Summary
İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.
Abstract
Bu çalışma, krosetininH2O2 aracılı H9c2miyokard hücreleri üzerindeki oksidatif stresten koruyucu etkisini in vitro deneylerle araştırmayı ve mekanizmasının mitopajinin etkisiyle ilişkili olup olmadığını araştırmayı amaçlamıştır. Bu çalışmada ayrıca aspir asidinin kardiyomiyositlerde oksidatif stres üzerine terapötik etkisinin gösterilmesi ve mekanizmasının mitopajinin etkisi ile ilişkili olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Burada, birH2O2bazlı oksidatif stres modeli oluşturulmuş ve laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH Px) seviyelerini tespit ederek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarının derecesini değerlendirmiştir. Mitokondriyal hasarı ve apoptozu değerlendirmek için reaktif oksijen türleri (ROS) tespit eden floresan boya DCFH-DA, JC-1 boyası ve TUNEL boyası kullanıldı. Otofajik akı Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirüs transfekte edilerek ölçüldü. Mitopaji ile ilişkili proteinler daha sonra batı lekelenmesi ve immünofloresan yoluyla tespit edildi. Bununla birlikte, krosetin (0.1-10 μM) hücre canlılığını önemli ölçüde artırabilir veH2O2'nin neden olduğu apoptozve oksidatif stres hasarını azaltabilir. Aşırı otofajik aktivasyonu olan hücrelerde, krosetin ayrıca otofaji akışını ve mitopaji ile ilişkili proteinler PINK1 ve Parkin'in ekspresyonunu azaltabilir ve Parkin'in mitokondriye transferini tersine çevirebilir. Krosetin,H2O2aracılı oksidatif stres hasarını ve H9c2 hücrelerinin apoptozunu azaltabilir ve mekanizması mitopaji ile yakından ilişkiliydi.
Introduction
Akut miyokard enfarktüsü (), koroner arterlere şiddetli ve inatçı iskemi ve hipoksi sonucu ortaya çıkan, hayatı tehdit eden bir miyokard nekrozudur 1,2. Perkütan koroner girişim (PKG), için birinci basamak terapötik stratejilerden biridir ve genellikle kardiyomiyositleri iskemik hasardan korur 3,4. Distal miyokard, sonrası derhal ve etkili bir şekilde tedavi edilmezse kan ve oksijen kaynağından yoksun kalacaktır, bu da iskemik nekroza ve daha ileri kardiyovasküler komplikasyonlara yol açacaktır 5,6. Kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek ve PCI cerrahi fırsatını kaçırdıktan sonra geri dönüşümsüz miyokard hasarını en aza indirmek bir araştırma noktası olmuştur. AMI'den sonra, kardiyomiyositler iskemi ve hipoksi durumundadır, bu da mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun inhibisyonu, NAD + 'nın NADPH'ye indirgenmesi ve tek elektron redüksiyonunun artmasıile sonuçlanır 7. Sonuç olarak, oksijenin eksik indirgeme reaksiyonu, aşırı miktarda reaktif oksijen türü (ROS) üretir ve sonuçta kardiyomiyositlerde oksidatif stres hasarına yol açar8. Aşırı ROS birikimi, lipit peroksidasyonunu tetikleyerek mitokondriyal membranların yapısını ve işlevini daha da bozar. Sonuç, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin sürekli açılması ve mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalma, apoptoz ve nekrozu indüklemesidir.
Anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörleri, anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB'ler), β-adrenoseptörlerin inhibitörleri, aldosteron antagonistleri ve'deki diğer standart ilaçlar, miyokard enfarktüsünden sonra kalp fonksiyonlarını iyileştirmeye yardımcı olabilir ve aritmiler ve sol ventrikül yeniden şekillenmesi gibi malign olayların ortaya çıkmasını önleyebilir9. Bununla birlikte, enfarktüs sonrası sağkalım ve prognoz enfarktüs boyutundan büyük ölçüde etkilenmektedir ve kardiyomiyosit apoptozunu azaltmada tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir10,11. Bu nedenle, miyokard enfarktüsünden sonra kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek için ilaçların geliştirilmesi acil bir konu haline gelmiştir.
