵ células. Recoja el sobrenadante después de la intervención y detecte los niveles de LDH y SOD, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
2. Recoja el sobrenadante y lávelo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una vez. Agregue el lisado celular a la placa de cultivo y déjelo reposar en hielo durante 20 minutos. Recoja el líquido de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga.
3. Detecte los niveles de CK, MDA, GSH-Px y CAT de acuerdo con las instrucciones del fabricante²³ (consulte la Tabla de materiales y el archivo complementario 1).
4. Detectar la concentración total de proteínas de la lisis mediante el método de ácido bicinchonínico (BCA) para corregir la concentración de CK, MDA, GSH-Px y CAT²⁴ (ver Tabla de materiales).

4. Determinación de ROS

1. Sembrar las células H9c2 en una placa de 48 pocillos a una densidad de 5 × 10³ células. Diluir DCFH-DA (ver Tabla de materiales) en una proporción de 1:1,000 con el medio libre de suero. Deseche el sobrenadante celular y lave la célula dos veces con un medio sin suero.
2. Añadir 150 μL de DCFH-DA diluido en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 20 min. Lave las células tres veces con un medio sin suero y capture imágenes bajo un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).

5. Detección del potencial de membrana mitocondrial

1. Detectar el potencial de membrana mitocondrial utilizando un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial^{JC-1 25} (ver Tabla de materiales). Deseche el medio de cultivo y lávelos una vez con un medio sin suero.
2. Agregue una solución de trabajo JC-1 a cada tubo y mézclelos bien. Incubar a 37 °C durante 20 min y lavar las células dos veces con tampón de tinción JC-1. Agregue un medio completo a cada pocillo y capture fotografías bajo un microscopio de fluorescencia.

6. Ensayo de tinción TUNEL

1. Utilice un kit de ensayo de apoptosis TUNEL (ver Tabla de materiales) para determinar las tasas de apoptosis²⁶. Deseche el sobrenadante y lave el pellet una vez con un medio sin suero.
2. Agregue la solución de fijación celular y lávelas con PBS una vez después de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Agregue tritón-100 al 0,3% a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Lave las celdas con PBS dos veces. Añadir la solución de trabajo de detección TUNEL e incubar a 37 °C en la oscuridad durante 60 min.
4. Agregue una tableta de sellado antifluorescencia que contenga 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; consulte la Tabla de materiales) y capture fotografías bajo un microscopio de fluorescencia.

7. Monitorización del flujo autofágico por transfección del adenovirus mCherry GFP-LC3B

1. Reemplace la mitad del medio en cada pocillo con medio fresco. Agregue el adenovirus Ad-mCherry GFP-LC3B (multiplicidad de infección [MOI] de 2) al medio de cultivo y agregue 5 μg/ml de porodeno (consulte la Tabla de materiales) para mejorar la eficiencia de la infección.
2. Reemplace el medio fresco después de 24 h y observe la expresión de la proteína fluorescente bajo un microscopio confocal.
3. Cultivar las células con las mismas condiciones que la sección 1 después de confirmar el éxito de la infección viral y capturar imágenes bajo el microscopio confocal²⁷.
   NOTA: Más del 20% de las células mostraron fluorescencia de proteína fluorescente verde (GFP), lo que indica una infección exitosa.

8. Análisis de Western blot

1. Recoja células para la extracción de proteínas enteras y líselas (RIPA, inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa = 100: 1: 1; consulte la Tabla de materiales) en hielo durante 30 minutos.
2. Agregue 5x tampón de carga de proteínas a la muestra de proteína después de la cuantificación de proteínas y hierva las muestras durante 10 minutos.
3. Electroforese las muestras que contienen cantidades iguales de proteína con geles de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE)²⁸. Luego, transfiera las muestras a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
4. Bloquear las membranas de PVDF durante 1 h con leche desnatada en polvo al 5% e incubar con el anticuerpo primario (PINK1, Parkin; ver Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche y el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Detecte las bandas objetivo utilizando la solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y el sistema de detección de quimioluminiscencia. Utilice el software Image J para cuantificar las bandas mediante densitometría²⁸.

