Summary
시험관 내 실험을 기반으로 한 이 연구는 PINK1/Parkin 신호 전달 경로가 중요한 역할을 하는 미토파지에 영향을 미쳐 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 복구하는 크로세틴의 메커니즘을 밝혔습니다.
Abstract
본 연구는 체외 실험을 통해H2O2매개 H9c2 심근세포에 대한 크로세틴의 산화적 스트레스 보호 효과를 탐색하고, 그 기전이 미토파지의 영향과 관련이 있는지 여부를 추가로 탐색하는 것을 목표로 하였다. 이 연구는 또한 심근 세포의 산화 스트레스에 대한 홍화산의 치료 효과를 입증하고 그 메커니즘이 미토파지의 효과와 관련이 있는지 여부를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 여기서는H2O2기반 산화 스트레스 모델을 구축하고, 젖산 탈수소효소(LDH), 크레아틴 키나아제(CK), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다아제(GSH Px)의 수준을 검출하여 심근 세포의 산화 스트레스 손상 정도를 평가하였다. 활성 산소 종(ROS) 검출 형광 염료 DCFH-DA, JC-1 염료 및 TUNEL 염료를 사용하여 미토콘드리아 손상 및 세포자멸사를 평가했습니다. 자가포식 플럭스는 Ad-mCherry-GFP-LC3B 아데노바이러스를 형질감염시켜 측정하였다. 그런 다음 Mitophagy 관련 단백질을 웨스턴 블로팅 및 면역형광을 통해 검출했습니다. 그러나 크로세틴(0.1-10μM)은 세포 생존율을 크게 향상시키고H2O2로 인한 세포자멸사 및 산화 스트레스 손상을 감소시킬 수 있습니다. 자가포식 활성화가 과도한 세포에서 크로세틴은 자가포식 흐름과 미토파지 관련 단백질 PINK1 및 Parkin의 발현을 감소시키고 Parkin이 미토콘드리아로 전달되는 것을 역전시킬 수 있습니다. 크로세틴은H2O2매개 산화 스트레스 손상과 H9c2 세포의 세포자멸사를 감소시킬 수 있으며 그 메커니즘은 미토파지와 밀접한 관련이 있습니다.
Introduction
급성 심근경색증(Acute myocardial infarction, AMI)은 관상동맥에 대한 심각하고 지속적인 허혈 및 저산소증에 의해 유발되는 생명을 위협하는 심근 괴사이다 1,2. 경피적 관상동맥 중재술(PCI)은 AMI의 1차 치료 전략 중 하나이며, 일반적으로 허혈성 손상으로부터 심근세포를 보호한다 3,4. 원위 심근은 AMI 후 신속하고 효과적으로 치료하지 않으면 혈액과 산소 공급이 부족하여 허혈성 괴사와 심혈관 합병증을 유발합니다 5,6. PCI 수술 기회를 놓친 후 심근 세포 회복을 촉진하고 돌이킬 수 없는 심근 손상을 최소화하는 것은 연구 핫스팟이었습니다. AMI 후, 심근 세포는 허혈 및 저산소증 상태에 있으며, 그 결과 미토콘드리아 산화적 인산화가 억제되고, NAD+가 NADPH로 환원되며, 단일 전자 환원이 증가한다7. 그 결과, 산소의 불완전한 환원 반응은 과량의 활성산소종(ROS)을 생성하고, 궁극적으로 심근세포에 산화적 스트레스 손상을 일으킨다8. ROS의 과도한 축적은 지질 과산화를 유발하여 미토콘드리아 막의 구조와 기능을 더욱 방해합니다. 그 결과 미토콘드리아 투과성 전이 기공이 지속적으로 열리고 미토콘드리아 막 전위가 감소하여 세포 사멸과 괴사가 유도됩니다.