Geleneksel tıp, uzun yıllardır modern farmasötik araştırmalar için bir ilham kaynağı olmuştur12,13,14,15. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), tedavisinde uzun bir geçmişe sahiptir ve son yıllarda yapılan bir dizi randomize kontrol çalışması, TCM'nin hastaların prognozunu gerçekten iyileştirebileceğini doğrulamıştır16,17. TCM teorisine göre,'ye kan stazı18,19 neden olur, bu nedenle kan dolaşımını teşvik eden ilaçlar genellikle akut faz20'de tedavisi için kullanılır. Bunlar arasında safranın kan aktivasyonu ve stazı üzerinde güçlü bir etkisi olduğuna inanılmaktadır ve sıklıkla'nin akut tedavisinde kullanılmaktadır. Safranın önemli bir bileşeni olan krosetin, kardiyomiyositlerin korunmasında önemli bir rol oynayabilir21.
Bu çalışmada, H9c2 miyokard hücreleri,'nin kardiyomiyosit hasarına neden olan miyokard iskemisi / reperfüzyonunu simüle etmek için H2O2tarafından indüklendi ve oksidatif strese bağlı miyokard hasarına karşı koruyucu etkisini araştırmak için bir müdahale olarak krosetin kullanıldı. Krosetinin kardiyomiyositleri koruma mekanizması mitopaji ile daha da araştırıldı. Daha da önemlisi, bu makale mitopaji çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürü ayrıntılı olarak açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, Çin'deki Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Fizyoloji Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. Tüm çalışma yöntemleri, Pekin Üniversitesi'nin ilgili yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hücre kültürü
- DMEM komple ortamını hazırlamak için Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) bazik besiyerine (4.5 g / L D-glikoz, 4.g.g / L L-glutamin ve 110 mg / L sodyum piruvat ile; Malzeme Tablosuna bakınız) %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin / streptomisin ekleyin.
- Sıvı azotla dondurulmuş H9c2 miyokard hücrelerini (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de ılık suda, buz eriyene kadar hızlı ve düzgün bir şekilde karıştırarak çözün.
- Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve DMEM tam ortamının hacminin dört katını ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 358 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın.
- Elde edilen hücre süspansiyonunu kültür ortamı ile seyreltin, yavaşça üfleyin ve hücreleri bir kültür şişesinde aşılayın. 37 °C'de bir inkübatörde %5 CO2 ile kültür.
2. Hücre canlılığının belirlenmesi
- Krosetini (bakınız Malzeme Tablosu) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM ve 200 mM konsantrasyonlarında çözün.
- H9c2 miyokard hücrelerini tripsin ile ayırın, ardından karışımı DMEM tam ortamı ile nötralize edin.
- Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 179 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri DMEM komple ortamında hafifçe üfleyerek karıştırın.
- Bir kan hücresi sayım plakası22 kullanarak hücreleri sayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve DMEM tam ortamı ile 5 × 104 hücre / mL'ye seyreltin.
- Hücreleri dokuz eşit parçaya bölün. Kontrol grubuna DMSO (DMEM tam ortamı ile 1: 1.000 oranında seyreltilmiş) ekleyin ve kalan gruplara 1: 1.000 oranında farklı krosetin konsantrasyonları ekleyin.
- Hücreleri 96 delikli plakalarda kuyucuk başına 100 μL'de tohumlayın. Süpernatantı 24 saat inkübasyondan sonra atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
- 100 μL DMEM bazal ortamı ekledikten sonra, hücreleri 4 saat boyunca inkübe edin ve 20 μL MTS ekleyin ( bkz.
- Hücreleri 2 saat daha inkübe edin, absorbansı 490 nm dalga boyunda ölçün ve hücre canlılığını hesaplayın.
NOT: Hücre canlılığı = (OD ile işlenmiş - OD boş) / (OD kontrolü - OD boş) × 100.
3. Laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH Px) ve katalaz (CAT) tayini
- H9c2 hücrelerini 6 delikli bir plakada 1 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Müdahaleden sonra süpernatantı toplayın ve üreticinin talimatlarına göre LDH ve SOD seviyelerini tespit edin (bkz.