9. Detección de la translocación mitocondrial de Parkin por inmunofluorescencia

1. Observar la colocalización de Parkin con mitocondrias mediante tinción de doble inmunofluorescencia. Deseche el sobrenadante celular de cada grupo y lávelos tres veces con PBS.
2. Fije las células durante 10 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% y agregue tritón-100 al 0,1% en PBS.
3. Bloquear con solución de bloque libre de animales (ver Tabla de materiales) durante 1 h para evitar la unión no específica entre proteínas y anticuerpos y reducir el fondo de fluorescencia.
4. Incubar con un anticuerpo primario (Parkin y Tom20; ver Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche.
5. Añadir un anticuerpo secundario fluorescente (ver Tabla de materiales) e incubar en la oscuridad durante 1 h.
6. Agregue las tabletas antifluorescentes que contienen DAPI y capture imágenes bajo el microscopio confocal.

10. Análisis estadístico

1. Realice análisis estadísticos utilizando software de gráficos y análisis (consulte la Tabla de materiales).
2. Compare variables continuas entre grupos utilizando ANOVA unidireccional. p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Efectos de la crocetina sobre la viabilidad celular
La crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM y 100 μM tuvo un efecto proliferativo significativo en las células, mientras que la crocetina en concentraciones superiores a 200 μM inhibió significativamente la proliferación de células H9c2 (Figura 1A). Después de 4 h de tratamiento con 400 μMH2O2, la viabilidad celular se redujo considerablemente, y la crocetina pudo revertir este cambio en cierta medida (Figura 1B). Dado que no se observaron diferencias significativas entre 10 μM y 100 μM de crocetina en la viabilidad celular H9c2 inducidapor H2O2, se eligió crocetina de 10 μM como concentración alta, y se utilizaron 1 μM y 0,1 μM como grupos de dosis media y baja, respectivamente.

Efectos de la crocetina en LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px y CAT en células H9c2
Después de 4 h de tratamiento con 400 μMH2O2, los niveles de LDH, CK y MDA aumentaron apreciablemente, mientras que los niveles de SOD, GSH-Px y CAT disminuyeron. El tratamiento previo de 10 μM de crocetina durante 24 h puede revertir los cambios anteriores y muestra un efecto obvio dependiente de la dosis. Como fármaco de control positivo, la coenzima Q10 solo puede cambiar los niveles de CK, MDA y SOD (Figura 2).

El efecto de la crocetina sobre ROS en cardiomiocitos H9c2
Como control en blanco, los cardiomiocitos H9c2 casi no expresaron ROS. Al mismo tiempo, 400 μMH2O2durante 4 h de tratamiento podrían mejorar notablemente el nivel de ROS, que puede revertirse con 10 μM de crocetina hasta cierto punto (Figura 3). Los resultados de fluorescencia mostraron que la fluorescencia verde fue muy débil en el grupo normal. En comparación, 400 μMH2O2durante 4 h de tratamiento podrían mejorar la señal de fluorescencia verde, y esta mejora podría reducirse en 10 μM de crocetina (Figura 3).

Efectos de la crocetina sobre el potencial de membrana mitocondrial inducido porH2O2y la apoptosis
La tinción JC-1 mostró más fluorescencia roja y menos fluorescencia verde en el grupo control en blanco. Después de 4 h de tratamiento de 400 μMH2O2, se observó más fluorescencia verde y menos fluorescencia roja, y 10 μM crocetina podría revertir este cambio en cierta medida (Figura 4A). Los resultados de la tinción de TUNEL mostraron que la señalización relacionada con la apoptosis no se detectó en el grupo control en blanco, mientras que la señalización relacionada con la apoptosis mejoró apreciablemente después de 400 μMH2O2 durante 4 h de tratamiento, lo que podría revertirse con 10 μM de crocetina hasta cierto punto (Figura 4B).

Efectos de la crocetina sobre la autofagia excesiva inducida por H2O2
Los cardiomiocitos H9c2 en el grupo control en blanco no mostraron un flujo de autofagia obvio. La fluorescencia mostró la aparición de manchas amarillas punteadas en cardiomiocitos H9c2 pretratados con 400 μMH2O2durante 4 h, lo que indica una evidente sobreactivación de la autofagia. Sin embargo, este cambio se revirtió después del pretratamiento con crocetina de 10 μM. En el grupo de control, el virus Ad-mCherry GFP-LC3B solo se pudo observar como un fondo amarillo difuso débil por fluorescencia. Sin embargo, se observaron manchas amarillas punteadas después de 400 μMH2O2durante 4 h de tratamiento, y este cambio se revirtió después del pretratamiento con crocetina de 10 μM (Figura 5).

Detección de crocetina en la expresión de proteínas relacionadas con la mitofagia
Los resultados de Western blot mostraron que en el grupo control, los niveles de expresión de PINK1 y Parkin fueron más bajos. En cardiomiocitos H9c2 estimulados con 4 hH2 O2, los niveles de expresión de PINK1 y Parkin aumentaron, mientras que el pretratamiento con crocetina de 10 μM podría reducir el aumento de PINK1 y Parkin (Figura 6).

