Summary
本研究在体外实验的基础上揭示了藏红花素通过影响线粒 体 自噬修复心肌细胞氧化应激损伤的机制，其中PINK1/Parkin信号通路起重要作用。
Abstract
本研究旨在通过体外实验探讨藏红花素对H2O2介导的H9c2心肌细胞的氧化应激保护作用，并进一步探讨其机制是否与线粒体自噬的影响有关。本研究还旨在证明红花酸对心肌细胞氧化应激的治疗作用，并探讨其机制是否与线粒体自噬的作用有关。本文构建了基于H2O2的氧化应激模型，通过检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）的水平，评估了心肌细胞的氧化应激损伤程度。采用活性氧（ROS）检测荧光染料DCFH-DA、JC-1染料和TUNEL染料评估线粒体损伤和凋亡。通过转染Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒测量自噬通量。然后通过蛋白质印迹和免疫荧光检测线粒体自噬相关蛋白。然而，藏红花素（0.1-10μM）可以显着提高细胞活力，减少由H2O2引起的细胞凋亡和氧化应激损伤。在自噬过度激活的细胞中，藏红花素还可以减少自噬流量和线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达，并逆转Parkin向线粒体的转移。藏红花素可减少H2O2介导的氧化应激损伤和H9c2细胞凋亡，其机制与线粒体自噬密切相关。
Introduction
急性心肌梗死（AMI）是一种危及生命的心肌坏死，由冠状动脉严重和持续的缺血和缺氧引起1,2。经皮冠状动脉介入治疗 （PCI） 是 AMI 的一线治疗策略之一，通常可保护心肌细胞免受缺血性损伤 3,4。如果AMI后不及时有效治疗，远端心肌将缺乏血液和氧气供应，从而导致缺血性坏死和进一步的心血管并发症5,6。在错过PCI手术机会后，促进心肌细胞恢复并尽量减少不可逆的心肌损伤一直是研究热点。AMI后心肌细胞处于缺血缺氧状态，导致线粒体氧化磷酸化受到抑制，NAD+还原为NADPH，单电子还原增加7。结果，氧气的不完全还原反应产生过量的活性氧（ROS），并最终导致心肌细胞的氧化应激损伤8。ROS的过度积累会引发脂质过氧化，进一步破坏线粒体膜的结构和功能。结果是线粒体通透性过渡孔的持续打开和线粒体膜电位的降低，诱导细胞凋亡和坏死。
血管紧张素转换酶 （ACE） 抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂 （ARB）、β肾上腺素受体抑制剂、醛固酮拮抗剂和其他 AMI 标准药物有助于增强心肌梗死后的心脏功能，预防恶性事件的发生，如心律失常和左心室重塑9.然而，梗死后的生存率和预后受梗死大小的影响很大，降低心肌细胞凋亡尚未取得满意的结果10,11。因此，开发促进心肌梗死后心肌细胞恢复的药物已成为一个紧迫的问题。
多年来，传统医学一直是现代药物研究的灵感来源12,13,14,15。中医（TCM）在AMI的治疗方面有着悠久的历史，近年来的一系列随机对照试验证实，中医确实可以改善患者的预后16,17。根据中医理论，AMI是由血瘀引起的18,19，因此促进血液循环的药物通常用于急性期20的AMI的治疗。其中，藏红花被认为对血液活化和瘀滞有强大的作用，常用于AMI的急性治疗。藏红花素是藏红花的主要成分，可能在保护心肌细胞方面发挥关键作用21。
本研究以H2O2 诱导H9c2心肌细胞模拟AMI心肌细胞损伤的心肌缺血/再灌注，以藏红花素为干预措施，研究其对氧化应激诱发心肌损伤的保护作用。通过线粒体自噬进一步探索藏红花素保护心肌细胞的机制。更重要的是，本文为线粒体自噬研究的技术方法提供了参考，并详细描述了整个实验过程。
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Protocol
实验在中国北京中医药大学生理学实验室进行。所有研究方法均按照北京大学的相关指导方针和规定进行。
1. 细胞培养
- 在Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）碱性培养基（含4.5 g/L D-葡萄糖、4.g.g/L L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠;见 材料表）中加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，制备DMEM完全培养基。
