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Medicine

Protection des cellules myocardiques H9c2 contre le stress oxydatif par la crocétine via la mitophagie médiée par la voie PINK1/Parkin

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65105
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Basée sur des expériences in vitro , cette étude a révélé le mécanisme de la crocétine dans la réparation des dommages causés par le stress oxydatif des cardiomyocytes en influençant la mitophagie, dans laquelle la voie de signalisation PINK1 / Parkin joue un rôle important.

Abstract

Cette étude visait à explorer l’effet protecteur contre le stress oxydatif de la crocétine sur les cellules myocardiques H9c2 médiéespar H2O2 par le biais d’expériences in vitro, et à explorer davantage si son mécanisme est lié à l’impact de la mitophagie. Cette étude visait également à démontrer l’effet thérapeutique de l’acide carthame sur le stress oxydatif dans les cardiomyocytes et à explorer si son mécanisme est lié à l’effet de la mitophagie. Ici, un modèlede stress oxydatif basé sur H 2 O2 a été construit et a évalué le degré de lésion de stress oxydatif des cardiomyocytes en détectant les niveaux de lactate déshydrogénase (LDH), de créatine kinase (CK), de malondialdéhyde (MDA), de superoxyde dismutase (SOD), de catalase (CAT) et de glutathion peroxydase (GSH Px). Le colorant fluorescent DCFH-DA, JC-1 et TUNEL ont été utilisés pour évaluer les dommages mitochondriaux et l’apoptose. Le flux autophagique a été mesuré par transfectation de l’adénovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Des protéines liées à la mitophagie ont ensuite été détectées par transfert Western et immunofluorescence. Cependant, la crocétine (0,1-10 μM) pourrait améliorer considérablement la viabilité cellulaire et réduire l’apoptose et les dommages causés par le stress oxydatif causés par H2O2. Dans les cellules à activation autophagique excessive, la crocétine pourrait également réduire le flux d’autophagie et l’expression des protéines liées à la mitophagie PINK1 et Parkin, et inverser le transfert de Parkin aux mitochondries. La crocétine pouvait réduire les dommages causés par le stress oxydatif médié par H2O2 et l’apoptose des cellules H9c2, et son mécanisme était étroitement lié à la mitophagie.

Introduction

L’infarctus aigu du myocarde (IAM) est une nécrose myocardique potentiellement mortelle causée par une ischémie et une hypoxie sévères et persistantes des artères coronaires 1,2. L’intervention coronarienne percutanée (ICP) est l’une des stratégies thérapeutiques de première intention pour l’IAM et protège généralement les cardiomyocytes contre les lésions ischémiques 3,4. Le myocarde distal manquera d’apport de sang et d’oxygène s’il n’est pas traité rapidement et efficacement après un IAM, ce qui entraîne une nécrose ischémique et d’autres complications cardiovasculaires 5,6. La promotion de la récupération des cardiomyocytes et la minimisation des lésions myocardiques irréversibles après avoir manqué l’opportunité chirurgicale PCI ont été un point chaud de la recherche. Après IAM, les cardiomyocytes sont dans un état d’ischémie et d’hypoxie, ce qui entraîne l’inhibition de la phosphorylation oxydative mitochondriale, la réduction du NAD+ en NADPH et l’augmentation de la réduction d’un seul électron7. En conséquence, la réaction de réduction incomplète de l’oxygène génère un excès d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et conduit finalement à des dommages de stress oxydatif aux cardiomyocytes8. Une accumulation excessive de ROS déclenche une peroxydation lipidique, perturbant davantage la structure et la fonction des membranes mitochondriales. Le résultat est une ouverture continue des pores de transition de perméabilité mitochondriale et une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale, induisant l’apoptose et la nécrose.

Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA), les antagonistes des récepteurs de l’angiotensine (ARA), les inhibiteurs des récepteurs β-adrénergiques, les antagonistes de l’aldostérone et d’autres médicaments standard dans l’IAM peuvent aider à améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde et prévenir l’apparition d’événements malins, tels que les arythmies et le remodelage ventriculaire gauche9. Cependant, la survie et le pronostic post-infarctus sont grandement affectés par la taille de l’infarctus, et des résultats satisfaisants n’ont pas été obtenus pour réduire l’apoptose des cardiomyocytes10,11. Ainsi, le développement de médicaments pour favoriser la récupération des cardiomyocytes après un infarctus du myocarde est devenu un problème urgent.

