Summary
Baserat på in vitro-experiment avslöjade denna studie mekanismen för krocetin vid reparation av oxidativ stressskada av kardiomyocyter genom att påverka mitofagi, där PINK1 / Parkin-signalvägen spelar en viktig roll.
Abstract
Denna studie syftade till att undersöka den oxidativa stressskyddande effekten av krocetin påH2O2-medierade H9c2-myokardceller genom in vitro-experiment och ytterligare undersöka om dess mekanism är relaterad till effekten av mitofagi. Denna studie syftade också till att visa den terapeutiska effekten av safflorsyra på oxidativ stress i kardiomyocyter och undersöka om dess mekanism är relaterad till effekten av mitofagi. Här konstruerades enH2O2-baseradoxidativ stressmodell och bedömde graden av oxidativ stressskada hos kardiomyocyter genom att detektera nivåerna av laktatdehydrogenas (LDH), kreatinkinas (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT) och glutationperoxidas (GSH Px). Reaktiva syreradikaler (ROS)-detekterande fluorescerande färgämne DCFH-DA, JC-1-färgämne och TUNEL-färgämne användes för att bedöma mitokondriella skador och apoptos. Autofagiskt flöde mättes genom transfektering av Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-relaterade proteiner detekterades sedan via western blotting och immunofluorescens. Krocetin (0,1-10 μM) kan emellertid avsevärt förbättra cellviabiliteten och minska apoptos och oxidativ stressskada orsakad avH2O2. I celler med överdriven autofagisk aktivering kan krocetin också minska autofagiflödet och uttrycket av mitofagirelaterade proteiner PINK1 och Parkin och vända överföringen av Parkin till mitokondrier. Kroketin kunde minska H2O2-medierad oxidativ stressskada och apoptos av H9c2-celler, och dess mekanism var nära relaterad till mitofagi.
Introduction
Akut hjärtinfarkt (AMI) är en livshotande myokardinakros orsakad av svår och ihållande ischemi och hypoxi i kranskärlen 1,2. Perkutan koronar intervention (PCI) är en av de första linjens terapeutiska strategier för AMI och skyddar vanligtvis kardiomyocyter från ischemisk skada 3,4. Det distala myokardiet kommer att sakna blod- och syretillförsel om det inte behandlas snabbt och effektivt efter AMI, vilket leder till ischemisk nekros och ytterligare kardiovaskulära komplikationer 5,6. Att främja kardiomyocytåterhämtning och minimera irreversibel myokardskada efter att ha missat PCI-kirurgiska möjligheten har varit en forskningshotspot. Efter AMI är kardiomyocyter i ett tillstånd av ischemi och hypoxi, vilket resulterar i hämning av mitokondriell oxidativ fosforylering, reduktion av NAD + till NADPH och ökad enelektronreduktion7. Som ett resultat genererar den ofullständiga reduktionsreaktionen av syre ett överskott av reaktiva syrearter (ROS) och leder slutligen till oxidativ stressskada på kardiomyocyter8. En överdriven ackumulering av ROS utlöser lipidperoxidation, vilket ytterligare stör strukturen och funktionen hos mitokondriella membran. Resultatet är en kontinuerlig öppning av mitokondriella permeabilitetsövergångsporer och en minskning av mitokondriell membranpotential, inducerande apoptos och nekros.
Angiotensinkonverterande enzym (ACE) -hämmare, angiotensinreceptorblockerare (ARB), hämmare av β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister och andra standardläkemedel i AMI kan bidra till att förbättra hjärtfunktionen efter hjärtinfarkt och förhindra förekomsten av maligna händelser, såsom arytmier och vänster ventrikulär remodellering9. Överlevnad och prognos efter infarkt påverkas dock kraftigt av infarktstorlek, och tillfredsställande resultat har inte uppnåtts för att minska kardiomyocytapoptos10,11. Således har utvecklingen av läkemedel för att främja kardiomyocytåterhämtning efter hjärtinfarkt blivit en brådskande fråga.
Traditionell medicin har varit en inspirationskälla för modern läkemedelsforskning i många år12,13,14,15. Traditionell kinesisk medicin (TCM) har en lång historia vid behandling av AMI, och en serie randomiserade kontrollstudier de senaste åren har bekräftat att TCM verkligen kan förbättra prognosen för patienter16,17. Enligt TCM-teorin orsakas AMI av blodstasis18,19, så läkemedel för att främja blodcirkulationen används vanligtvis för behandling av AMI i akut fas20. Bland dem tros saffran ha en kraftfull effekt på blodaktivering och stasis och används ofta vid akut behandling av AMI. Krocetin, en viktig komponent i saffran, kan spela en nyckelroll för att skydda kardiomyocyter21.