- 在37°C的温水中解冻液氮冷冻的H9c2心肌细胞（见 材料表），快速均匀搅拌直至冰融化。
- 将细胞转移到离心管中，并加入四倍于DMEM完全培养基体积的药物。在室温下以358× g 离心5分钟，并使用移液管弃去上清液。
- 用培养基稀释获得的细胞悬液，轻轻吹气，然后将细胞接种在培养瓶中。在37°C的培养箱中用5%CO2培养。
2. 细胞活力的测定
- 将藏红花素（见 材料表）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为0.05mM，0.1mM，0.5mM，1mM，5mM，10mM，50mM，100mM和200mM。
- 通过胰蛋白酶解离H9c2心肌细胞，然后用DMEM完全培养基中和混合物。
- 将细胞转移到离心管中，并在室温下以179× g 离心5分钟。弃去上清液，轻轻吹气将细胞混合在DMEM完全培养基中。
- 使用血细胞计数板22 （参见 材料表）计数细胞，并用DMEM完全培养基将其稀释至5×104 个细胞/ mL。
- 将细胞分成九个相等的部分。向对照组加入DMSO（用DMEM完全培养基以1：1,000的比例稀释），并以1：1,000的比例向其余组添加不同浓度的藏红花素。
- 将细胞接种在 96 孔板中，每孔 100 μL。孵育24小时后弃去上清液，并用PBS洗涤细胞三次。
- 加入 100 μL DMEM 基础培养基后，将细胞孵育 4 小时并加入 20 μL MTS（参见 材料表）。
- 将细胞再孵育2小时，测量490nm波长处的吸光度，并计算细胞活力。
注意：细胞活力=（OD处理 - OD空白）/（OD对照 - OD空白）×100。
3. 乳酸脱氢酶 （LDH）、肌酸激酶 （CK）、丙二醛 （MDA）、超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH Px） 和过氧化氢酶 （CAT） 的测定
- 将H9c2细胞接种在密度为1×105 细胞的6孔板中。根据制造商的说明，在干预后收集上清液并检测LDH和SOD水平（见 材料表）。
- 收集上清液并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次。将细胞裂解物加入培养皿中，使其在冰上静置20分钟。将培养皿中的液体收集到离心管中。
- 根据制造商的说明23 检测 CK、MDA、GSH-PX 和 CAT 水平（参见 材料表 和 补充文件 1）。
- 通过二辛可宁酸（BCA）方法检测裂解液的总蛋白质浓度，以校正CK，MDA，GSH-Px和CAT24的浓度（参见 材料表）。
4. 活性氧的测定
- 将H9c2细胞接种在48孔板中，密度为5×103 细胞。用无血清培养基以1：1,000的比例稀释DCFH-DA（见 材料表）。弃去细胞上清液并用无血清培养基洗涤细胞两次。
- 向每个孔中加入 150 μL 稀释的 DCFH-DA，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。用无血清培养基洗涤细胞三次，并在荧光显微镜下捕获图像（参见 材料表）。
5. 线粒体膜电位检测
- 使用JC-1线粒体膜电位测定试剂盒25 检测线粒体膜电位（参见 材料表）。丢弃培养基并用无血清培养基洗涤一次。
- 将JC-1工作溶液加入每个试管中并充分混合。在37°C孵育20分钟，并用JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次。向每个孔中加入完整的培养基，并在荧光显微镜下捕获照片。
6. TUNEL 染色测定
- 使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（见 材料表）测定细胞凋亡率26。弃去上清液并用无血清培养基洗涤沉淀一次。
- 加入细胞固定溶液，并在室温下孵育30分钟后用PBS洗涤一次。
- 向每个孔中加入0.3%Triton-100，并在室温下孵育5分钟。用PBS洗涤细胞两次。加入TUNEL检测工作溶液，并在37°C黑暗中孵育60分钟。
- 加入含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI;见 材料表）的抗荧光猝灭密封片，并在荧光显微镜下拍摄照片。
