Summary
استنادا إلى التجارب المختبرية ، كشفت هذه الدراسة عن آلية الكروسيتين في إصلاح تلف الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب من خلال التأثير على الميتوفاجي ، حيث يلعب مسار إشارات PINK1 / Parkin دورا مهما.
Abstract
تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف التأثير التأكسدي الوقائي للكروسيتين على خلايا عضلة القلبH2 O2 بوساطة H9c2 من خلال التجارب في المختبر ، واستكشاف ما إذا كانت آليتها مرتبطة بتأثير الميتوفاجي. تهدف هذه الدراسة أيضا إلى إظهار التأثير العلاجي لحمض القرطم على الإجهاد التأكسدي في خلايا عضلة القلب واستكشاف ما إذا كانت آليته مرتبطة بتأثير الميتوفاجي. هنا ، تم بناء نموذج الإجهاد التأكسدي القائم على H 2 O2وتقييم درجة إصابة الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب من خلال الكشف عن مستويات نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، كيناز الكرياتين (CK) ، malondialdehyde (MDA) ، ديسموتاز الفائق (SOD) ، الكاتلاز (CAT) ، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH Px). تم استخدام أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) - صبغة الفلورسنت المكتشفة DCFH-DA ، JC-1 dye ، وصبغة TUNEL لتقييم تلف الميتوكوندريا وموت الخلايا المبرمج. تم قياس تدفق الالتهام الذاتي عن طريق نقل الفيروس الغدي Ad-mCherry-GFP-LC3B. ثم تم الكشف عن البروتينات المرتبطة بالميتوفاجي عن طريق النشاف الغربي والتألق المناعي. ومع ذلك ، يمكن للكروسيتين (0.1-10 ميكرومتر) أن يحسن بشكل كبير من صلاحية الخلية ويقلل من موت الخلايا المبرمج وتلف الإجهاد التأكسدي الناجم عن H 2 O2. في الخلايا ذات التنشيط المفرط للالتهام الذاتي ، يمكن أن يقلل الكروسيتين أيضا من تدفق الالتهام الذاتي والتعبير عن البروتينات المرتبطة بالميتوفاجي PINK1 و Parkin ، وعكس نقل Parkin إلى الميتوكوندريا. يمكن أن يقلل الكروسيتين من تلف الإجهاد التأكسدي بوساطة H2O2 وموت الخلايا المبرمج لخلايا H9c2 ، وكانت آليته مرتبطة ارتباطا وثيقا بالميتوفاجي.
Introduction
احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) هو نخر عضلة القلب الذي يهدد الحياة والناجم عن نقص التروية الشديد والمستمر ونقص الأكسجة في الشرايين التاجية 1,2. التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) هو أحد استراتيجيات الخط الأول العلاجية ل AMI ، وعادة ما يحمي خلايا عضلة القلب من التلف الإقفاري 3,4. ستفتقر عضلة القلب البعيدة إلى إمدادات الدم والأكسجين إذا لم يتم علاجها على الفور وبشكل فعال بعد AMI ، مما يؤدي إلى نخر نقص تروية ومضاعفات القلب والأوعية الدمويةالأخرى 5,6. كان تعزيز تعافي خلايا عضلة القلب وتقليل تلف عضلة القلب الذي لا رجعة فيه بعد تفويت الفرصة الجراحية PCI نقطة ساخنة للبحث. بعد AMI ، تكون خلايا عضلة القلب في حالة نقص التروية ونقص الأكسجة ، مما يؤدي إلى تثبيط الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا ، وتقليل NAD + إلى NADPH ، وزيادة تقليل الإلكترون الفردي7. نتيجة لذلك ، يولد تفاعل الاختزال غير المكتمل للأكسجين فائضا من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ويؤدي في النهاية إلى تلف الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب8. يؤدي التراكم المفرط لأنواع الأكسجين التفاعلية إلى بيروكسيد الدهون ، مما يزيد من تعطيل بنية ووظيفة أغشية الميتوكوندريا. والنتيجة هي فتح مستمر للمسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا وانخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج والنخر.