안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), β-아드레날린 수용체 억제제, 알도스테론 길항제 및 기타 표준 약물인 AMI는 심근경색 후 심장 기능을 향상시키고 부정맥 및 좌심실 리모델링과 같은 악성 사건의 발생을 예방하는 데 도움이 될 수 있다9. 그러나, 경색 후 생존율 및 예후는 경색 크기에 의해 크게 영향을 받으며, 심근세포 아폽토시스를 감소시키는 것에 대한 만족스러운 결과는 달성되지 않았다10,11. 따라서, 심근경색 후 심근세포 회복을 촉진하는 약물의 개발이 시급한 이슈가 되고 있다.
전통 의학은 수년 동안 현대 제약 연구에 영감의 원천이었습니다12,13,14,15. 중국 전통 의학(TCM)은 AMI 치료에 오랜 역사를 가지고 있으며, 최근 몇 년 동안 일련의 무작위 대조 시험을 통해 TCM이 실제로 환자의 예후를 개선할 수 있음을 확인했습니다16,17. TCM 이론에 따르면, AMI는 혈액 정체18,19에 의해 발생하므로 혈액 순환을 촉진하는 약물은 일반적으로 급성기20의 AMI 치료에 사용됩니다. 그 중 사프란은 혈액 활성화와 정체에 강력한 효과가 있는 것으로 여겨지며 AMI의 급성 치료에 자주 사용됩니다. 사프란의 주요 성분인 크로세틴은 심근 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 할 수 있다21.
이 연구에서는 H9c2 심근 세포를 H2O2 에 의해 유도하여 AMI의 심근 세포 손상을 유발하는 심근 허혈/재관류를 시뮬레이션하고, 산화 스트레스 유발 심근 손상에 대한 보호 효과를 조사하기 위한 중재로 크로세틴을 사용했습니다. 심근 세포를 보호하는 크로세틴의 메커니즘은 미토파지를 통해 추가로 탐구되었습니다. 더 중요한 것은 이 기사가 미토파지 연구에 대한 기술적 접근에 대한 참조를 제공하고 전체 실험 절차를 자세히 설명한다는 것입니다.
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Protocol
실험은 중국 베이징 중의과 대학의 생리학 실험실에서 수행되었습니다. 모든 연구 방법은 베이징 대학의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 세포 배양
- 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 기본 배지(4.5g/L D-포도당, 4.g.g/L L-글루타민 및 110mg/L 피루브산나트륨 포함, 재료 표 참조)에 추가하여 DMEM 완전 배지를 준비합니다.
- 액체 질소 동결 H9c2 심근 세포( 재료 표 참조)를 37°C의 따뜻한 물에서 얼음이 녹을 때까지 빠르고 균일하게 저어줍니다.
- 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 DMEM 완전 배지 부피의 4배를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 358 x g 로 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 버린다.
- 수득한 세포 현탁액을 배양액으로 희석하고, 부드럽게 불어, 배양 플라스크에 세포를 접종한다. 5%CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에서 배양한다.
2. 세포 생존율 측정
- 크로세틴( 재료 표 참조)을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 0.05mM, 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 5mM, 50mM, 100mM 및 200mM의 농도로 용해합니다.
- H9c2 심근 세포를 트립신으로 해리시킨 다음, DMEM 완전 배지로 혼합물을 중화시킨다.
- 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 179 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 DMEM 완전 배지에서 세포를 부드럽게 불어넣어 혼합한다.
- 혈구 계수 플레이트22 ( 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 계수하고 DMEM 완전 배지를 사용하여 5 ×10 4 cells/mL로 희석합니다.
- 세포를 9 등분으로 나눕니다. 대조군에 DMSO(DMEM 완전 배지로 1:1,000 비율로 희석)를 추가하고 나머지 그룹에 1:1,000의 비율로 다른 농도의 크로세틴을 추가합니다.
- 웰당 100μL의 96웰 플레이트에 세포를 시딩합니다. 24시간 동안 배양한 후 상층액을 버리고 PBS로 세포를 3회 세척하였다.