- Süpernatantı toplayın ve bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücre lizatını kültür kabına ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin. Sıvıyı kültür kabından bir santrifüj tüpüne toplayın.
- CK, MDA, GSH-Px ve CAT düzeylerini üreticinin talimatları23'e göre tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu ve Ek Dosya 1).
- CK, MDA, GSH-Px ve CAT24 konsantrasyonunu düzeltmek için lizisin toplam protein konsantrasyonunu bicinchoninic acid (BCA) yöntemiyle tespit edin (bkz.
4. ROS tayini
- H9c2 hücrelerini 48 delikli bir plakada 5 × 103 hücre yoğunluğunda tohumlayın. DCFH-DA'yı ( bkz. Malzeme Tablosu) serumsuz ortam ile 1:1.000 oranında seyreltin. Hücre süpernatantını atın ve hücreyi serumsuz bir ortamla iki kez yıkayın.
- Her bir oyuğa 150 μL seyreltilmiş DCFH-DA ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri serumsuz bir ortamla üç kez yıkayın ve floresan mikroskobu altında görüntüler yakalayın (bkz.
5. Mitokondriyal membran potansiyelinin tespiti
- Bir JC-1 mitokondriyal membran potansiyeli tahlil kiti25 kullanarak mitokondriyal membran potansiyelini tespit edin (bakınız Malzeme Tablosu). Kültür ortamını atın ve serumsuz ortamla bir kez yıkayın.
- Her tüpe JC-1 çalışma solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri JC-1 boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa tam bir ortam ekleyin ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin.
6. TÜNEL boyama testi
- Apoptoz oranlarını belirlemek için bir TUNEL apoptoz tahlil kiti kullanın (bakınız Malzeme Tablosu)26. Süpernatantı atın ve peletleri bir kez serumsuz ortamla yıkayın.
- Hücre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra bir kez PBS ile yıkayın.
- Her bir kuyucuğa% 0.3 triton-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. TUNEL algılama çalışma solüsyonunu ekleyin ve karanlıkta 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
- 4′,6-diamidino-2-fenilindol içeren bir anti-floresan söndürme sızdırmazlık tableti ekleyin (DAPI; Malzeme Tablosuna bakınız) ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin.
7. mCherry GFP-LC3B adenovirüsünün transfeksiyonu ile otofajik akışın izlenmesi
- Her bir kuyucuktaki ortamın yarısını taze ortamla değiştirin. Kültür ortamına Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirüsü (2'nin enfeksiyon çokluğu [MOI]) ekleyin ve enfeksiyon verimliliğini artırmak için 5 μg / mL polibren ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Taze ortamı 24 saat sonra değiştirin ve floresan proteininin ekspresyonunu konfokal mikroskop altında gözlemleyin.
- Başarılı virüs enfeksiyonunu doğruladıktan sonra hücreleri bölüm 1 ile aynı koşullarda kültürleyin ve konfokal mikroskop altında görüntü yakalayın27.
NOT: Hücrelerin% 20'sinden fazlası, başarılı bir enfeksiyonu gösteren yeşil floresan protein (GFP) floresansı gösterdi.
8. Batı leke analizi
- Tüm protein ekstraksiyonu için hücreleri toplayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde lize edin (RIPA, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü = 100: 1: 1; Malzeme Tablosuna bakınız).
- Protein miktarından sonra protein numunesine 5x protein yükleme tamponu ekleyin ve numuneleri 10 dakika kaynatın.
- Elektrofor, eşit miktarda protein içeren numunelerde sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelleri28. Daha sonra, numuneleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
- PVDF membranlarını %5 yağsız süt tozu ile 1 saat bloke edin ve gece boyunca 4 °C'de birincil antikor (PINK1, Parkin; bakınız Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında ikincil antikor ile 1 saat boyunca inkübe edin.
- Gelişmiş kemilüminesans (ECL) çözeltisini ve kemilüminesans algılama sistemini kullanarak hedef bantları tespit edin. Dansitometri28 ile bantları ölçmek için Image J yazılımını kullanın.