يمكن أن تساعد مثبطات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين (ACE) ، وحاصرات مستقبلات الأنجيوتنسين (ARBs) ، ومثبطات مستقبلات β الأدرينالين ، ومضادات الألدوستيرون ، والأدوية القياسية الأخرى في AMI في تعزيز وظائف القلب بعد احتشاء عضلة القلب ومنع حدوث الأحداث الخبيثة ، مثل عدم انتظام ضربات القلب وإعادة تشكيل البطين الأيسر9. ومع ذلك ، يتأثر البقاء على قيد الحياة والتشخيص بعد الاحتشاء بشكل كبير بحجم الاحتشاء ، ولم يتم تحقيق نتائج مرضية للحد من موت الخلايا المبرمج في عضلة القلب10,11. وبالتالي ، أصبح تطوير الأدوية لتعزيز انتعاش عضلة القلب بعد احتشاء عضلة القلب قضية ملحة.
كان الطب التقليدي مصدر إلهام للبحوث الصيدلانية الحديثة لسنواتعديدة 12،13،14،15. الطب الصيني التقليدي (TCM) له تاريخ طويل في علاج AMI ، وقد أكدت سلسلة من تجارب التحكم العشوائية في السنوات الأخيرة أن الطب الصيني التقليدي يمكن أن يحسن بالفعل تشخيص المرضى16,17. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي ، يحدث AMI بسبب ركود الدم18,19 ، لذلك عادة ما تستخدم أدوية تعزيز الدورة الدموية لعلاج AMI في المرحلة الحادة20. من بينها ، يعتقد أن الزعفران له تأثير قوي على تنشيط الدم والركود ، وغالبا ما يستخدم في العلاج الحاد ل AMI. قد يلعب الكروسيتين ، وهو مكون رئيسي للزعفران ، دورا رئيسيا في حماية خلايا عضلة القلب21.
في هذه الدراسة ، تم تحفيز خلايا عضلة القلب H9c2 بواسطة H 2 O2لمحاكاة نقص تروية عضلة القلب / إعادة التروية ، والتي تسبب إصابة عضلة القلب في AMI ، وتم استخدام الكروسيتين كتدخل للتحقيق في تأثيره الوقائي ضد إصابة عضلة القلب الناجمة عن الإجهاد التأكسدي. تم استكشاف آلية حماية الكروسيتين لخلايا عضلة القلب من خلال الميتوفاجي. الأهم من ذلك ، توفر هذه المقالة مرجعا للنهج التقني لدراسة الميتوفاجي وتصف الإجراء التجريبي بأكمله بالتفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت التجارب في مختبر علم وظائف الأعضاء في جامعة بكين للطب الصيني ، الصين. تم تنفيذ جميع طرق الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة بجامعة بكين.
1. ثقافة الخلية
- أضف 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين إلى وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco (مع 4.5 جم / لتر D-glucose و 4.g.g / L L-glutamine و 110 mg / L pyruvate الصوديوم ؛ انظر جدول المواد) لتحضير وسط DMEM الكامل.
- قم بإذابة خلايا عضلة القلب H9c2 المجمدة بالنيتروجين السائل (انظر جدول المواد) في ماء دافئ عند 37 درجة مئوية مع تحريك سريع وموحد حتى يذوب الجليد.
- نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي وإضافة أربعة أضعاف حجم وسط DMEM الكامل. جهاز طرد مركزي عند 358 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- تمييع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها مع وسط الثقافة ، ضربة بلطف ، وتلقيح الخلايا في قارورة الثقافة. الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
2. تحديد صلاحية الخلية
- إذابة الكروسيتين (انظر جدول المواد) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيزات 0.05 ملليمول، 0.1 ملليمول، 0.5 ملليمول، 1 ملي مول، 5 ملليمول، 10 ملليمول، 50 ملي مول، 100 ملليمول، 200 ملليمول.
- فصل خلايا عضلة القلب H9c2 عن طريق التربسين ، ثم تحييد الخليط مع DMEM وسط كامل.
- نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 179 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية واخلط الخلايا في وسط DMEM الكامل عن طريق النفخ برفق.