- 100 μL의 DMEM 기본 배지를 첨가한 후, 세포를 4시간 동안 배양하고 20 μL의 MTS를 첨가한다( 재료 표 참조).
- 세포를 2시간 더 배양하고 파장 490nm에서 흡광도를 측정하고 세포 생존율을 계산합니다.
참고: 세포 생존율 = (OD 처리 - OD blank)/(OD control - OD blank) × 100.
3. 젖산 탈수소효소(LDH), 크레아틴 키나아제(CK), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 글루타티온 과산화효소(GSH Px) 및 카탈라아제(CAT)의 측정
- H9c2 세포를 1 ×10 5 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한다. 개입 후 상청액을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 LDH 및 SOD 수준을 감지하십시오 ( 재료 표 참조).
- 상층액을 수집하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다. 세포 용해물을 배양 접시에 넣고 20분 동안 얼음 위에 둡니다. 배양 접시에서 원심분리기 튜브로 액체를 수집합니다.
- 제조업체의 지침23 에 따라 CK, MDA, GSH-Px 및 CAT 수준을 감지합니다( 재료 표 및 보충 참조 File 1).
- CK, MDA, GSH-Px 및 CAT24의 농도를 보정하기 위해 BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 용해물의 총 단백질 농도를 감지합니다( 재료 표 참조).
4. ROS의 결정
- H9c2 세포를 5 ×3 세포의 밀도로 48웰 플레이트에 시딩합니다. DCFH-DA( 재료 표 참조)를 무혈청 배지와 1:1,000 비율로 희석합니다. 세포 상청액을 버리고 무혈청 배지로 세포를 두 번 세척하십시오.
- 희석된 DCFH-DA 150μL를 각 웰에 넣고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 무혈청 배지로 세포를 세 번 세척하고 형광 현미경으로 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).
5. 미토콘드리아 막 전위 검출
- JC-1 미토콘드리아 막 전위 분석 키트(25 )를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 검출한다( 재료 표 참조). 배양 배지를 버리고 무혈청 배지로 한 번 세척하십시오.
- JC-1 작업 용액을 각 튜브에 넣고 잘 섞는다. 37°C에서 20분 동안 인큐베이션하고 JC-1 염색 완충액으로 세포를 2회 세척하였다. 각 웰에 완전한 배지를 추가하고 형광 현미경으로 사진을 캡처합니다.
6. TUNEL 염색 분석
- TUNEL 아폽토시스 분석 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 아폽토시스 속도를 결정한다26. 상층액을 버리고 무혈청 배지로 펠릿을 한 번 세척하십시오.
- 세포 고정 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 후 PBS로 1회 세척한다.
- 각 웰에 0.3% 트리톤-100을 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 PBS로 2회 세척한다. TUNEL 검출 작업 용액을 추가하고 37°C의 어두운 곳에서 60분 동안 배양합니다.
- 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 재료 표 참조)을 포함하는 항형광 담금질 밀봉 정제를 추가하고 형광 현미경으로 사진을 캡처합니다.
7. mCherry GFP-LC3B 아데노바이러스의 형질감염에 의한 자가포식 흐름 모니터링
- 각 웰에 있는 배지의 절반을 새 배지로 교체합니다. Ad-mCherry GFP-LC3B 아데노바이러스(감염 다중도[MOI] 2)를 배양 배지에 추가하고 5μg/mL 폴리브렌( 재료 표 참조)을 추가하여 감염 효율을 개선합니다.
- 24시간 후에 새로운 배지를 교체하고 공초점 현미경으로 형광 단백질의 발현을 관찰합니다.
- 바이러스 감염 성공 확인 후 섹션 1과 동일한 조건으로 세포를 배양하고 컨포칼 현미경27로 이미지를 캡처합니다.
참고: 세포의 20% 이상이 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 보였으며 이는 성공적인 감염을 나타냅니다.
8. 웨스턴 블롯 분석
- 전체 단백질 추출을 위해 세포를 수집하고 얼음에서 30분 동안 용해(RIPA, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 = 100:1:1, 재료 표 참조).