I denna studie inducerades H9c2-myokardceller avH2O2för att simulera myokardischemi / reperfusion, vilket orsakar en kardiomyocytskada av AMI, och kroketin användes som en intervention för att undersöka dess skyddande effekt mot oxidativ stressinducerad myokardskada. Mekanismen för krocetin som skyddar kardiomyocyter undersöktes ytterligare genom mitofagi. Ännu viktigare är att denna artikel ger en referens för det tekniska tillvägagångssättet för studier av mitofagi och beskriver hela experimentproceduren i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes i fysiologilaboratoriet vid Beijing University of Chinese Medicine, Kina. Alla studiemetoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter från Peking University.
1. Cellodling
- Tillsätt 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin till Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) basmedium (med 4,5 g / L D-glukos, 4 g / L L-glutamin och 110 mg / L natriumpyruvat; se materialförteckning) för att förbereda DMEM komplett medium.
- Tina de flytande kvävefrysta H9c2-myokardceller (se materialtabell) i varmt vatten vid 37 °C under en snabb och jämn omrörning tills isen smälter.
- Överför cellerna till ett centrifugrör och tillsätt fyra gånger volymen av DMEM komplett medium. Centrifugera vid 358 x g i 5 min vid rumstemperatur och kassera supernatanten med pipett.
- Späd den erhållna cellsuspensionen med odlingsmedium, blås försiktigt och inokulera cellerna i en odlingskolv. Odling i en inkubator vid 37 °C med 5%CO2.
2. Bestämning av cellviabilitet
- Lös krocetin (se materialtabell) i dimetylsulfoxid (DMSO) till koncentrationer av 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM och 200 mM.
- Dissociera H9c2-myokardcellerna med trypsin och neutralisera sedan blandningen med DMEM komplett medium.
- Överför cellerna till ett centrifugrör och centrifugera vid 179 x g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och blanda cellerna i DMEM komplett medium genom att blåsa försiktigt.
- Räkna cellerna med hjälp av en blodcellsräkningsplatta22 (se materialtabell) och späd dem till 5 × 104 celler/ml med DMEM komplett medium.
- Dela cellerna i nio lika delar. Tillsätt DMSO (utspädd i förhållandet 1:1 000 med DMEM komplett medium) till kontrollgruppen och tillsätt olika koncentrationer av crocetin till de återstående grupperna i förhållandet 1:1 000.
- Frö cellerna i 96-brunnsplattor med 100 μL per brunn. Kassera supernatanten efter inkubation i 24 timmar och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Efter tillsats av 100 μL DMEM basalmedium, inkubera cellerna i 4 timmar och tillsätt 20 μL MTS (se materialtabell).
- Inkubera cellerna i ytterligare 2 timmar, mät absorbansen vid en våglängd av 490 nm och beräkna cellviabiliteten.
OBS: Cellviabilitet = (OD-behandlad - OD-blank) / (OD-kontroll - OD-tom) × 100.
3. Bestämning av laktatdehydrogenas (LDH), kreatinkinas (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutas (SOD), glutationperoxidas (GSH Px) och katalas (CAT)
- Frö H9c2-cellerna i en 6-brunnsplatta med en densitet av 1 × 105 celler. Samla supernatanten efter ingreppet och detektera LDH- och SOD-nivåer enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Samla supernatanten och tvätta den med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en gång. Tillsätt celllysatet i odlingsskålen och låt det sitta på is i 20 minuter. Samla vätskan från odlingsskålen i ett centrifugrör.
- Upptäck CK-, MDA-, GSH-Px- och CAT-nivåer enligt tillverkarens instruktioner23 (se materialförteckning och kompletterande fil 1).
- Detektera den totala proteinkoncentrationen av lysen med bicinchoninsyrametoden (BCA) för att korrigera koncentrationen av CK, MDA, GSH-Px och CAT24 (se materialtabell).
4. Fastställande av ROS
- Frö H9c2-cellerna i en 48-brunnsplatta med en densitet av 5 × 103 celler. Späd DCFH-DA (se Materialtabell) i förhållandet 1:1 000 med det serumfria mediet. Kassera cellsupernatanten och tvätta cellen två gånger med ett serumfritt medium.