- عد الخلايا باستخدام لوحة عد خلايا الدم22 (انظر جدول المواد) وقم بتخفيفها إلى 5 × 104 خلايا / مل مع وسط DMEM الكامل.
- قسم الخلايا إلى تسعة أجزاء متساوية. أضف DMSO (مخفف بنسبة 1: 1000 مع وسط DMEM الكامل) إلى المجموعة الضابطة وأضف تركيزات مختلفة من الكروسيتين إلى المجموعات المتبقية بنسبة 1: 1000.
- بذر الخلايا في 96 لوحة بئر عند 100 ميكرولتر لكل بئر. تخلص من المادة الطافية بعد الحضانة لمدة 24 ساعة واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
- بعد إضافة 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي DMEM ، احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات وإضافة 20 ميكرولتر من MTS (انظر جدول المواد).
- احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة أخرى ، وقياس الامتصاص بطول موجي 490 نانومتر ، وحساب صلاحية الخلية.
ملاحظة: صلاحية الخلية = (معالجة OD - OD فارغة) / (تحكم OD - OD فارغ) × 100.
3. تحديد نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، الكرياتين كيناز (CK) ، مالوندالديهيد (MDA) ، ديسموتاز الفائق (SOD) ، الجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH Px) ، والكاتلاز (CAT)
- زرع خلايا H9c2 في لوحة 6 آبار بكثافة 1 × 105 خلايا. اجمع المادة الطافية بعد التدخل واكتشف مستويات LDH و SOD ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر جدول المواد).
- اجمع المادة الطافية واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدة. أضف الخلية المحللة إلى طبق الاستزراع واتركها تجلس على الثلج لمدة 20 دقيقة. جمع السائل من طبق الثقافة في أنبوب الطرد المركزي.
- اكتشف مستويات CK و MDA و GSH-Px و CAT وفقا لتعليمات الشركة المصنعة23 (انظر جدول المواد والملف التكميلي 1).
- الكشف عن تركيز البروتين الكلي للتحلل بطريقة حمض bicinchoninic (BCA) لتصحيح تركيز CK و MDA و GSH-Px و CAT24 (انظر جدول المواد).
4. تحديد أنواع الأكسجين التفاعلية
- زرع خلايا H9c2 في صفيحة 48 بئرا بكثافة 5 × 103 خلايا. خفف DCFH-DA (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 1000 مع الوسط الخالي من المصل. تخلص من طافية الخلية واغسل الخلية مرتين بوسط خال من المصل.
- أضف 150 ميكرولتر من DCFH-DA المخفف في كل بئر واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الخلايا ثلاث مرات بوسط خال من المصل والتقط الصور تحت مجهر مضان (انظر جدول المواد).
5. الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا
- اكتشف إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام مجموعة مقايسة جهد غشاء الميتوكوندريا JC-125 (انظر جدول المواد). تخلصي من وسط الاستزراع واغسليه مرة واحدة بوسط خال من المصل.
- أضف حل عمل JC-1 إلى كل أنبوب واخلطهم جيدا. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وغسل الخلايا مرتين مع العازلة تلطيخ JC-1. أضف وسيطا كاملا لكل بئر والتقط صورا تحت المجهر الفلوري.
6. مقايسة تلطيخ TUNEL
- استخدم مجموعة مقايسة موت الخلايا المبرمج TUNEL (انظر جدول المواد) لتحديد معدلات موت الخلايا المبرمج26. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات مرة واحدة بوسط خال من المصل.
- أضف محلول تثبيت الخلايا واغسله ب PBS مرة واحدة بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أضف 0.3٪ تريتون -100 إلى كل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين. أضف محلول عمل الكشف TUNEL واحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 60 دقيقة.
- أضف قرصا مانعا للتسرب مضادا للتألق يحتوي على 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ؛ انظر جدول المواد) والتقط صورا تحت مجهر مضان.