- 단백질 정량 후 단백질 샘플에 5x 단백질 로딩 버퍼를 추가하고 샘플을 10분 동안 끓입니다.
- 동일한 양의 단백질을 함유하는 시료를 소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔28로 전기영동한다. 그런 다음 샘플을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다.
- 5% 탈지 분유로 PVDF 멤브레인을 1시간 동안 차단하고 1차 항체(PINK1, Parkin, 재료 표 참조)를 4°C에서 하룻밤 동안 배양하고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- ECL(Enhanced Chemiluminescence) 용액과 화학발광 검출 시스템을 사용하여 표적 밴드를 검출합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 밀도 측정28을 통해 밴드를 정량화합니다.
9. 면역형광법에 의한 파킨의 미토콘드리아 전좌 검출
- 이중 면역형광 염색을 통해 Parkin과 미토콘드리아의 colocalization을 관찰합니다. 각 그룹의 세포 상층액을 버리고 PBS로 3회 세척한다.
- 세포를 4% 파라포름알데히드로 실온에서 10분 동안 고정하고 PBS에 0.1% 트리톤-100을 첨가한다.
- 단백질과 항체 사이의 비특이적 결합을 방지하고 형광 배경을 줄이기 위해 1시간 동안 동물이 없는 블록 용액( 재료 표 참조)으로 차단합니다.
- 1차 항체(Parkin and Tom20; 재료 표 참조)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 형광 2차 항체( 재료 표 참조)를 추가하고 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다.
- DAPI 함유 형광 소광 정제를 추가하고 컨포칼 현미경으로 이미지를 캡처합니다.
10. 통계 분석
- 그래프 및 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
- 일원 분산 분석을 사용하여 그룹 간 계량형 변수를 비교합니다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
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Representative Results
세포 생존율에 대한 크로세틴의 효과
0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM 및 100 μM의 크로세틴은 세포에 상당한 증식 효과를 보인 반면, 200 μM 이상의 농도에서 크로세틴은 H9c2 세포의 증식을 유의하게 억제했습니다(그림 1A). 400 μM H 2 O2로 4 시간 처리 한 후, 세포 생존율은 상당히 감소되었고, 크로세틴은 이러한 변화를 어느 정도 되돌릴 수 있었다 (도 1B). H2O2 유도 H9c2 세포 생존율에서 10μM과 100μM 크로세틴 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았기 때문에 10μM 크로세틴을 고농도로, 1μM 및 0.1μM을 각각 중용량 및 저용량 그룹으로 사용하였다.
H9c2 세포에서 LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px 및 CAT에 대한 크로세틴의 효과
400 μMH2O2로 4시간 처리한 후, LDH, CK 및 MDA의 수준은 현저하게 증가한 반면, SOD, GSH-Px 및 CAT의 수준은 감소하였다. 24시간 동안 10μM 크로세틴을 전처리하면 위의 변화를 역전시킬 수 있으며 명백한 용량 의존적 효과를 나타냅니다. 양성 대조 약물인 코엔자임 Q10은 CK, MDA 및 SOD의 수준만 변경할 수 있습니다(그림 2).
H9c2 심근 세포의 ROS에 대한 크로세틴의 효과
블랭크 대조군으로서 H9c2 심근세포는 ROS를 거의 발현하지 않았습니다. 동시에, 4시간 처리를 위한 400μMH2O2는 ROS 수준을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 이는 10μM 크로세틴에 의해 어느 정도 역전될 수 있습니다(그림 3). 형광 결과는 녹색 형광이 정상군에서 매우 약하다는 것을 보여주었습니다. 이에 비해 4시간 처리에 대해 400μMH2O2는 녹색 형광 신호를 향상시킬 수 있으며 이 향상은 10μM 크로세틴에 의해 감소될 수 있습니다(그림 3).