La médecine traditionnelle est une source d’inspiration pour la recherche pharmaceutique moderne depuis de nombreuses années12,13,14,15. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a une longue histoire dans le traitement de l’IAM, et une série d’essais contrôlés randomisés au cours des dernières années ont confirmé que la MTC peut effectivement améliorer le pronostic des patients16,17. Selon la théorie de la MTC, l’IAM est causée par la stase sanguine18,19, de sorte que les médicaments pour favoriser la circulation sanguine sont généralement utilisés pour le traitement de l’IAM dans la phase aiguë20. Parmi eux, le safran est censé avoir un effet puissant sur l’activation sanguine et la stase, et est souvent utilisé dans le traitement aigu de l’IAM. La crocétine, un composant majeur du safran, pourrait jouer un rôle clé dans la protection des cardiomyocytes21.

Dans cette étude, les cellules myocardiques H9c2 ont été induitespar H 2 O2 pour simuler l’ischémie / reperfusion myocardique, qui provoque une lésion cardiomyocytaire de l’IAM, et la crocétine a été utilisée comme intervention pour étudier son effet protecteur contre les lésions myocardiques induites par le stress oxydatif. Le mécanisme de la crocétine protégeant les cardiomyocytes a été exploré plus avant par mitophagie. Plus important encore, cet article fournit une référence pour l’approche technique de l’étude de la mitophagie et décrit l’ensemble de la procédure expérimentale en détail.

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Protocol

Les expériences ont été réalisées au laboratoire de physiologie de l’Université de médecine chinoise de Pékin, en Chine. Toutes les méthodes d’étude ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents de l’Université de Beijing.

1. Culture cellulaire

  1. Ajouter 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine au milieu basique Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco (avec 4,5 g/L de D-glucose, 4,g/L de L-glutamine et 110 mg/L de pyruvate de sodium; voir le tableau des matières) pour préparer le milieu complet de DMEM.
  2. Décongeler les cellules myocardiques H9c2 congelées à l’azote liquide (voir le tableau des matières) dans de l’eau tiède à 37 °C en remuant rapidement et uniformément jusqu’à ce que la glace fonde.
  3. Transférer les cellules dans un tube de centrifugation et ajouter quatre fois le volume du milieu complet DMEM. Centrifuger à 358 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  4. Diluer la suspension cellulaire obtenue avec un milieu de culture, souffler doucement et inoculer les cellules dans une fiole de culture. Culture en incubateur à 37 °C avec 5% de CO2.

2. Détermination de la viabilité cellulaire

  1. Dissoudre la crocétine (voir le tableau des matières) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à des concentrations de 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM et 200 mM.
  2. Dissocier les cellules myocardiques H9c2 par la trypsine, puis neutraliser le mélange avec le milieu complet DMEM.
  3. Transférer les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger à 179 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et mélanger les cellules dans le milieu complet DMEM en soufflant doucement.
  4. Compter les cellules à l’aide d’une plaque de comptage des cellules sanguines22 (voir le tableau des matières) et les diluer à 5 × 104 cellules/ml avec un milieu complet DMEM.
  5. Divisez les cellules en neuf portions égales. Ajouter du DMSO (dilué dans un rapport de 1:1 000 avec un milieu complet de DMEM) au groupe témoin et ajouter différentes concentrations de crocétine aux groupes restants dans un rapport de 1:1 000.
  6. Ensemencer les cellules dans des plaques de 96 puits à 100 μL par puits. Jeter le surnageant après l’incubation pendant 24 h et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  7. Après avoir ajouté 100 μL de milieu basal DMEM, incuber les cellules pendant 4 h et ajouter 20 μL de MTS (voir le tableau des matériaux).
  8. Incuber les cellules pendant encore 2 h, mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 490 nm et calculer la viabilité cellulaire.
    NOTE: Viabilité cellulaire = (DO traitée - OD vide) / (contrôle OD - OD blanc) × 100.