7. مراقبة تدفق الالتهام الذاتي عن طريق نقل الفيروس الغدي mCherry GFP-LC3B
- استبدل نصف الوسط في كل بئر بوسط جديد. أضف الفيروس الغدي Ad-mCherry GFP-LC3B (تعدد العدوى [MOI] من 2) إلى وسط الاستزراع وأضف 5 ميكروغرام / مل من البوليبرين (انظر جدول المواد) لتحسين كفاءة العدوى.
- استبدل الوسط الطازج بعد 24 ساعة ولاحظ تعبير البروتين الفلوري تحت المجهر متحد البؤر.
- استزرع الخلايا بنفس ظروف القسم 1 بعد التأكد من نجاح الإصابة بالفيروس والتقاط الصور تحت المجهر متحد البؤر27.
ملاحظة: أظهر أكثر من 20٪ من الخلايا مضان البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، مما يشير إلى وجود عدوى ناجحة.
8. تحليل اللطخة الغربية
- اجمع الخلايا لاستخراج البروتين الكامل وحللها (RIPA ، مثبط الأنزيم البروتيني ، ومثبط الفوسفاتيز = 100: 1: 1 ؛ انظر جدول المواد) على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- أضف 5x مخزن مؤقت لتحميل البروتين إلى عينة البروتين بعد القياس الكمي للبروتين وقم بغلي العينات لمدة 10 دقائق.
- الكهربائي العينات التي تحتوي على كميات متساوية من البروتين مع الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) المواد الهلامية28. بعد ذلك ، انقل العينات إلى أغشية البولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF).
- سد أغشية PVDF لمدة 1 ساعة مع مسحوق الحليب الخالي من الدسم 5٪ واحتضانها مع الجسم المضاد الأساسي (PINK1 ، Parkin ؛ انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل والجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- اكتشف النطاقات المستهدفة باستخدام محلول التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) ونظام الكشف عن التلألؤ الكيميائي. استخدم برنامج Image J لتحديد النطاقات عبر قياس الكثافة28.
9. الكشف عن إزفاء الميتوكوندريا باركين عن طريق التألق المناعي
- مراقبة colocalization من Parkin مع الميتوكوندريا عن طريق تلطيخ المناعي المزدوج. تخلص من طافي الخلية من كل مجموعة واغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
- ثبت الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 4٪ بارافورمالدهايد وأضف 0.1٪ تريتون -100 في برنامج تلفزيوني.
- كتلة بمحلول كتلة خالية من الحيوانات (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة لمنع الارتباط غير المحدد بين البروتينات والأجسام المضادة وتقليل خلفية التألق.
- احتضان مع الجسم المضاد الأولي (Parkin and Tom20 ؛ انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- أضف جسما مضادا ثانويا فلوريا (انظر جدول المواد) واحتضانه في الظلام لمدة 1 ساعة.
- أضف أقراص التبريد المضادة للتألق المحتوية على DAPI والتقط الصور تحت المجهر متحد البؤر.
10. التحليل الإحصائي
- إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الرسوم البيانية وبرامج التحليل (انظر جدول المواد).
- قارن المتغيرات المستمرة بين المجموعات باستخدام ANOVA. P < 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
آثار الكروسيتين على صلاحية الخلية
كان للكروسيتين عند 0.1 ميكرومتر و 0.5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 5 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر تأثير تكاثري كبير على الخلايا ، بينما منع الكروسيتين بتركيزات أعلى من 200 ميكرومتر بشكل كبير تكاثر خلايا H9c2 (الشكل 1 أ). بعد 4 ساعات من العلاج ب 400 ميكرومتر H 2 O2، تم تقليل صلاحية الخلية بشكل كبير ، ويمكن للكروسيتين عكس هذا التغيير إلى حد ما (الشكل 1B). نظرا لعدم ملاحظة فرق كبير بين 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر كروسيتين على صلاحية خلية H9c2 المستحثة H2O2 ، تم اختيار 10 ميكرومتر كروسيتين كتركيز عال ، وتم استخدام 1 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر كمجموعات جرعة متوسطة ومنخفضة ، على التوالي.