H2O2 유도 미토콘드리아 막 전위 및 세포 사멸에 대한 크로세틴의 효과
JC-1 염색은 블랭크 대조군에서 더 많은 적색 형광과 더 적은 녹색 형광을 보였다. 400 μMH2O2의 처리 4시간 후, 더 많은 녹색 형광 및 더 적은 적색 형광이 관찰되었고, 10 μM 크로세틴은 이러한 변화를 어느 정도 역전시킬 수 있었다(도 4A). TUNEL 염색 결과는 아폽토시스 관련 신호전달이 블랭크 대조군에서 검출되지 않은 반면, 아폽토시스-관련 신호전달은 4시간의 4시간 동안 400 μMH2O2처리 후에 현저하게 향상되었으며, 이는 10 μM 크로세틴에 의해 어느 정도 역전될 수 있었다(도 4B).
H2O2 유도 과잉자가포식에 대한 크로세틴의 효과
블랭크 대조군의 H9c2 심근세포는 뚜렷한 자가포식 흐름을 나타내지 않았습니다. 형광은 4시간 동안 400μMH2O2로 전처리된 H9c2 심근 세포에서 점상 황색 반점의 출현을 보여주었으며, 이는 자가포식의 명백한 과잉 활성화를 나타냅니다. 그러나, 이러한 변화는 10 μM 크로세틴 전처리 후에 역전되었다. 대조군에서 Ad-mCherry GFP-LC3B 바이러스는 형광에 의해 약한 확산 노란색 배경으로만 관찰될 수 있었습니다. 그러나, 400 μMH2O2를 4시간 동안 처리한 후 점상 황색 반점이 관찰되었고, 이러한 변화는 10 μM 크로세틴 전처리 후에 역전되었다(도 5).
미토파지 관련 단백질의 발현에 대한 크로세틴 검출
웨스턴 블롯 결과는 대조군에서 PINK1과 Parkin의 발현 수준이 더 낮았다는 것을 보여주었습니다. 4시간H2O2자극H9c2 심근 세포에서 PINK1 및 Parkin의 발현 수준이 증가한 반면, 10μM 크로세틴 전처리는 PINK1 및 Parkin의 증가를 감소시킬 수 있었습니다(그림 6).
Parkin 미토콘드리아의 전좌에 대한 크로세틴의 효과 검출
면역형광 결과는 블랭크 대조군에서 Parkin을 나타내는 적색 형광 신호가 매우 약하다는 것을 보여주었다. 그러나, 400 μM H2O2를 4시간 동안 처리한 후, 적색 형광 신호가 증강되었고,Tom20을 나타내는 녹색 형광과의 공편재화가 증가하였다. 10μM 크로세틴의 전처리 후 적색 형광 신호가 약화되고 녹색 형광 신호와의 공국소화가 감소했습니다(그림 7).
그림 1: MTT 분석에 의한 세포 생존율 검출. (A) 세포 생존율에 대한 다양한 농도의 크로세틴의 영향(n=6). (B) H 2 02개입 후 세포 생존율에 대한 다양한 농도의 크로세틴의 영향 (n = 6). *p < 0.05 대 대조군, #p < 0.05 대H2O2처리군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px 및 CAT 수준 검출. (A) 세포 상청액의 LDH 수준(n=6). (B) 세포 용해물 중의 CK 수준(n=6). (C) 세포 용해물 중 MDA 수준(n=6). (d) 세포 상청액 중의 SOD 수준(n=6). (E) 세포 용해물 중 GSH-Px 수준(n=6). (F) 세포 용해물 중 CAT 수준(n=6). *p< 0.05 대 블랭크 대조군, #p < 0.05 대H2O2처리군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DCFH-DA에 의해 결정된 ROS. (A) DCFH-DA는 H9c2 심근 세포에서 ROS 수준을 측정하는 데 사용되었습니다. ROS: 녹색. (B) ROS의 정량화 데이터. (a) 치료하지 않은 H9c2 심근 세포. (b) 4시간 동안 400μM H2O2로 자극된 H9c2 심근세포. (c) 24시간 동안 10μM 크로세틴으로 전처리된 후 4시간 동안 400μMH2O2로 자극된 H9c2 세포. 