7. 通过转染mCherry GFP-LC3B腺病毒监测自噬血流
- 用新鲜培养基替换每个孔中的一半培养基。向培养基中加入Ad-mCherry GFP-LC3B腺病毒（感染多重性[MOI]，共2），并加入5μg/mL聚溴乙烯（参见 材料表）以提高感染效率。
- 24小时后更换新鲜培养基，并在共聚焦显微镜下观察荧光蛋白的表达。
- 确认成功病毒感染后，以与第1部分相同的条件培养细胞，并在共聚焦显微镜下捕获图像27。
注意：超过20%的细胞显示绿色荧光蛋白（GFP）荧光，表明感染成功。
8. 蛋白质印迹分析
- 收集用于全蛋白提取的细胞并在冰上裂解它们（RIPA，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂= 100：1：1;参见 材料表）30分钟。
- 蛋白质定量后，向蛋白质样品中加入5x蛋白质上样缓冲液，并将样品煮沸10分钟。
- 用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶28对含有等量蛋白质的样品进行电泳。然后，将样品转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
- 用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，并与一抗（PINK1，Parkin;参见 材料表）在4°C孵育过夜，二抗在室温下孵育1小时。
- 使用增强型化学发光 （ECL） 溶液和化学发光检测系统检测目标条带。使用图像J软件通过密度计28量化条带。
9.免疫荧光检测帕金线粒体易位
- 通过双重免疫荧光染色观察帕金与线粒体的共定位。从每组中弃去细胞上清液，并用PBS洗涤三次。
- 在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，并在PBS中加入0.1%的Triton-100。
- 用无动物阻断溶液（参见 材料表）封闭1小时，以防止蛋白质和抗体之间的非特异性结合并降低荧光背景。
- 与一抗（Parkin和Tom20;参见 材料表）在4°C孵育过夜。
- 加入荧光二抗（参见 材料表）并在黑暗中孵育1小时。
- 加入含DAPI的抗荧光淬灭片，并在共聚焦显微镜下捕获图像。
10. 统计分析
- 使用图形和分析软件进行统计分析（参见 材料表）。
- 使用单因子方差分析比较组之间的连续变量。 p < 0.05被认为具有统计学意义。
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Representative Results
藏红花素对细胞活力的影响
0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM 和 100 μM 的藏红花素对细胞有显着的增殖作用，而浓度高于 200 μM 的藏红花素显着抑制 H9c2 细胞的增殖（图 1A）。用400μM H 2 O2处理4小时后，细胞活力大大降低，藏红花素可以在一定程度上逆转这种变化（图1B）。由于在H2O2诱导的H9c2细胞活力上未观察到10μM和100μM藏花素之间的显着差异，因此选择10μM藏花素作为高浓度，分别使用1μM和0.1μM作为中低剂量组。
藏红花素对H9c2细胞LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px和CAT的影响
用400μM H 2 O2处理4 h后，LDH，CK和MDA水平显着增加，而SOD，GSH-Px和CAT水平降低。用10μM藏花素预处理24小时可以逆转上述变化，并显示出明显的剂量依赖性作用。作为一种阳性对照药物，辅酶Q10只能改变CK、MDA和SOD的水平（图2）。
藏红花素对H9c2心肌细胞ROS的影响
作为空白对照，H9c2心肌细胞几乎不表达ROS。同时，400 μM H 2 O24 h处理可以显着提高ROS水平，这在一定程度上可以通过10 μM藏红花素逆转（图3）。荧光结果显示，正常组绿色荧光非常弱。相比之下，400μMH2 O2 4小时处理可以增强绿色荧光信号，并且这种增强可以减少10μM藏红花素（图3）。
藏红花素对H2O2诱导线粒体膜电位和细胞凋亡的影响