Detección del efecto de la crocetina en la translocación de las mitocondrias Parkin
Los resultados de inmunofluorescencia mostraron que la señal de fluorescencia roja que representaba Parkin en el grupo control en blanco era muy débil; sin embargo, después de 400 μM H2O2 durante 4 h de tratamiento, se mejoró la señal de fluorescencia roja y aumentó la colocalización con la fluorescencia verde que representaTom20. Después del pretratamiento de crocetina de 10 μM, la señal de fluorescencia roja se debilitó y se redujo la colocalización con la señal de fluorescencia verde (Figura 7).

Figura 1: Detección de viabilidad celular mediante el ensayo MTT. (A) Efectos de la crocetina a diferentes concentraciones sobre la viabilidad celular (n = 6). (B) Efectos de la crocetina a diferentes concentraciones sobre la viabilidad celular después de laintervención H 2 02 (n = 6). *p < 0,05 versus grupo control, #p < 0,05 versus grupo de tratamientoH2O2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Detección de niveles de LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px y CAT. (A) Nivel de LDH en sobrenadante celular (n = 6). (B) Nivel de CK en lisado celular (n = 6). (C) Nivel de MDA en lisado celular (n = 6). (D) Nivel de SOD en sobrenadante celular (n = 6). (E) Nivel de GSH-Px en lisado celular (n = 6). (F) Nivel de CAT en lisado celular (n = 6). *p < 0,05 versus grupo control en blanco, #p < 0,05 versus grupo de tratamientoH2O2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: ROS determinado por DCFH-DA. (A) DCFH-DA se utilizó para medir los niveles de ROS en cardiomiocitos H9c2. ROS: verde. B) Datos de cuantificación de ROS. a) Cardiomiocitos H9c2 sin tratamiento. b) Cardiomiocitos H9c2 estimulados con 400 μM H2O2 durante 4 h. c) Células H9c2 pretratadas con crocetina 10 μM durante 24 h y luego estimuladas con 400 μMH2O2durante 4 h. Barra de escala = 24 μm. *p < 0,05 versus grupo control en blanco, #p < 0,05 versus grupo de tratamiento conH2O2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Detección del potencial de membrana mitocondrial y apoptosis. (A) El potencial de la membrana mitocondrial se determinó mediante tinción JC-1. Agregados JC-1: rojo; Monómeros JC-1: verde. (B) La apoptosis se detectó mediante tinción TUNEL en células H9c2. TÚNEL: verde; DAPI: azul. a) Cardiomiocitos H9c2 sin tratamiento. b) Cardiomiocitos H9c2 estimulados con 400 μM H2O2 durante 4 h. c) Células H9c2 pretratadas con crocetina 10 μM durante 24 h y luego estimuladas con 400 μMH2O2durante 4 h. Barras de escala = 72 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Flujo autofágico detectado por adenovirus mCherry-GFP-LC3B. mCherry: rojo; GFP: verde. a) Cardiomiocitos H9c2 sin tratamiento. b) Cardiomiocitos H9c2 estimulados con 400 μM H2O2 durante 4 h. c) Células H9c2 pretratadas con crocetina 10 μM durante 24 h y luego estimuladas con 400 μMH2O2durante 4 h. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: El contenido de proteínas relacionadas con la mitofagia se detectó mediante western blotting. (A) Western blot representativo que ilustra la expresión de PINK1 y Parkin. β-actina fue adoptado como referencia interna. (B) Expresión relativa de PINK1 (n = 3). (C) Expresión relativa de Parkin (n = 3). *p < 0,05 versus grupo control, #p < 0,05 versus grupo de tratamientoH2O2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Detección de la translocación mitocondrial de Parkin mediante doble tinción por inmunofluorescencia. Proteína Parkin marcada con fluorescencia roja y proteína Tom20 marcada con fluorescencia verde. Parkin: rojo; Tom20: verde; DAPI: azul). a) Cardiomiocitos H9c2 sin tratamiento. b) Cardiomiocitos H9c2 estimulados con 400 μM H2O2 durante 4 h. c) Células H9c2 pretratadas con crocetina 10 μM durante 24 h y luego estimuladas con 400 μMH2O2durante 4 h. Barras de escala = 24 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Las instrucciones de trabajo de los ensayos LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px y CAT. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.