스케일 바 = 24 μm. *p < 0.05 대 블랭크 대조군, #p < 0.05 대H2O2처리군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 미토콘드리아 막 전위와 세포자멸사 검출. (A) 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 염색에 의해 측정하였다. JC-1 응집체: 빨간색; JC-1 단량체 : 녹색. (B) H9c2 세포에서 TUNEL 염색에 의해 세포자멸사를 검출하였다. 튜넬: 녹색; DAPI: 블루. (a) 치료하지 않은 H9c2 심근 세포. (b) 4시간 동안 400μM H2O2로 자극된 H9c2 심근세포. (c) 24시간 동안 10μM 크로세틴으로 전처리된 후 4시간 동안 400μMH2O2로 자극된 H9c2 세포. 스케일 바 = 72 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: mCherry-GFP-LC3B 아데노바이러스에 의해 검출된 자가포식 플럭스. mCherry: 빨간색; GFP: 녹색. (a) 치료하지 않은 H9c2 심근 세포. (b) 4시간 동안 400μM H2O2로 자극된 H9c2 심근세포. (c) 24시간 동안 10μM 크로세틴으로 전처리된 후 4시간 동안 400μMH2O2로 자극된 H9c2 세포. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 미토파지 관련 단백질의 함량은 웨스턴 블랏팅에 의해 검출되었습니다. (A) PINK1 및 Parkin 발현을 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯. β-액틴은 내부 참조로 채택되었습니다. (B) 상대적 PINK1 발현(n=3). (C) 상대적 파킨 발현 (n = 3). *p < 0.05 대 대조군, #p < 0.05 대H2O2처리군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 면역형광 이중 염색에 의한 Parkin의 미토콘드리아 전좌 검출. 적색 형광 표지 파킨 단백질 및 녹색 형광 표지 Tom20 단백질. 파킨 : 빨간색; Tom20: 녹색; DAPI: 파란색). (a) 치료하지 않은 H9c2 심근 세포. (b) 4시간 동안 400μM H2O2로 자극된 H9c2 심근세포. (c) 24시간 동안 10μM 크로세틴으로 전처리된 후 4시간 동안 400μMH2O2로 자극된 H9c2 세포. 스케일 바 = 24 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px 및 CAT 분석의 작업 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
첨단 기술을 통해 천연 약물의 복잡한 화합물에서 유효 성분을 탐색하는 것은 TCM 연구29의 핫스팟이었으며 검증 후 향후 약물 개발을 위한 실험실 증거를 제공할 수 있습니다. 홍화는 "혈액 순환을 촉진하고 혈액 정체를 최소화하는"치료의 대표적인 약물이며 심근 경색 치료에 널리 사용됩니다30,31. 사프란은 홍화와 유사한 효과가 있는 것으로 여겨지며 혈액 순환을 촉진하고 혈액 정체를 제거하는 효과가 홍화보다 훨씬 우수합니다31,32. 크로세틴은 사프란33의 주요 활성 성분 중 하나이므로이 실험의 연구에 사용되었습니다.
H2O2는 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 유발하고 심근 세포의 심근 경색 상태를 모사할 수 있으며, 이는 시험관 내에서 심근 경색의 모델로서 확립된다 34. 이 연구에서 낮은 농도의 크로세틴은 심근 세포의 세포 생존력을 촉진할 수 있으며, 이는 미토콘드리아 에너지 대사의 활성화와 밀접한 관련이 있을 수 있습니다. 크로세틴은H2O2에 의해 유도된 심근 세포의 감소된 생존력을 회복시킬 수 있고 용량 의존적 효과를 가지며, 이는 크로세틴이 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 개선할 수 있음을 시사합니다. 한편, 크로세틴은 H 2 O2로 인한 심근 손상 및 산화 스트레스 지수를 효과적으로 역전시켜 심근 보호 효과를 더욱 확인할 수 있습니다.