JC-1染色在空白对照组中显示红色荧光较多，绿色荧光较少。在400μM H 2 O2处理4小时后，观察到更多的绿色荧光和更少的红色荧光，10μM藏花素可以在一定程度上逆转这种变化（图4A）。TUNEL染色结果显示，空白对照组未检测到细胞凋亡相关信号传导，而400 μM H 2 O2处理4 h后细胞凋亡相关信号传导明显增强，10 μM藏花素可在一定程度上逆转（图4B）。
藏红花素对H2O2诱导的过度自噬的影响
空白对照组H9c2心肌细胞无明显自噬血流。荧光显示用400μM H 2 O2预处理4小时的H9c2心肌细胞中出现点状黄色斑点，表明自噬明显过度激活。然而，这种变化在10μM藏红花素预处理后逆转。在对照组中，Ad-mCherry GFP-LC3B病毒只能通过荧光观察到弱弥漫黄色背景。然而，在400μMH2 O2处理4小时后观察到点状黄色斑点，并且在10μM藏红花素预处理后逆转了这种变化（图5）。
番红花素对线粒体自噬相关蛋白表达的检测
蛋白质印迹结果显示，对照组PINK1和Parkin的表达水平较低。在4 hH2 O2刺激的H9c2心肌细胞中，PINK1和Parkin的表达水平增加，而10μM藏花素预处理可以减少PINK1和Parkin的增加（图6）。
检测藏红花素对帕金线粒体易位的影响
免疫荧光结果显示，空白对照组中代表帕金的红色荧光信号非常弱;然而，在400μMH 2 O 2处理4小时后，红色荧光信号增强，与代表Tom20的绿色荧光的共定位增加。在10μM藏红花素的预处理后，红色荧光信号减弱，与绿色荧光信号的共定位降低（图7）。
图1：通过MTT测定检测细胞活力。 （A）不同浓度的藏红花素对细胞活力的影响（n = 6）。（B）不同浓度的藏红花素对H 2 02干预后细胞活力的影响（n = 6）。*p < 0.05 与对照组相比，#p < 0.05 与 H 2 O2治疗组相比。请点击此处查看此图的大图。
图 2：检测 LDH、CK、MDA、SOD、GSH-PX 和 CAT 水平。 （A） 细胞上清液中的 LDH 水平 （n = 6）。（B）细胞裂解物中的CK水平（n = 6）。（C）细胞裂解物中的MDA水平（n = 6）。（D）细胞上清液中的SOD水平（n = 6）。（E）细胞裂解物中的GSH-Px水平（n = 6）。（F）细胞裂解物中的CAT水平（n = 6）。*p < 0.05 与空白对照组，#p < 0.05 与 H 2 O2 治疗组。请点击此处查看此图的大图。
图 3：由 DCFH-DA 确定的 ROS。 （A）DCFH-DA用于测量H9c2心肌细胞中的ROS水平。罗斯：绿色。（二）ROS的量化数据。（a） 未经治疗的H9c2心肌细胞。（b）用400μM H 2O 2刺激H9c2心肌细胞4小时。 （c）用10μM藏红花素预处理H9c2细胞24小时，然后用400μM H2O2刺激4小时。比例尺 = 24 μm. *p < 0.05 与空白对照组相比，#p < 0.05 与 H 2 O2 治疗组。请点击此处查看此图的大图。
图4：线粒体膜电位和细胞凋亡的检测。 （A）通过JC-1染色测定线粒体膜电位。JC-1 聚集体：红色;JC-1单体：绿色。（B）通过H9c2细胞中的TUNEL染色检测细胞凋亡。调谐器：绿色;DAPI：蓝色。（a） 未经治疗的H9c2心肌细胞。（b）用400μM H 2O 2刺激H9c2心肌细胞4小时。 （c）用10μM藏红花素预处理H9c2细胞24小时，然后用400μM H2O2刺激4小时。比例尺 = 72 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：mCherry-GFP-LC3B腺病毒检测到的自噬通量。 m樱桃：红色;GFP：绿色。（a） 未经治疗的H9c2心肌细胞。（b）用400μM H 2O 2刺激H9c2心肌细胞4小时。 （c）用10μM藏红花素预处理H9c2细胞24小时，然后用400μM H2O2刺激4小时。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：通过蛋白质印迹检测线粒体自噬相关蛋白的含量。 （A）说明PINK1和Parkin表达的代表性蛋白质印迹。β-肌动蛋白被采纳为内部参考。（B） 相对 PINK1 表达式 （n = 3）。（C）相对帕金表达（n = 3）。*p < 0.05 与对照组相比，#p < 0.05 与 H 2 O2治疗组相比。请点击此处查看此图的大图。