- Tillsätt 150 μl utspädd DCFH-DA i varje brunn och inkubera vid 37 °C i 20 minuter. Tvätta cellerna tre gånger med ett serumfritt medium och ta bilder under ett fluorescensmikroskop (se materialtabell).
5. Detektion av mitokondriell membranpotential
- Detektera mitokondriell membranpotential med hjälp av en JC-1 mitokondriell membranpotentialanalyssats25 (se materialtabell). Kassera odlingsmediet och tvätta dem en gång med serumfritt medium.
- Tillsätt JC-1 arbetslösning till varje rör och blanda dem väl. Inkubera vid 37 °C i 20 minuter och tvätta cellerna två gånger med JC-1-färgningsbuffert. Lägg till komplett medium till varje brunn och ta fotografier under ett fluorescensmikroskop.
6. TUNEL färgning analys
- Använd ett TUNEL apoptosanalyskit (se materialförteckning) för att bestämma apoptoshastigheter26. Kassera supernatanten och tvätta pelleten en gång med serumfritt medium.
- Tillsätt cellfixeringslösning och tvätta dem med PBS en gång efter inkubation vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Tillsätt 0,3% triton-100 till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Tvätta cellerna med PBS två gånger. Tillsätt arbetslösningen för TUNEL-detektering och inkubera vid 37 °C i mörker i 60 minuter.
- Tillsätt en tätningstablett mot fluorescenssläckning innehållande 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; se materialförteckning) och ta bilder under ett fluorescensmikroskop.
7. Övervakning av autofagiskt flöde genom transfektion av mCherry GFP-LC3B adenovirus
- Byt ut hälften av mediet i varje brunn med färskt medium. Tillsätt Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus (infektionsmultiplicitet [MOI] av 2) till odlingsmediet och tillsätt 5 μg/ml polybrene (se materialtabell) för att förbättra infektionseffektiviteten.
- Byt ut det färska mediet efter 24 timmar och observera uttrycket av det fluorescerande proteinet under ett konfokalmikroskop.
- Odla cellerna med samma förhållanden som avsnitt 1 efter att ha bekräftat framgångsrik virusinfektion och ta bilder under konfokalmikroskopet27.
OBS: Mer än 20% av cellerna visade fluorescens av grönt fluorescerande protein (GFP), vilket indikerar en framgångsrik infektion.
8. Western blot-analys
- Samla celler för helproteinextraktion och lysera dem (RIPA, proteashämmare och fosfatashämmare = 100:1:1; se materialförteckning) på is i 30 minuter.
- Tillsätt 5x proteinladdningsbuffert till proteinprovet efter proteinkvantifiering och koka proverna i 10 minuter.
- Elektrofores: de prover som innehåller lika stora mängder protein med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) geler28. Överför sedan proverna till polyvinylidendifluoridmembran (PVDF).
- Blockera PVDF-membranen i 1 timme med 5 % skummjölkspulver och inkubera med den primära antikroppen (PINK1, Parkin; se materialtabell) vid 4 °C över natten och den sekundära antikroppen vid rumstemperatur i 1 timme.
- Detektera målbanden med hjälp av förbättrad kemiluminiscenslösning (ECL) och kemiluminiscensdetekteringssystemet. Använd Image J-programvara för att kvantifiera banden via densitometri28.
9. Detektion av Parkins mitokondriella translokation genom immunofluorescens
- Observera samlokalisering av Parkin med mitokondrier genom dubbel immunofluorescensfärgning. Kassera cellsupernatanten från varje grupp och tvätta dem tre gånger med PBS.
- Fixera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur med 4% paraformaldehyd och tillsätt 0,1% triton-100 i PBS.
- Blockera med djurfri blocklösning (se materialtabell) i 1 timme för att förhindra ospecifik bindning mellan proteiner och antikroppar och minska fluorescensbakgrunden.
- Inkubera med en primär antikropp (Parkin och Tom20; se Materialtabell) vid 4 °C över natten.
- Tillsätt en fluorescerande sekundär antikropp (se materialtabell) och inkubera i mörker i 1 timme.
- Lägg till de DAPI-innehållande antifluorescenssläckningstabletterna och ta bilder under konfokalmikroskopet.
10. Statistisk analys
- Utföra statistisk analys med hjälp av graf- och analysprogram (se Materialförteckning).