9. Parkin'in mitokondriyal translokasyonunun immünofloresan ile saptanması
- Parkin'in mitokondri ile çift immünofloresan boyama ile kolokalizasyonunu gözlemleyin. Hücre süpernatantını her gruptan atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin ve PBS'de% 0.1 triton-100 ekleyin.
- Proteinler ve antikorlar arasında spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve floresan arka planını azaltmak için 1 saat boyunca hayvansız blok çözeltisi ile blok yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Bir gecede 4 ° C'de birincil bir antikor (Parkin ve Tom20; Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
- Bir floresan ikincil antikor ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.
- DAPI içeren anti-floresan söndürme tabletlerini ekleyin ve konfokal mikroskop altında görüntüler yakalayın.
10. İstatistiksel analiz
- Grafik ve analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin (bkz.
- Tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki sürekli değişkenleri karşılaştırın. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Krosetinin hücre canlılığı üzerine etkileri
0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM ve 100 μM'deki krosetin, hücreler üzerinde önemli bir proliferatif etkiye sahipken, 200 μM'nin üzerindeki konsantrasyonlarda krosetin, H9c2 hücrelerinin proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe etmiştir (Şekil 1A). 400 μM H2O2 ile 4 saatlik tedaviden sonra, hücre canlılığı önemli ölçüde azaldı ve krosetin bu değişikliği belirli bir dereceye kadar tersine çevirebildi (Şekil 1B). H2O2 ile indüklenenH9c2hücre canlılığı üzerinde 10 μM ve 100 μM krosetin arasında anlamlı bir fark gözlenmediğinden, yüksek konsantrasyon olarak 10 μM krosetin seçildi ve orta ve düşük doz grupları olarak sırasıyla 1 μM ve 0.1 μM kullanıldı.
H9c2 hücrelerinde krosetinin LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px ve CAT üzerine etkileri
400 μM H2O2ile 4 saatlik tedaviden sonra, LDH, CK ve MDA seviyeleri önemli ölçüde artarken, SOD, GSH-Px ve CAT seviyeleri azaldı. 10 μM krosetinin 24 saat boyunca ön muamelesi yukarıdaki değişiklikleri tersine çevirebilir ve doza bağlı belirgin bir etki gösterir. Pozitif bir kontrol ilacı olarak, koenzim Q10 sadece CK, MDA ve SOD seviyelerini değiştirebilir (Şekil 2).
H9c2 kardiyomiyositlerinde krosetinin ROS üzerine etkisi
Boş bir kontrol olarak, H9c2 kardiyomiyositleri neredeyse hiç ROS ifade etmedi. Aynı zamanda, 4 saatlik tedavi için 400 μM H2O2, ROS seviyesini önemli ölçüde artırabilir, bu da 10 μM krosetin tarafından bir dereceye kadar tersine çevrilebilir (Şekil 3). Floresan sonuçları, yeşil floresanın normal grupta çok zayıf olduğunu gösterdi. Buna karşılık, 4 saatlik tedavi için 400 μM H2O2, yeşil floresan sinyalini artırabilir ve bu gelişme 10 μM krosetin ile azaltılabilir (Şekil 3).
KrosetininH2O2ile indüklenen mitokondriyal membran potansiyeli ve apoptoz üzerine etkileri
JC-1 boyaması, boş kontrol grubunda daha fazla kırmızı floresan ve daha az yeşil floresan gösterdi. 400 μM H2O2'nin4 saatlik tedavisinden sonra, daha fazla yeşil floresan ve daha az kırmızı floresan gözlendi ve 10 μM krosetin bu değişikliği bir dereceye kadar tersine çevirebilir (Şekil 4A). TUNEL boyama sonuçları, boş kontrol grubunda apoptozla ilişkili sinyallemenin tespit edilmediğini, apoptozla ilişkili sinyallemenin 4 saatlik tedavi için 400 μM H2O2'densonra önemli ölçüde arttığını ve bunun da 10 μM krosetin tarafından bir dereceye kadar tersine çevrilebileceğini göstermiştir (Şekil 4B).