图 7：通过免疫荧光双染色检测帕金线粒体易位。红色荧光标记的帕金蛋白和绿色荧光标记的Tom20蛋白。帕金：红色;汤姆20：绿色;DAPI：蓝色）。（a） 未经治疗的H9c2心肌细胞。（b）用400μM H 2O 2刺激H9c2心肌细胞4小时。 （c）用10μM藏红花素预处理H9c2细胞24小时，然后用400μM H2O2刺激4小时。比例尺 = 24 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：LDH，CK，MDA，SOD，GSH-Px和CAT测定的工作说明。请点击此处下载此文件。
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Discussion
通过先进技术从天然药物的复杂化合物中探索有效成分一直是中医药研究的热点29，验证后可为未来的药物开发提供实验室证据。红花是治疗“促进血液循环，减少血瘀”的代表药物，广泛用于治疗心肌梗塞30,31。藏红花被认为具有与红花相似的功效，其促进血液循环和祛血瘀的效果明显优于红花31,32。藏红花素是藏红花33的主要活性成分之一，因此用于本实验的研究。
H2O2可引起心肌细胞氧化应激损伤，模拟心肌细胞心肌梗死状态，被确立为体外心肌梗死模型34。本研究低浓度藏红花素可促进心肌细胞的细胞活力，这可能与线粒体能量代谢的激活密切相关。藏红花素可恢复H2O2诱导的心肌细胞活力下降，并具有剂量依赖性作用，提示藏红花素可改善心肌细胞的氧化应激损伤。同时，藏红花素能有效逆转H2O2引起的心肌损伤和氧化应激指标，进一步证实了其心肌保护作用。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期阶段的标志性事件之一35。JC-1染料在线粒体内以潜在依赖的方式聚集。在正常的线粒体基质中，JC-1形成红色的荧光聚合物。当线粒体膜电位塌陷时，JC-1以单体36的形式发出绿色荧光。TUNEL检测细胞凋亡晚期的核DNA链断裂37。凋亡细胞激活DNA核酸内切酶，切割核小体之间的基因组DNA，暴露的3'-OH可以用末端脱氧核苷酸转移酶37催化的绿色荧光探针荧光素（FITC）标记的dUTP检测。本研究结果表明，H2O2 建模后线粒体膜电位降低，心肌细胞凋亡;藏红花素可以在一定程度上逆转这些变化，表明藏红花素可以有效抑制氧化应激引起的心肌细胞凋亡。
PINK1/Parkin是介导线粒体自噬38的经典途径。PINK1在线粒体损伤后积聚在线粒体外膜上，募集Parkin泛素化线粒体外膜蛋白，线粒体外膜蛋白与自噬相关受体蛋白结合形成自噬体，标志着线粒体自噬的发生39,40,4 1。结果表明，H2O2建模后心肌细胞中PINK1和Parkin的蛋白水平升高，表明自噬过多。经藏红花素干预后，H2O2治疗的心肌细胞中PINK1和Parkin的蛋白水平在一定程度上逆转，表明其可能通过抑制线粒体自噬过多而发挥治疗作用。在这项研究中，藏红花素减少了H2O2诱导的氧化损伤和H9c2心肌细胞的凋亡，推测这种效果可能是通过影响PINK1 / Parkin途径来抑制过度的线粒体自噬来实现的。
本实验证明了草药冻干粉对细胞氧化应激和线粒体自噬的干预。使用mCherry-GFP-LC3B腺病毒观察线粒体自噬是实验中的关键一步。这一步成功的关键是提高了细胞的感染率，提前在培养基中加入前病毒感染试剂聚溴乙烯，大大提高了感染效率。这是通过中和细胞表面唾液酸和病毒颗粒之间的静电排斥来实现的，从而促进吸附。还值得注意的是，作为一种相对安全的病毒，腺病毒基因组虽然在感染后没有整合到宿主细胞基因组中，也不会在细胞内复制，但它仍然具有潜在的生物学危险性。因此，建议在严格遵守法规要求的情况下进行实验。
荧光标记是检测线粒体自噬的常用方法，但由于其特异性差，其他细胞器可能被错误标记并因此干扰实验结果41。随着技术的不断进步，我们可以期待开发更精确和可靠的荧光探针，以进一步探索线粒体自噬的机制。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项研究得到了北京自然科学基金（第7202119号）和国家自然科学基金（第82274380号）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