- Jämför kontinuerliga variabler mellan grupper med hjälp av enkelriktad ANOVA. p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av crocetin på cellviabilitet
Kroketin vid 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM och 100 μM hade en signifikant proliferativ effekt på celler, medan kroketin vid koncentrationer över 200 μM signifikant hämmade spridningen av H9c2-celler (figur 1A). Efter 4 timmars behandling med 400 μMH2O2minskade cellviabiliteten avsevärt och krocetin kunde vända denna förändring i viss utsträckning (figur 1B). Eftersom ingen signifikant skillnad mellan 10 μM och 100 μM crocetin observerades på H2O2-inducerad H9c2-cellviabilitet, valdes 10 μM crocetin som den höga koncentrationen och 1 μM och 0,1 μM användes som medeldos- respektive lågdosgrupper.
Effekter av crocetin på LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px och CAT i H9c2-celler
Efter 4 timmars behandling med 400 μMH2O2ökade nivåerna av LDH, CK och MDA avsevärt, medan nivåerna av SOD, GSH-Px och CAT minskade. Förbehandling av 10 μM crocetin i 24 timmar kan vända ovanstående förändringar och visar en uppenbar dosberoende effekt. Som ett positivt kontrollläkemedel kan koenzym Q10 endast ändra nivåerna av CK, MDA och SOD (figur 2).
Effekten av crocetin på ROS i H9c2-kardiomyocyter
Som en blank kontroll uttryckte H9c2-kardiomyocyter nästan ingen ROS. Samtidigt kan 400 μMH2O2för 4 timmars behandling förbättra ROS-nivån avsevärt, vilket kan vändas med 10 μM crocetin i viss utsträckning (figur 3). Fluorescensresultaten visade att grön fluorescens var mycket svag i normalgruppen. Som jämförelse kan 400 μMH2O2för 4 timmars behandling förstärka den gröna fluorescenssignalen, och denna förbättring kan minskas med 10 μM crocetin (figur 3).
Effekter av crocetin på H2O2-inducerad mitokondriell membranpotential och apoptos
JC-1-färgning visade mer röd fluorescens och mindre grön fluorescens i den tomma kontrollgruppen. Efter 4 timmars behandling av 400 μMH2O2observerades mer grön fluorescens och mindre röd fluorescens, och 10 μM crocetin kunde i viss mån vända denna förändring (figur 4A). TUNEL-färgningsresultaten visade att apoptosrelaterad signalering inte detekterades i den tomma kontrollgruppen, medan den apoptosrelaterade signaleringen förbättrades märkbart efter 400 μMH2O2under 4 timmars behandling, vilket till viss del kunde reverseras med 10 μM crocetin (figur 4B).
Effekter av crocetin på H2O2-inducerad överdriven autofagi
H9c2-kardiomyocyter i den tomma kontrollgruppen visade inget uppenbart autofagiflöde. Fluorescens visade utseendet av punkterade gula fläckar i H9c2-kardiomyocyter förbehandlade med 400 μMH2O2i 4 timmar, vilket indikerar en uppenbar överaktivering av autofagi. Denna förändring vändes dock efter 10 μM crocetinförbehandling. I kontrollgruppen kunde Ad-mCherry GFP-LC3B-viruset endast observeras som en svag diffus gul bakgrund genom fluorescens. Punkterade gula fläckar observerades dock efter 400 μMH2O2under 4 timmars behandling, och denna förändring reverserades efter 10 μM crocetinförbehandling (figur 5).
Detektion av crocetin på uttrycket av mitofagirelaterade proteiner
Western blot-resultat visade att i kontrollgruppen var uttrycksnivåerna av PINK1 och Parkin lägre. I 4 h H2O2-stimulerade H9c2-kardiomyocyter ökade uttrycksnivåerna av PINK1 och Parkin, medan 10 μM crocetin-förbehandlingen kunde minska ökningen av PINK1 och Parkin (figur 6).
Detektion av effekten av crocetin på translokationen av Parkin mitokondrier
Immunofluorescensresultaten visade att den röda fluorescenssignalen som representerade Parkin i den tomma kontrollgruppen var mycket svag; men efter 400 μM H2O2 under 4 timmars behandling förbättrades den röda fluorescenssignalen och samlokaliseringen med den gröna fluorescensen som representeradeTom20ökade. Efter förbehandlingen av 10 μM crocetin försvagades den röda fluorescenssignalen och samlokaliseringen med den gröna fluorescenssignalen reducerades (figur 7).