KrosetininH2O2'yebağlı aşırı otofaji üzerine etkileri
Boş kontrol grubundaki H9c2 kardiyomiyositleri belirgin bir otofaji akışı göstermedi. Floresan, 4 saat boyunca 400 μM H2 O2 ile önceden işlenmişH9c2 kardiyomiyositlerinde noktasal sarı lekelerin görünümünü gösterdi vebu da otofajinin bariz bir aşırı aktivasyonunu gösterdi. Bununla birlikte, bu değişiklik 10 μM krosetin ön işleminden sonra tersine çevrildi. Kontrol grubunda, Ad-mCherry GFP-LC3B virüsü sadece floresan ile zayıf bir dağınık sarı arka plan olarak gözlemlenebildi. Bununla birlikte, 4 saatlik tedavi için 400 μM H2O2'densonra noktasal sarı lekeler gözlendi ve bu değişiklik 10 μM krosetin ön işleminden sonra tersine çevrildi (Şekil 5).
Mitopaji ile ilişkili proteinlerin ekspresyonunda krosetinin tespiti
Western blot sonuçları, kontrol grubunda PINK1 ve Parkin'in ekspresyon seviyelerinin daha düşük olduğunu göstermiştir. 4 h H2 O2 ile uyarılmış H9c2 kardiyomiyositlerinde, PINK1 ve Parkin'in ekspresyon seviyeleri artarken, 10 μM krosetin ön tedavisi PINK1 ve Parkin artışını azaltabilir (Şekil 6).
Krosetinin Parkin mitokondrisinin translokasyonu üzerindeki etkisinin tespiti
İmmünofloresan sonuçları, boş kontrol grubunda Parkin'i temsil eden kırmızı floresan sinyalinin çok zayıf olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, 4 saatlik tedavi için 400 μM H2O2'den sonra, kırmızı floresan sinyali arttırıldı ve Tom20'yi temsil eden yeşil floresan ile kolokalizasyon arttı. 10 μM krosetinin ön işleminden sonra, kırmızı floresan sinyali zayıfladı ve yeşil floresan sinyali ile kolokalizasyon azaltıldı (Şekil 7).
Şekil 1: MTT testi ile hücre canlılığının tespiti. (A) Farklı konsantrasyonlarda krosetinin hücre canlılığı üzerine etkileri (n = 6). (B) Farklı konsantrasyonlarda krosetininH202 müdahalesinden sonra hücre canlılığı üzerine etkileri (n = 6). * p < kontrol grubuna karşı 0.05, #p < 0.05'e karşı H2O2tedavi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px ve CAT düzeylerinin saptanması. (A) Hücre süpernatantındaki LDH seviyesi (n = 6). (B) Hücre lizatındaki CK seviyesi (n = 6). (C) Hücre lizatındaki MDA düzeyi (n = 6). (D) Hücre süpernatantındaki SOD seviyesi (n = 6). (E) Hücre lizatındaki GSH-Px düzeyi (n = 6). (F) Hücre lizatındaki CAT seviyesi (n = 6). *p < 0.05'e karşı boş kontrol grubu, #p < 0.05'e karşıH2O2tedavi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DCFH-DA tarafından belirlenen ROS. (A) DCFH-DA, H9c2 kardiyomiyositlerinde ROS düzeylerini ölçmek için kullanıldı. ROS: yeşil. (B) ROS'un niceleme verileri. (a) Tedavi edilmeyen H9c2 kardiyomiyositleri. (b) 4 saat boyunca 400 μM H2 O2 ile uyarılan H9c2 kardiyomiyositleri. (c) H9c2 hücreleri, 24 saat boyunca 10 μM krosetin ile ön muamele görmüş ve daha sonra 4 saat boyunca 400 μM H2O2ile uyarılmıştır. Ölçek çubuğu = 24 μm. *p < boş kontrol grubuna karşı 0.05, #p < 0.05'e karşıH2O2tedavi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mitokondriyal membran potansiyelinin ve apoptozun saptanması. (A) Mitokondriyal membran potansiyeli JC-1 boyaması ile belirlendi. JC-1 agregaları: kırmızı; JC-1 monomerleri: yeşil. (B) H9c2 hücrelerinde TUNEL boyaması ile apoptoz saptandı. TUNEL: yeşil; DAPI: mavi. (a) Tedavi edilmeyen H9c2 