آثار الكروسيتين على LDH و CK و MDA و SOD و GSH-Px و CAT في خلايا H9c2
بعد 4 ساعات من العلاج ب 400 ميكرومتر H 2 O2، زادت مستويات LDH و CK و MDA بشكل ملحوظ ، بينما انخفضت مستويات SOD و GSH-Px و CAT. يمكن للمعالجة المسبقة للكروسيتين 10 ميكرومتر لمدة 24 ساعة عكس التغييرات المذكورة أعلاه ويظهر تأثيرا واضحا يعتمد على الجرعة. كدواء تحكم إيجابي ، يمكن للإنزيم المساعد Q10 فقط تغيير مستويات CK و MDA و SOD (الشكل 2).
تأثير الكروسيتين على أنواع الأكسجين التفاعلية في خلايا عضلة القلب H9c2
كعنصر تحكم فارغ ، لم تعبر خلايا عضلة القلب H9c2 عن أي أنواع حساسية روسية تقريبا. في الوقت نفسه ، يمكن أن يعزز العلاج 400 μMH 2 O2 لمدة 4 ساعات مستوى ROS بشكل ملحوظ ، والذي يمكن عكسه بمقدار 10 ميكرومتر كروسيتين إلى حد ما (الشكل 3). أظهرت نتائج التألق أن التألق الأخضر كان ضعيفا جدا في المجموعة الطبيعية. وبالمقارنة ، يمكن أن يعزز 400 ميكرومترH 2 O2 لمدة 4 ساعات إشارة التألق الخضراء ، ويمكن تقليل هذا التحسين بمقدار 10 ميكرومتر كروسيتين (الشكل 3).
آثار الكروسيتين على إمكانات غشاء الميتوكوندريا الناجم عن H2O2 وموت الخلايا المبرمج
أظهر تلطيخ JC-1 المزيد من التألق الأحمر ومضان أخضر أقل في مجموعة التحكم الفارغة. بعد 4 ساعات من العلاج ب 400 ميكرومتر H 2 O2، لوحظ المزيد من التألق الأخضر ومضان أحمر أقل ، ويمكن أن يعكس 10 ميكرومتر كروسيتين هذا التغيير إلى حد ما (الشكل 4 أ). أظهرت نتائج تلطيخ TUNEL أنه لم يتم اكتشاف الإشارات المتعلقة بموت الخلايا المبرمج في مجموعة التحكم الفارغة ، في حين تم تعزيز الإشارات المتعلقة بموت الخلايا المبرمج بشكل ملحوظ بعد 400 μM H 2 O2لمدة 4 ساعات من العلاج ، والتي يمكن عكسها بمقدار 10 ميكرومتر كروسيتين إلى حد ما (الشكل 4B).
آثار الكروسيتين على الالتهام الذاتي المفرط الناجم عن H 2 O2
لم تظهر خلايا عضلة القلب H9c2 في المجموعة الضابطة الفارغة أي تدفق واضح للالتهام الذاتي. أظهر التألق ظهور بقع صفراء منقطة في خلايا عضلة القلب H9c2 المعالجة مسبقا ب 400 ميكرومتر H 2 O2 لمدة 4 ساعات ، مما يشير إلى فرط واضحفي تنشيط الالتهام الذاتي. ومع ذلك ، تم عكس هذا التغيير بعد المعالجة المسبقة للكروسيتين 10 ميكرومتر. في المجموعة الضابطة ، لا يمكن ملاحظة فيروس Ad-mCherry GFP-LC3B إلا كخلفية صفراء منتشرة ضعيفة عن طريق التألق. ومع ذلك ، لوحظت بقع صفراء منقطة بعد 400 ميكرومتر H 2O2 لمدة 4 ساعات من العلاج ، وتم عكس هذا التغيير بعد المعالجة المسبقة للكروسيتين 10 ميكرومتر (الشكل 5).
الكشف عن الكروسيتين على التعبير عن البروتينات المرتبطة بالميتوفاجي
أظهرت نتائج اللطخة الغربية أنه في المجموعة الضابطة ، كانت مستويات التعبير عن PINK1 و Parkin أقل. في 4 ساعات H 2 O2-تحفيزH9c2 خلايا عضلة القلب ، زادت مستويات التعبير عن PINK1 و Parkin ، في حين أن المعالجة المسبقة للكروسيتين 10 ميكرومتر يمكن أن تقلل من زيادة PINK1 و Parkin (الشكل 6).