3. Détermination de la lactate déshydrogénase (LDH), de la créatine kinase (CK), du malondialdéhyde (MDA), de la superoxyde dismutase (SOD), de la glutathion peroxydase (GSH Px) et de la catalase (CAT)

  1. Ensemencer les cellules H9c2 dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 105 cellules. Prélever le surnageant après l’intervention et détecter les taux de LDH et de SOD, conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  2. Recueillir le surnageant et le laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) une fois. Ajouter le lysat cellulaire à la capsule de culture et laisser reposer sur la glace pendant 20 min. Recueillir le liquide de la capsule de culture dans un tube à centrifuger.
  3. Détecter les niveaux de CK, MDA, GSH-Px et CAT conformément aux instructions du fabricant23 (voir le tableau des matériaux et le dossier supplémentaire 1).
  4. Détecter la concentration totale de protéines de la lyse par la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA) pour corriger la concentration de CK, MDA, GSH-Px et CAT24 (voir le tableau des matériaux).

4. Détermination de la MDE

  1. Ensemencer les cellules H9c2 dans une plaque de 48 puits à une densité de 5 × 103 cellules. Diluer le DCFH-DA (voir le tableau des matières) dans un rapport de 1:1 000 avec le milieu sans sérum. Jetez le surnageant cellulaire et lavez-la deux fois avec un milieu sans sérum.
  2. Ajouter 150 μL de DCFH-DA dilué dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 20 min. Lavez les cellules trois fois avec un milieu sans sérum et capturez des images au microscope à fluorescence (voir Tableau des matériaux).

5. Détection du potentiel de la membrane mitochondriale

  1. Détecter le potentiel de la membrane mitochondriale à l’aide d’un kit d’essai de potentiel de membrane mitochondrialeJC-1 25 (voir le tableau des matériaux). Jetez le milieu de culture et lavez-le une fois avec un milieu sans sérum.
  2. Ajoutez la solution de travail JC-1 à chaque tube et mélangez-les bien. Incuber à 37 °C pendant 20 min et laver les cellules deux fois avec un tampon de coloration JC-1. Ajoutez un support complet à chaque puits et capturez des photographies au microscope à fluorescence.

6. Dosage de coloration TUNEL

  1. Utiliser une trousse de dosage de l’apoptose TUNEL (voir le tableau des matières) pour déterminer les taux d’apoptose26. Jeter le surnageant et laver la pastille une fois avec un milieu sans sérum.
  2. Ajouter la solution de fixation des cellules et les laver avec du PBS une fois après l’incubation à température ambiante pendant 30 min.
  3. Ajouter 0,3% de triton-100 à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 5 min. Lavez les cellules avec du PBS deux fois. Ajouter la solution de détection TUNEL et incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 60 min.
  4. Ajouter un comprimé d’étanchéité anti-fluorescence contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; voir le tableau des matériaux) et prendre des photos au microscope à fluorescence.

7. Surveillance du flux autophagique par transfection de l’adénovirus mCherry GFP-LC3B

  1. Remplacer la moitié du milieu dans chaque puits par un milieu frais. Ajouter Ad-mCherry GFP-LC3B adénovirus (multiplicité de l’infection [MOI] de 2) au milieu de culture et ajouter 5 μg/mL de polybrène (voir le tableau des matières) pour améliorer l’efficacité de l’infection.
  2. Remplacez le milieu frais après 24 h et observez l’expression de la protéine fluorescente au microscope confocal.
  3. Culture des cellules dans les mêmes conditions que la section 1 après confirmation de la réussite de l’infection virale et capture d’images au microscope confocal27.
    REMARQUE: Plus de 20% des cellules présentaient une fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP), indiquant une infection réussie.