kardiyomiyositleri. (b) 4 saat boyunca 400 μM H2 O2 ile uyarılan H9c2 kardiyomiyositleri. (c) H9c2 hücreleri, 24 saat boyunca 10 μM krosetin ile ön muamele görmüş ve daha sonra 4 saat boyunca 400 μM H2O2ile uyarılmıştır. Ölçek çubukları = 72 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: mCherry-GFP-LC3B adenovirüs tarafından tespit edilen otofajik akı. mCherry: kırmızı; GFP: yeşil. (a) Tedavi edilmeyen H9c2 kardiyomiyositleri. (b) 4 saat boyunca 400 μM H2 O2 ile uyarılan H9c2 kardiyomiyositleri. (c) H9c2 hücreleri, 24 saat boyunca 10 μM krosetin ile ön muamele görmüş ve daha sonra 4 saat boyunca 400 μM H2O2ile uyarılmıştır. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mitopaji ile ilişkili proteinlerin içeriği batı lekelenmesi ile tespit edildi. (A) PINK1 ve Parkin ekspresyonunu gösteren temsili batı lekesi. β-aktin iç referans olarak kabul edildi. (B) Bağıl PINK1 ifadesi (n = 3). (C) Bağıl Parkin ifadesi (n = 3). * p < kontrol grubuna karşı 0.05, #p < 0.05'e karşı H2O2tedavi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Parkin'in mitokondriyal translokasyonunun immünofloresan çift boyama ile saptanması. Kırmızı floresan etiketli Parkin proteini ve yeşil floresan etiketli Tom20 proteini. Parkin: kırmızı; Tom20: yeşil; DAPI: mavi). (a) Tedavi edilmeyen H9c2 kardiyomiyositleri. (b) 4 saat boyunca 400 μM H2 O2 ile uyarılan H9c2 kardiyomiyositleri. (c) H9c2 hücreleri, 24 saat boyunca 10 μM krosetin ile ön muamele görmüş ve daha sonra 4 saat boyunca 400 μM H2O2ile uyarılmıştır. Ölçek çubukları = 24 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px ve CAT tahlillerinin çalışma talimatları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İleri teknoloji ile doğal ilaçların karmaşık bileşiklerinden etkili bileşenlerin araştırılması, TCM araştırmasının29 sıcak noktası olmuştur ve doğrulamadan sonra gelecekteki ilaç gelişimi için laboratuvar kanıtları sağlayabilir. Aspir, "kan dolaşımını teşvik etmek ve kan durağanlığını en aza indirmek" tedavisinde temsili bir ilaçtır ve miyokard enfarktüsü tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır30,31. Safranın aspir ile benzer etkilere sahip olduğuna inanılmaktadır ve kan dolaşımını teşvik etmedeki ve kan durağanlığını gidermedeki etkisi aspirden önemli ölçüde daha iyidir31,32. Krosetin, safran33'ün ana aktif bileşenlerinden biridir, bu nedenle bu deneyin çalışmasında kullanılmıştır.
H2O2, kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarına neden olabilir ve in vitro34'ün bir miyokard enfarktüsü modeli olarak kurulan kardiyomiyositlerin miyokard enfarktüsü durumunu simüle edebilir. Bu çalışmada, düşük bir krosetin konsantrasyonu, mitokondriyal enerji metabolizmasının aktivasyonu ile yakından ilişkili olabilecek kardiyomiyositlerin hücre canlılığını artırabilir. Krosetin,H2O2tarafından indüklenen kardiyomiyositlerin azalmış canlılığını geri kazanabilirve doza bağımlı bir etkiye sahiptir, bu da krosetinin kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını iyileştirebileceğini düşündürmektedir. Bu arada, krosetin,H2O2'ninneden olduğu miyokard hasarını ve oksidatif stres indekslerini etkili bir şekilde tersine çevirebilirve miyokard koruyucu etkisini daha da doğrulayabilir.