الكشف عن تأثير الكروسيتين على نقل الميتوكوندريا باركين
أظهرت نتائج التألق المناعي أن إشارة التألق الحمراء التي تمثل باركين في مجموعة التحكم الفارغة كانت ضعيفة جدا. ومع ذلك ، بعد 400 ميكرومتر H 2O2 لمدة 4 ساعات من العلاج ، تم تعزيز إشارة التألق الحمراء ، وزاد التمركز المشترك مع التألق الأخضر الذي يمثل Tom20. بعد المعالجة المسبقة للكروسيتين 10 ميكرومتر ، تم إضعاف إشارة التألق الحمراء ، وتم تقليل التمركز المشترك مع إشارة التألق الخضراء (الشكل 7).
الشكل 1: الكشف عن صلاحية الخلية بواسطة مقايسة MTT. (أ) تأثيرات الكروسيتين بتركيزات مختلفة على صلاحية الخلية (ن = 6). (ب) تأثيرات الكروسيتين بتركيزات مختلفة على صلاحية الخلية بعد تدخل H 2 02(ن = 6). * p < 0.05 مقابل المجموعة الضابطة ، # p < 0.05 مقابل مجموعة العلاج H 2 O2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكشف عن مستويات LDH و CK و MDA و SOD و GSH-Px و CAT. (أ) مستوى LDH في طافية الخلية (ن = 6). (ب) مستوى CK في الخلية المحللة (ن = 6). (ج) مستوى MDA في محللة الخلية (ن = 6). (د) مستوى SOD في طافية الخلية (ن = 6). (ه) مستوى GSH-Px في الخلية المحللة (ن = 6). (F) مستوى CAT في الخلية المحللة (ن = 6). * p < 0.05 مقابل مجموعة التحكم الفارغة ، # p < 0.05 مقابل مجموعة العلاج H 2 O2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أنواع الأكسجين التفاعلية التي يحددها DCFH-DA. (أ) تم استخدام DCFH-DA لقياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في خلايا عضلة القلب H9c2. روس: أخضر. (ب) بيانات القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية. (أ) الخلايا العضلية القلبية H9c2 دون علاج. (ب) الخلايا العضلية القلبية H9c2 المحفزة ب 400 ميكرومتر H 2O 2 لمدة 4 ساعات. (ج) خلايا H9c2 المعالجة مسبقا ب 10 ميكرومتر كروسيتين لمدة 24 ساعة ثم حفزت ب 400 ميكرومتر H 2 O 2لمدة 4 ساعات. شريط المقياس = 24 ميكرومتر. * p < 0.05 مقابل مجموعة التحكم الفارغة ، # p < 0.05 مقابل مجموعة العلاج H 2 O2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكشف عن جهد غشاء الميتوكوندريا وموت الخلايا المبرمج. (أ) تم تحديد جهد غشاء الميتوكوندريا بواسطة تلطيخ JC-1. مجاميع JC-1: أحمر ؛ مونومرات JC-1: أخضر. (ب) تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ TUNEL في خلايا H9c2. توليفة: أخضر. دابي: أزرق. (أ) الخلايا العضلية القلبية H9c2 دون علاج. (ب) الخلايا العضلية القلبية H9c2 المحفزة ب 400 ميكرومتر H 2O 2 لمدة 4 ساعات. (ج) خلايا H9c2 المعالجة مسبقا ب 10 ميكرومتر كروسيتين لمدة 24 ساعة ثم حفزت ب 400 ميكرومتر H 2 O 2لمدة 4 ساعات. قضبان المقياس = 72 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تدفق الالتهام الذاتي المكتشف بواسطة الفيروس الغدي mCherry-GFP-LC3B. mCherry: أحمر; هيئة أجيال السلام: خضراء. (أ) الخلايا العضلية القلبية H9c2 دون علاج. (ب) الخلايا العضلية القلبية H9c2 المحفزة ب 400 ميكرومتر H 2O 2 لمدة 4 ساعات. (ج) خلايا H9c2 المعالجة مسبقا ب 10 ميكرومتر كروسيتين لمدة 24 ساعة ثم حفزت ب 400 ميكرومتر H 2 O 2لمدة 4 ساعات. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تم الكشف عن محتوى البروتينات المرتبطة بالميتوفاجي بواسطة النشاف الغربي. (أ) لطخة غربية تمثيلية توضح تعبير PINK1 و Parkin. تم اعتماد β-actin كمرجع داخلي. (ب) تعبير PINK1 النسبي (ن = 3). (ج) تعبير باركين النسبي (ن = 3). * p < 0.05 مقابل المجموعة الضابطة ، # p < 0.05 مقابل مجموعة العلاج H 2 O2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الكشف عن انتقال الميتوكوندريا لباركين عن طريق التلوين المزدوج بالتألق المناعي. بروتين باركين المسمى بالفلورة الحمراء وبروتين مضان أخضر يحمل علامة Tom20. باركين: أحمر. Tom20: أخضر ؛ دابي: أزرق). (أ) الخلايا العضلية القلبية H9c2 دون علاج. (ب) الخلايا العضلية القلبية H9c2 المحفزة ب 400 ميكرومتر H 2O 2 لمدة 4 ساعات. (ج) خلايا H9c2 المعالجة مسبقا ب 10 ميكرومتر كروسيتين لمدة 24 ساعة ثم حفزت ب 400 ميكرومتر H 2 O 2لمدة 4 ساعات. قضبان المقياس = 24 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: تعليمات العمل الخاصة بمقايسات LDH و CK و MDA و SOD و GSH-Px و CAT. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان استكشاف المكونات الفعالة من المركبات المعقدة للعقاقير الطبيعية من خلال التكنولوجيا المتقدمة نقطة ساخنة لأبحاث الطب الصيني التقليدي29 ، ويمكن أن يوفر أدلة مختبرية لتطوير الأدوية في المستقبل بعد التحقق. القرطم هو دواء تمثيلي في علاج "تعزيز الدورة الدموية وتقليل ركود الدم" ويستخدم على نطاق واسع في علاج احتشاء عضلة القلب30,31. يعتقد أن الزعفران له تأثيرات مماثلة للقرطم ، وتأثيره في تعزيز الدورة الدموية وإزالة ركود الدم أفضل بكثير من القرطم31,32. الكروسيتين هو أحد المكونات النشطة الرئيسية للزعفران33 ، لذلك تم استخدامه في دراسة هذه التجربة.
H2O2 يمكن أن يسبب إصابة الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب ومحاكاة حالة احتشاء عضلة القلب من خلايا عضلة القلب ، والتي تم تأسيسها كنموذج لاحتشاء عضلة القلب في المختبر34. في هذه الدراسة ، يمكن أن يؤدي التركيز المنخفض للكروستين إلى تعزيز صلاحية الخلايا العضلية القلبية ، والتي قد تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا بتنشيط استقلاب طاقة الميتوكوندريا. يمكن للكروسيتين استعادة انخفاض صلاحية خلايا عضلة القلب التي يسببها H 2 O2وله تأثير يعتمد على الجرعة ، مما يشير إلى أن الكروسيتين يمكن أن يحسن تلف الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب. وفي الوقت نفسه ، يمكن للكروسيتين أن يعكس بشكل فعال تلف عضلة القلب ومؤشرات الإجهاد التأكسدي الناجمة عن H 2 O2، مما يؤكد تأثيره الوقائي لعضلة القلب.