8. Analyse Western blot

  1. Prélever des cellules pour l’extraction de protéines entières et les lyser (RIPA, inhibiteur de protéase et inhibiteur de phosphatase = 100:1:1; voir le tableau des matériaux) sur de la glace pendant 30 min.
  2. Ajouter 5x tampon de charge protéique à l’échantillon de protéines après quantification des protéines et faire bouillir les échantillons pendant 10 min.
  3. Électrophorèse les échantillons qui contiennent des quantités égales de protéines avec les gels d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)28. Ensuite, transférer les échantillons sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF).
  4. Bloquer les membranes PVDF pendant 1 h avec du lait écrémé en poudre à 5 % et incuber avec l’anticorps primaire (PINK1, Parkin; voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant une nuit et l’anticorps secondaire à température ambiante pendant 1 h.
  5. Détectez les bandes cibles à l’aide d’une solution de chimiluminescence améliorée (ECL) et du système de détection par chimiluminescence. Utilisez le logiciel Image J pour quantifier les bandes par densitométrie28.

9. Détection de la translocation mitochondriale de Parkin par immunofluorescence

  1. Observer la colocalisation de Parkin avec les mitochondries par double coloration par immunofluorescence. Jetez le surnageant cellulaire de chaque groupe et lavez-les trois fois avec du PBS.
  2. Fixez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante avec 4% de paraformaldéhyde et ajoutez 0,1% de triton-100 dans du PBS.
  3. Bloquer avec une solution de bloc sans animal (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h pour empêcher la liaison non spécifique entre les protéines et les anticorps et réduire le fond de fluorescence.
  4. Incuber avec un anticorps primaire (Parkin et Tom20; voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant une nuit.
  5. Ajouter un anticorps secondaire fluorescent (voir le tableau des matériaux) et incuber dans l’obscurité pendant 1 h.
  6. Ajoutez les comprimés de trempe anti-fluorescence contenant du DAPI et capturez des images au microscope confocal.

10. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matières).
  2. Comparez les variables continues entre les groupes à l’aide de l’ANOVA unidirectionnelle. p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

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Representative Results

Effets de la crocétine sur la viabilité cellulaire
La crocétine à 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM et 100 μM avait un effet prolifératif significatif sur les cellules, tandis que la crocétine à des concentrations supérieures à 200 μM inhibait significativement la prolifération des cellules H9c2 (Figure 1A). Après 4 h de traitement avec 400 μMH2O2, la viabilité cellulaire a été considérablement réduite, et la crocétine a pu inverser ce changement dans une certaine mesure (Figure 1B). Étant donné qu’aucune différence significative entre la crocétine 10 μM et 100 μM n’a été observée sur la viabilité cellulaire H9c2 induitepar H2O2, la crocétine 10 μM a été choisie comme concentration élevée, et 1 μM et 0,1 μM ont été utilisés comme groupes à dose moyenne et faible, respectivement.

Effets de la crocétine sur la LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px et CAT dans les cellules H9c2
Après 4 h de traitement avec 400 μMH2O2, les taux de LDH, CK et MDA ont augmenté sensiblement, tandis que les niveaux de SOD, GSH-Px et CAT ont diminué. Le prétraitement de la crocétine 10 μM pendant 24 h peut inverser les changements ci-dessus et montre un effet dose-dépendant évident. En tant que médicament témoin positif, la coenzyme Q10 ne peut modifier que les niveaux de CK, MDA et SOD (Figure 2).

L’effet de la crocétine sur les ROS dans les cardiomyocytes H9c2
En tant que témoin à blanc, les cardiomyocytes H9c2 n’exprimaient presque pas de ROS. Dans le même temps, un traitement de 400 μMH2O2pour 4 h pourrait augmenter considérablement le niveau de ROS, qui peut être inversé par 10 μM de crocétine dans une certaine mesure (Figure 3). Les résultats de fluorescence ont montré que la fluorescence verte était très faible dans le groupe normal. En comparaison, 400 μM H 2 O2pour 4 h de traitement pourraient améliorer le signal de fluorescence verte, et cette amélioration pourrait être réduite de 10 μM de crocétine (Figure 3).