Mitokondriyal membran potansiyelindeki düşüş, apoptozun erken evrelerindeki ayırt edici olaylardan biridir35. JC-1 boyaları, mitokondri içinde potansiyele bağımlı bir şekilde toplanır. Normal mitokondriyal matriste, JC-1 kırmızı renkte bir floresan polimer oluşturur. Mitokondriyal membran potansiyeli çöktüğünde, JC-1 monomerler36 olarak yeşil floresan yayar. TÜNEL, apoptozun geç evrelerinde nükleer DNA iplikçik kırılmalarını tespit eder37. Apoptotik hücreler, nükleozomlar arasındaki genomik DNA'yı kesen DNA endonükleaz enzimlerini aktive eder ve maruz kalan 3'-OH, terminal deoksinükleotidil transferazlar37 tarafından katalize edilen yeşil floresan prob floresein (FITC) etiketli dUTP ile tespit edilebilir. Bu çalışmanın sonuçları, mitokondriyal membran potansiyelinin azaldığını ve kardiyomiyositlerin apoptozununH2O2modellemesinden sonra ortaya çıktığını göstermektedir; Değişiklikler krosetin tarafından bir dereceye kadar tersine çevrilebilir, bu da krosetinin oksidatif stresin neden olduğu kardiyomiyositlerin apoptozunu etkili bir şekilde inhibe edebileceğini düşündürmektedir.
PINK1 / Parkin, mitopaji38'e aracılık eden klasik bir yoldur. PINK1, mitokondriyal hasardan sonra dış mitokondriyal membranda birikir ve Parkin, otofagozomlar oluşturmak için otofaji ile ilişkili reseptör proteinlerine bağlanan ekstramitokondriyal membran proteinini ubikitinasyona sokmak için işe alınır ve mitopaji39,40,4 1 oluşumunu işaretler. Sonuçlar,H2O2modellemesinden sonra kardiyomiyositlerde PINK1 ve Parkin protein seviyelerinin arttığını ve aşırı otofajiyi düşündürdüğünü göstermektedir. Krosetin müdahalesinden sonra,H2O2ile tedavi edilen kardiyomiyositlerdeki PINK1 ve Parkin'in protein seviyeleri bir dereceye kadar tersineçevrildi, bu da aşırı mitokondriyal otofajiyi inhibe ederek terapötik bir rol oynayabileceğini düşündürdü. Bu çalışmada, krosetin,H2O2'yebağlı oksidatif hasarı ve H9c2 kardiyomiyositlerin apoptozunu azaltmıştır ve bu etkinin, aşırı mitopajiyi inhibe etmek için PINK1 / Parkin yolunu etkileyerek elde edilebileceği düşünülmektedir.
Bu deney, bitkisel liyofilize tozun hücresel oksidatif stres ve mitopaji üzerine müdahalesini göstermiştir. Mitokondriyal otofajiyi gözlemlemek için mCherry-GFP-LC3B adenovirüsünün kullanılması deneyde çok önemli bir adımdı. Bu adımın başarısının anahtarı, hücrelerin enfeksiyon oranını arttırmaktı ve enfeksiyon verimliliğini büyük ölçüde artırmak için proviral enfeksiyon reaktifi polibren, ortama önceden eklendi. Bu, hücre yüzeyi sialik asit ve viral parçacıklar arasındaki elektrostatik itmeyi nötralize ederek ve böylece adsorpsiyonu kolaylaştırarak elde edildi. Ayrıca, nispeten güvenli bir virüs olarak, adenovirüs genomunun enfeksiyondan sonra konakçı hücre genomuna entegre olmamasına ve hücrede çoğalmamasına rağmen, biyolojik olarak hala potansiyel olarak tehlikeli olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, deneylerin düzenleyici gerekliliklere sıkı sıkıya uyulması tavsiye edilir.
Floresan etiketleme, mitofajiyi tespit etmek için yaygın bir yöntemdir, ancak zayıf özgüllüğü nedeniyle, diğer organeller yanlış etiketlenebilir ve bu nedenle deneysel sonuçlara müdahale edebilir41. Teknoloji ilerledikçe, mitopajinin mekanizmasını daha fazla araştırmak için daha hassas ve güvenilir floresan probların geliştirilmesini bekleyebiliriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7202119) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274380) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