يعد الانخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا أحد الأحداث المميزة في المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج35. تتجمع أصباغ JC-1 بطريقة تعتمد على الإمكانات داخل الميتوكوندريا. في مصفوفة الميتوكوندريا العادية ، يشكل JC-1 بوليمر فلوري باللون الأحمر. عندما ينهار جهد غشاء الميتوكوندريا ، ينبعث JC-1 مضان أخضر مثلالمونومرات 36. يكتشف TUNEL فواصل حبلا الحمض النووي النووي في المراحل المتأخرة من موت الخلايا المبرمج37. تعمل الخلايا المبرمج على تنشيط إنزيمات الحمض النووي الداخلية التي تقطع الحمض النووي الجينومي بين النيوكليوسومات ، ويمكن اكتشاف 3'-OH المكشوف باستخدام مسبار الفلورسنت الأخضر المسمى dUTP (FITC) الذي يحفزه ترانسفيراز ديوكسي نيوكليوتيديلالطرفي 37. تظهر نتائج هذه الدراسة أن إمكانات غشاء الميتوكوندريا انخفضت وظهر موت الخلايا المبرمج للخلايا العضلية القلبية بعد نمذجة H2 O2. يمكن عكس التغييرات بواسطة الكروسيتين إلى حد ما ، مما يشير إلى أن الكروسيتين يمكن أن يمنع بشكل فعال موت الخلايا المبرمج لخلايا عضلة القلب الناتجة عن الإجهاد التأكسدي.
PINK1 / Parkin هو مسار كلاسيكي يتوسط الميتوفاجي38. يتراكم PINK1 على غشاء الميتوكوندريا الخارجي بعد تلف الميتوكوندريا ويتم تجنيد Parkin لإدخال بروتين الغشاء خارج الميتوكوندريا في كل مكان ، والذي يرتبط ببروتينات المستقبلات المرتبطة بالالتهام الذاتي لتشكيل البلعمة الذاتية ، مما يشير إلى حدوث الميتوفاجي39،40،41. أظهرت النتائج أن مستويات البروتين في PINK1 و Parkin قد زادت في خلايا عضلة القلب بعد نمذجة H 2 O2، مما يشير إلى الالتهام الذاتي المفرط. بعد تدخل الكروسيتين ، تم عكس مستويات البروتين في PINK1 و Parkin في خلايا عضلة القلب المعالجة ب H 2 O2إلى حد ما ، مما يشير إلى أنه قد يلعب دورا علاجيا عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي المفرط للميتوكوندريا. في هذه الدراسة ، قلل الكروسيتين من الضرر التأكسدي الناجم عن H2O2 وموت الخلايا المبرمج لخلايا عضلة القلب H9c2 ، ومن المتوقع أن هذا التأثير يمكن تحقيقه من خلال التأثير على مسار PINK1 / Parkin لمنع الميتوفاجي المفرط.
أظهرت هذه التجربة تدخل المسحوق المجفف بالتجميد العشبي على الإجهاد التأكسدي الخلوي والميتوفاجي. كان استخدام الفيروس الغدي mCherry-GFP-LC3B لمراقبة الالتهام الذاتي للميتوكوندريا خطوة حاسمة في التجربة. كان مفتاح نجاح هذه الخطوة هو زيادة معدل الإصابة بالخلايا ، وأضيف بوليبرين كاشف العدوى الفيروسية إلى الوسط مسبقا لزيادة كفاءة العدوى بشكل كبير. وقد تحقق ذلك عن طريق تحييد التنافر الكهروستاتيكي بين حمض السياليك على سطح الخلية والجسيمات الفيروسية ، وبالتالي تسهيل الامتزاز. تجدر الإشارة أيضا إلى أنه ، كفيروس آمن نسبيا ، على الرغم من أن جينوم الفيروس الغدي لا يندمج في جينوم الخلية المضيفة بعد الإصابة ولا يتكاثر في الخلية ، إلا أنه لا يزال خطيرا من الناحية البيولوجية. لذلك ، يوصى بإجراء التجارب في ظل الامتثال الصارم للمتطلبات التنظيمية.
يعد وضع العلامات الفلورية طريقة شائعة للكشف عن الميتوفاجي ، ولكن نظرا لضعف خصوصيته ، قد يتم تصنيف عضيات أخرى بشكل غير صحيح وبالتالي تتداخل مع النتائج التجريبية41. مع استمرار التقدم التكنولوجي ، يمكننا أن نتوقع تطوير مجسات فلورية أكثر دقة وموثوقية لاستكشاف آلية الميتوفاجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (رقم 7202119) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82274380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