Effets de la crocétine sur le potentiel de membrane mitochondriale induit parH2O2 et l’apoptose
La coloration JC-1 a montré plus de fluorescence rouge et moins de fluorescence verte dans le groupe témoin blanc. Après 4 h de traitement de 400 μMH2O2, plus de fluorescence verte et moins de fluorescence rouge ont été observées, et 10 μM de crocétine ont pu inverser ce changement dans une certaine mesure (Figure 4A). Les résultats de la coloration TUNEL ont montré que la signalisation liée à l’apoptose n’a pas été détectée dans le groupe témoin blanc, tandis que la signalisation liée à l’apoptose a été sensiblement améliorée après400 μM H 2 O2 pendant 4 h de traitement, ce qui pourrait être inversé par 10 μM de crocétine dans une certaine mesure (Figure 4B).

Effets de la crocétine sur l’autophagie excessive induite parH2O2
Les cardiomyocytes H9c2 dans le groupe témoin blanc n’ont montré aucun flux d’autophagie évident. La fluorescence a montré l’apparition de taches jaunes ponctuées dans les cardiomyocytes H9c2 prétraités avec 400 μMH2O2pendant 4 h, indiquant une suractivation évidente de l’autophagie. Cependant, ce changement a été inversé après le prétraitement de la crocétine de 10 μM. Dans le groupe témoin, le virus Ad-mCherry GFP-LC3B n’a pu être observé que sous la forme d’un faible fond jaune diffus par fluorescence. Cependant, des taches jaunes ponctuées ont été observées après 400 μMH2O2pendant 4 h de traitement, et ce changement a été inversé après le prétraitement à la crocétine de 10 μM (Figure 5).

Détection de la crocétine sur l’expression de protéines liées à la mitophagie
Les résultats du transfert Western ont montré que dans le groupe témoin, les niveaux d’expression de PINK1 et de Parkin étaient plus faibles. Dans les cardiomyocytes H9c2 stimulés par H9c2 4 h H2O, les niveaux d’expression de PINK1 et Parkin ont augmenté, tandis que le prétraitement à la crocétine de 10 μM a pu réduire l’augmentation de PINK1 et Parkin (Figure 6).

Détection de l’effet de la crocétine sur la translocation des mitochondries Parkin
Les résultats de l’immunofluorescence ont montré que le signal de fluorescence rouge représentant Parkin dans le groupe témoin blanc était très faible; cependant, après 400 μM H2O2 pendant 4 h de traitement, le signal de fluorescence rouge a été amélioré, et la colocalisation avec la fluorescence verte représentantTom20a augmenté. Après le prétraitement de la crocétine 10 μM, le signal de fluorescence rouge a été affaibli et la colocalisation avec le signal de fluorescence verte a été réduite (Figure 7).