Figur 1: Påvisande av cellviabilitet med MTT-test. a) Effekter av krocetin vid olika koncentrationer på cellviabiliteten (n = 6). (B) Effekter av krocetin vid olika koncentrationer på cellviabiliteten efter H 2 02intervention (n = 6). *p < 0,05 jämfört med kontrollgruppen, #p < 0,05 jämfört medH2O2-behandlingsgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Detektion av LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- och CAT-nivåer. (A) LDH-nivå i cellsupernatant (n = 6). (B) CK-nivå i celllysat (n = 6). (C) MDA-nivå i celllysat (n = 6). (D) SOD-nivå i cellsupernatant (n = 6). (E) GSH-Px-nivå i celllysat (n = 6). (F) CAT-nivå i celllysat (n = 6). *p < 0,05 jämfört med blank kontrollgrupp, #p < 0,05 jämfört medH2O2-behandlingsgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: ROS fastställd av DCFH-DA. (A) DCFH-DA användes för att mäta ROS-nivåer i H9c2-kardiomyocyter. ROS: grön. (B) Kvantifieringsuppgifter för ROS. a) H9c2-kardiomyocyter utan behandling. b) H9c2-kardiomyocyter stimulerade med 400 μM H2O2 under 4 timmar. c) H9c2-celler som förbehandlats med 10 μM krocetin i 24 timmar och därefter stimulerats med 400 μMH2O2under 4 timmar. Skalstapel = 24 μm. *p < 0,05 jämfört med blank kontrollgrupp, #p < 0,05 jämfört medH2O2-behandlingsgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Detektion av mitokondriell membranpotential och apoptos. (A) Mitokondriell membranpotential bestämdes genom JC-1-färgning. JC-1 aggregat: röd; JC-1-monomerer: grön. (B) Apoptos detekterades genom TUNEL-färgning i H9c2-celler. TUNEL: grön; DAPI: blå. a) H9c2-kardiomyocyter utan behandling. b) H9c2-kardiomyocyter stimulerade med 400 μM H2O2 under 4 timmar. c) H9c2-celler som förbehandlats med 10 μM krocetin i 24 timmar och därefter stimulerats med 400 μMH2O2under 4 timmar. Skalstreck = 72 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Autofagiskt flöde detekterat av mCherry-GFP-LC3B adenovirus. mCherry: röd; GFP: grön. a) H9c2-kardiomyocyter utan behandling. b) H9c2-kardiomyocyter stimulerade med 400 μM H2O2 under 4 timmar. c) H9c2-celler som förbehandlats med 10 μM krocetin i 24 timmar och därefter stimulerats med 400 μMH2O2under 4 timmar. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Innehållet av mitofagirelaterade proteiner detekterades genom western blotting. (A) Representativ western blot som illustrerar PINK1 och Parkin-uttryck. β-aktin antogs som intern referens. (B) Relativt PINK1-uttryck (n = 3). (C) Relativt Parkin-uttryck (n = 3). *p < 0,05 jämfört med kontrollgruppen, #p < 0,05 jämfört medH2O2-behandlingsgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Detektion av Parkins mitokondriella translokation genom immunofluorescens dubbelfärgning. Röd fluorescensmärkt Parkins protein och grön fluorescens märkt-Tom20-protein. Parkin: röd; Tom20: grön; DAPI: blå). a) H9c2-kardiomyocyter utan behandling. b) H9c2-kardiomyocyter stimulerade med 400 μM H2O2 under 4 timmar. c) H9c2-celler som förbehandlats med 10 μM krocetin i 24 timmar och därefter stimulerats med 400 μMH2O2under 4 timmar. Skalstreck = 24 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Arbetsinstruktionerna för LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- och CAT-analyser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utforskningen av effektiva ingredienser från komplexa föreningar av naturliga läkemedel genom avancerad teknik har varit en hotspot för TCM-forskning29 och kan ge laboratoriebevis för framtida läkemedelsutveckling efter verifiering. Safflor är ett representativt läkemedel vid behandling av "främjande av blodcirkulationen och minimering av blodstasis" och används ofta vid behandling av hjärtinfarkt30,31. Saffran tros ha liknande effekter som safflor, och dess effekt för att främja blodcirkulationen och ta bort blodstasis är signifikant bättre än safflor31,32. Kroketin är en av de viktigaste aktiva komponenterna i saffran33, så den användes i studien av detta experiment.