미토콘드리아 막 전위의 감소는 세포 사멸의 초기 단계에서 특징적인 사건 중 하나이다35. JC-1 염료는 미토콘드리아 내에서 전위 의존적 방식으로 응집됩니다. 정상적인 미토콘드리아 매트릭스에서 JC-1은 적색의 형광 중합체를 형성합니다. 미토콘드리아 막 전위가 붕괴되면 JC-1은 단량체36으로 녹색 형광을 방출합니다. TUNEL은 세포 사멸의 후기 단계에서 핵 DNA 가닥 파괴를 감지합니다37. 아폽토시스 세포는 뉴클레오솜 사이의 게놈 DNA를 절단하는 DNA 엔도뉴클레아제 효소를 활성화하고, 노출된 3'-OH는 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소에 의해 촉매되는 녹색 형광 프로브 플루오레세인(FITC) 표지 dUTP로 검출할 수 있습니다(37). 이 연구의 결과는 H 2 O2 모델링 후 미토콘드리아 막 전위가 감소하고 심근 세포의 세포 사멸이 나타남을 보여줍니다. 이러한 변화는 크로세틴에 의해 어느 정도 역전될 수 있으며, 이는 크로세틴이 산화 스트레스로 인한 심근 세포의 세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사합니다.
PINK1/Parkin은 미토파지38을 매개하는 고전적인 경로입니다. PINK1은 미토콘드리아 손상 후 외부 미토콘드리아 막에 축적되고 Parkin은 자가포식 관련 수용체 단백질에 결합하여 자가포식소체를 형성하는 미토콘드리아 외 막 단백질을 유비퀴틴화하기 위해 모집되어 미토파지의 발생을 표시합니다39,40,4 1. 결과는H2O2모델링 후 심근 세포에서 PINK1 및 Parkin의 단백질 수준이 증가하여 과도한 자가포식을 시사합니다. 크로세틴의 개입 후, H 2 O2로 처리 된 심근 세포에서 PINK1 및 Parkin의 단백질 수준이 어느 정도 역전되어 과도한 미토콘드리아 자가포식을 억제함으로써 치료 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이 연구에서 크로세틴은H2O2로 인한 산화적 손상과H9c2 심근세포의 세포자멸사를 감소시켰으며, 이 효과는 PINK1/Parkin 경로에 영향을 주어 과도한 미토파지를 억제함으로써 달성될 수 있을 것으로 추측됩니다.
이 실험은 세포 산화 스트레스와 미토파지에 대한 허브 동결건조 분말의 개입을 입증했습니다. mCherry-GFP-LC3B 아데노바이러스를 사용하여 미토콘드리아 자가포식을 관찰하는 것은 실험에서 중요한 단계였습니다. 이 단계의 성공의 열쇠는 세포의 감염률을 증가시키는 것이었고, 감염 효율을 크게 높이기 위해 미리 배지에 폴리브렌을 첨가하여 프로바이러스 감염 시약을 첨가하였다. 이것은 세포 표면 시알산과 바이러스 입자 사이의 정전기 반발을 중화시켜 흡착을 촉진함으로써 달성되었습니다. 비교적 안전한 바이러스로서 아데노바이러스 게놈이 감염 후 숙주 세포 게놈에 통합되지 않고 세포에서 복제되지 않지만 여전히 잠재적으로 생물학적으로 위험하다는 점도 주목할 가치가 있습니다. 따라서 규제 요구 사항을 엄격하게 준수하여 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
형광 표지는 미토파지를 검출하는 일반적인 방법이지만, 특이성이 낮기 때문에 다른 세포 기관이 잘못 표지되어 실험 결과를 방해할 수 있다41. 기술 발전이 계속됨에 따라 미토파지의 메커니즘을 더 깊이 탐구하기 위해 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 형광 프로브의 개발을 기대할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 베이징 자연 과학 재단 (No. 7202119)과 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82274380)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
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