Figure 1
Figure 1 : Détection de la viabilité cellulaire par le test MTT. (A) Effets de la crocétine à différentes concentrations sur la viabilité cellulaire (n = 6). (B) Effets de la crocétine à différentes concentrations sur la viabilité cellulaire après une interventionH 2 02 (n = 6). *p < 0,05 versus groupe témoin, #p < 0,05 versus groupe de traitementH2O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Détection des taux de LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px et CAT. (A) Taux de LDH dans le surnageant cellulaire (n = 6). (B) Taux de CK dans le lysat cellulaire (n = 6). (C) Taux de MDA dans le lysat cellulaire (n = 6). (D) Taux de SOD dans le surnageant cellulaire (n = 6). (E) Niveau de GSH-Px dans le lysat cellulaire (n = 6). (F) Taux de CAT dans le lysat cellulaire (n = 6). *p < 0,05 versus groupe témoin blanc, #p < 0,05 versus groupe de traitement H2O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : ROS déterminé par DCFH-DA. (A) Le DCFH-DA a été utilisé pour mesurer les niveaux de ROS dans les cardiomyocytes H9c2. ROS: vert. B) Données de quantification des ROM. a) Cardiomyocytes H9c2 sans traitement. (b) Cardiomyocytes H9c2 stimulés par 400 μM H2O2 pendant 4 h. (c) cellules H9c2 prétraitées avec 10 μM de crocétine pendant 24 h puis stimulées avec 400 μMH2O2pendant 4 h. Barre d’échelle = 24 μm. *p < 0,05 versus groupe témoin blanc, #p < 0,05 versus groupe de traitementH2O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Détection du potentiel de membrane mitochondriale et de l’apoptose. (A) Le potentiel de la membrane mitochondriale a été déterminé par coloration JC-1. Agrégats JC-1: rouge; Monomères JC-1: vert. (B) L’apoptose a été détectée par coloration TUNEL dans les cellules H9c2. TUNEL: vert; DAPI : bleu. a) Cardiomyocytes H9c2 sans traitement. (b) Cardiomyocytes H9c2 stimulés par 400 μM H2O2 pendant 4 h. (c) cellules H9c2 prétraitées avec 10 μM de crocétine pendant 24 h puis stimulées avec 400 μMH2O2pendant 4 h. Barres d’échelle = 72 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Flux autophagique détecté par l’adénovirus mCherry-GFP-LC3B. mCherry: rouge; GFP: vert. a) Cardiomyocytes H9c2 sans traitement. (b) Cardiomyocytes H9c2 stimulés par 400 μM H2O2 pendant 4 h. (c) cellules H9c2 prétraitées avec 10 μM de crocétine pendant 24 h puis stimulées avec 400 μMH2O2pendant 4 h. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : La teneur en protéines liées à la mitophagie a été détectée par transfert Western. (A) Western blot représentatif illustrant l’expression de PINK1 et Parkin. β-actine a été adopté comme référence interne. (B) Expression PINK1 relative (n = 3). (C) Expression relative de Parkin (n = 3). *p < 0,05 versus groupe témoin, #p < 0,05 versus groupe de traitementH2O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Détection de la translocation mitochondriale de Parkin par double coloration par immunofluorescence. Protéine de Parkin marquée par fluorescence rouge et protéine Tom20 marquée par fluorescence verte. Parkin: rouge; Tom20: vert; DAPI : bleu). a) Cardiomyocytes H9c2 sans traitement. (b) Cardiomyocytes H9c2 stimulés par 400 μM H2O2 pendant 4 h. (c) cellules H9c2 prétraitées avec 10 μM de crocétine pendant 24 h puis stimulées avec 400 μMH2O2pendant 4 h. Barres d’échelle = 24 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Les instructions de travail des tests LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px et CAT. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’exploration d’ingrédients efficaces à partir de composés complexes de médicaments naturels grâce à une technologie de pointe a été un point chaud de la recherche en MTC29 et peut fournir des preuves de laboratoire pour le développement futur de médicaments après vérification. Le carthame est un médicament représentatif dans le traitement de « favoriser la circulation sanguine et de minimiser la stase sanguine » et est largement utilisé dans le traitement de l’infarctus du myocarde30,31. On pense que le safran a des effets similaires à ceux du carthame, et son effet sur la promotion de la circulation sanguine et l’élimination de la stase sanguine est significativement meilleur que le carthame31,32. La crocétine est l’un des principaux composants actifs du safran33, elle a donc été utilisée dans l’étude de cette expérience.

H2O2peut provoquer une lésion de stress oxydatif des cardiomyocytes et simuler l’état d’infarctus du myocarde des cardiomyocytes, qui est établi comme un modèle d’infarctus du myocarde in vitro34. Dans cette étude, une faible concentration de crocétine pourrait favoriser la viabilité cellulaire des cardiomyocytes, ce qui pourrait être étroitement lié à l’activation du métabolisme énergétique mitochondrial. La crocétine peut restaurer la viabilité diminuée des cardiomyocytes induite parH2O2et a un effet dose-dépendant, suggérant que la crocétine peut améliorer les dommages causés par le stress oxydatif des cardiomyocytes. Pendant ce temps, la crocétine peut inverser efficacement les dommages myocardiques et les indices de stress oxydatif causés par H 2 O2, confirmant ainsi son effet protecteur myocardique.