H2O2kan orsaka oxidativ stressskada hos kardiomyocyter och simulera hjärtinfarkttillståndet hos kardiomyocyter, vilket etableras som en modell för hjärtinfarkt in vitro34. I denna studie kan en låg koncentration av krocetin främja cellviabiliteten hos kardiomyocyter, vilket kan vara nära relaterat till aktiveringen av mitokondriell energimetabolism. Kroketin kan återställa den minskade livskraften hos kardiomyocyter inducerade avH2O2och har en dosberoende effekt, vilket tyder på att kroketin kan förbättra oxidativ stressskada av kardiomyocyter. Under tiden kan crocetin effektivt vända myokardskada och oxidativa stressindex orsakade avH2O2, vilket ytterligare bekräftar dess myokardskyddande effekt.
Minskningen av mitokondriell membranpotential är en av de kännetecknande händelserna i de tidiga stadierna av apoptos35. JC-1-färgämnen aggregerar på ett potentialberoende sätt inom mitokondrierna. I den normala mitokondriella matrisen bildar JC-1 en fluorescerande polymer i rött. När mitokondriemembranpotentialen kollapsar avger JC-1 grön fluorescens som monomerer36. TUNEL detekterar nukleära DNA-strängbrott i de sena stadierna av apoptos37. Apoptotiska celler aktiverar DNA-endonukleasenzymer som skär genomiskt DNA mellan nukleosomer och exponerad 3'-OH kan detekteras med grön fluorescerande sondfluorescein (FITC) -märkt dUTP katalyserad av terminala deoxinukleotidyltransferaser37. Resultaten av denna studie visar att mitokondriell membranpotential minskade och apoptos av kardiomyocyter uppträdde efter H2O2-modellering; Förändringarna kan vändas av crocetin i viss utsträckning, vilket tyder på att crocetin effektivt kan hämma apoptos av kardiomyocyter orsakade av oxidativ stress.
PINK1/Parkin är en klassisk väg som förmedlar mitofagi38. PINK1 ackumuleras på det yttre mitokondriella membranet efter mitokondriell skada och Parkin rekryteras för att ubiquitinera det extramitokondriella membranproteinet, som binder till autofagirelaterade receptorproteiner för att bilda autofagosomer, vilket markerar förekomsten av mitofagi39,40,4 1. Resultaten visar att proteinnivåerna av PINK1 och Parkin ökade i kardiomyocyter efter H2O2-modellering,vilket tyder på överdriven autofagi. Efter ingreppet av kroketin vändes proteinnivåerna av PINK1 och Parkin i kardiomyocyter behandlade medH2O2i viss utsträckning, vilket tyder på att det kan spela en terapeutisk roll genom att hämma överdriven mitokondriell autofagi. I denna studie reducerade krocetin H2O2-inducerad oxidativ skada och apoptos av H9c2-kardiomyocyter, och det spekuleras att denna effekt kan uppnås genom att påverka PINK1 / Parkin-vägen för att hämma överdriven mitofagi.
Detta experiment visade ingripande av växtbaserade lyofiliserade pulver på cellulär oxidativ stress och mitofagi. Att använda mCherry-GFP-LC3B adenovirus för att observera mitokondriell autofagi var ett avgörande steg i experimentet. Nyckeln till framgången med detta steg var att öka infektionshastigheten hos cellerna, och det provirala infektionsreagenset polybrene tillsattes till mediet i förväg för att öka infektionseffektiviteten kraftigt. Detta uppnåddes genom att neutralisera den elektrostatiska repulsionen mellan cellytans sialinsyra och viruspartiklarna, vilket underlättade adsorptionen. Det är också värt att notera att som ett relativt säkert virus, även om adenovirusgenomet inte integreras i värdcellgenomet efter infektion och inte replikeras i cellen, är det fortfarande potentiellt biologiskt farligt. Därför rekommenderas att experimenten utförs under strikt överensstämmelse med lagstadgade krav.
Fluorescerande märkning är en vanlig metod för att detektera mitofagi, men på grund av dess dåliga specificitet kan andra organeller vara felaktigt märkta och därmed störa de experimentella resultaten41. I takt med att tekniska framsteg fortsätter kan vi förvänta oss att utvecklingen av mer exakta och tillförlitliga fluorescerande sonder kommer att ytterligare utforska mitofagimekanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Beijing Natural Science Foundation (nr 7202119) och National Natural Science Foundation of China (nr 82274380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