Le déclin du potentiel de la membrane mitochondriale est l’un des événements marquants dans les premiers stades de l’apoptose35. Les colorants JC-1 s’agrègent de manière potentiellement dépendante dans les mitochondries. Dans la matrice mitochondriale normale, JC-1 forme un polymère fluorescent en rouge. Lorsque le potentiel de la membrane mitochondriale s’effondre, JC-1 émet une fluorescence verte sous forme de monomères36. TUNEL détecte les ruptures de brins d’ADN nucléaire dans les derniers stades de l’apoptose37. Les cellules apoptotiques activent les enzymes ADN endonucléase qui coupent l’ADN génomique entre les nucléosomes, et le 3'-OH exposé peut être détecté avec la sonde fluorescente verte marquée à la fluorescéine (FITC) catalysée par les désoxynucléotidyl transférasesterminales 37. Les résultats de cette étude montrent que le potentiel de la membrane mitochondriale a diminué et que l’apoptose des cardiomyocytes est apparue après modélisationH2O2; Les changements pourraient être inversés par la crocétine dans une certaine mesure, suggérant que la crocétine pourrait inhiber efficacement l’apoptose des cardiomyocytes causée par le stress oxydatif.

PINK1/Parkin est une voie classique qui intervient dans la mitophagie38. PINK1 s’accumule sur la membrane mitochondriale externe après des dommages mitochondriaux et Parkin est recruté pour ubiquitiner la protéine de membrane extramitochondriale, qui se lie aux protéines réceptrices liées à l’autophagie pour former des autophagosomes, marquant l’apparition de la mitophagie39,40,4 1. Les résultats montrent que les niveaux de protéines de PINK1 et Parkin ont été augmentés dans les cardiomyocytes après modélisation H2O2, suggérant une autophagie excessive. Après l’intervention de la crocétine, les taux de protéines de PINK1 et Parkin dans les cardiomyocytes traités parH2O2ont été inversés dans une certaine mesure, suggérant qu’il pourrait jouer un rôle thérapeutique en inhibant l’autophagie mitochondriale excessive. Dans cette étude, la crocétine a réduit les dommages oxydatifs induits par H2 O2 et l’apoptose des cardiomyocytes H9c2, et il est spéculé que cet effet pourrait être obtenu en affectant la voie PINK1 / Parkin pour inhiber la mitophagie excessive.

Cette expérience a démontré l’intervention de poudre lyophilisée à base de plantes sur le stress oxydatif cellulaire et la mitophagie. L’utilisation de l’adénovirus mCherry-GFP-LC3B pour observer l’autophagie mitochondriale a été une étape cruciale de l’expérience. La clé du succès de cette étape a été d’augmenter le taux d’infection des cellules, et le réactif d’infection provirale polybrene a été ajouté au milieu à l’avance pour augmenter considérablement l’efficacité de l’infection. Ceci a été réalisé en neutralisant la répulsion électrostatique entre l’acide sialique de surface cellulaire et les particules virales, facilitant ainsi l’adsorption. Il convient également de noter que, en tant que virus relativement sûr, bien que le génome de l’adénovirus ne s’intègre pas dans le génome de la cellule hôte après l’infection et ne se réplique pas dans la cellule, il est toujours potentiellement dangereux sur le plan biologique. Par conséquent, il est recommandé de mener les expériences dans le strict respect des exigences réglementaires.

Le marquage fluorescent est une méthode courante pour détecter la mitophagie, mais en raison de sa faible spécificité, d’autres organites peuvent être mal étiquetés et ainsi interférer avec les résultats expérimentaux41. À mesure que les progrès technologiques se poursuivent, nous pouvons nous attendre au développement de sondes fluorescentes plus précises et plus fiables pour explorer davantage le mécanisme de la mitophagie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de Beijing (n ° 7202119) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82274380).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220

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References

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Médecine numéro 195 crocétine cellules myocardiques H9c2 stress oxydatif voie PINK1/Parkin mitophagie
Protection des cellules myocardiques H9c2 contre le stress oxydatif par la crocétine <em>via</em> la mitophagie médiée par la voie PINK1/Parkin
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Chen, J., Li, Y. f., Zhang, Y. s., Du, T. h., Lu, Y., Li, X. y., Guo, S. w. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).

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