Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65181
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Chinese Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Abstract

De superieure colliculus (SC), een evolutionair geconserveerde middenhersenstructuur bij alle gewervelde dieren, is het meest geavanceerde visuele centrum vóór het ontstaan van de hersenschors. Het ontvangt directe input van ~30 soorten retinale ganglioncellen (RGC's), die elk coderen voor een specifiek visueel kenmerk. Het blijft ongrijpbaar of de SC gewoon retinale kenmerken erft of dat er aanvullende en mogelijk de novo verwerking plaatsvindt in de SC. Om de neurale codering van visuele informatie in de SC te onthullen, bieden we hier een gedetailleerd protocol om visuele reacties optisch vast te leggen met twee complementaire methoden bij wakkere muizen. De ene methode maakt gebruik van twee-fotonmicroscopie om calciumactiviteit in beeld te brengen met een resolutie van één cel zonder de overlappende cortex te ablateren, terwijl de andere breedveldmicroscopie gebruikt om de hele SC van een gemuteerde muis af te beelden waarvan de cortex grotendeels onontwikkeld is. Dit protocol beschrijft deze twee methoden, waaronder diervoorbereiding, virale injectie, implantatie van de kopplaat, implantatie van pluggen, data-acquisitie en data-analyse. De representatieve resultaten tonen aan dat de calciumbeeldvorming met twee fotonen visueel opgewekte neuronale reacties onthult met een resolutie van één cel, en de calciumbeeldvorming met een breed veld onthult neurale activiteit over de hele SC. Door deze twee methoden te combineren, kan men de neurale codering in de SC op verschillende schalen onthullen, en een dergelijke combinatie kan ook worden toegepast op andere hersengebieden.

Introduction

De superieure colliculus (SC) is een belangrijk visueel centrum bij alle gewervelde dieren. Bij zoogdieren ontvangt het directe input van het netvlies en de visuele cortex1. Hoewel optische opname op grote schaal is toegepast op de cortex 2,3,4,5, wordt de toepassing ervan in de SC belemmerd door slechte optische toegangen 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 18,19. Het doel van dit protocol is om details te geven over twee complementaire methoden voor optische registratie van de neurale activiteit in de SC.

De SC bevindt zich onder de cortex en de transversale sinus, wat de optische toegang tot de colliculaire neuronen beperkt. Een benadering om deze beperking te overwinnen is om de overlappende cortex op te zuigen en de anterieure-laterale SC 7,9,10,13,14,19 bloot te leggen. Omdat de SC echter corticale input ontvangt, kan een dergelijke operatie van invloed zijn op hoe de SC-neuronen reageren op visuele stimuli. Om deze beperking te overwinnen, beschrijven we hier een alternatief protocol om de oppervlakkige laag van de posterieure-mediale SC af te beelden met een siliciumplug, terwijl de cortex intact blijft 8,11. Om een eencellige resolutie te bereiken, pasten we twee-fotonmicroscopie toe om calciumresponsen in de posterieure-mediale SC van wildtype muizen in beeld te brengen. Om een brede dekking te bereiken, pasten we bovendien breedveldmicroscopie toe om de volledige SC van een gemuteerde muis waarvan de achterste cortex zich niet heeft ontwikkeld20 in beeld te brengen.

De twee methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn complementair aan elkaar. De calciumbeeldvorming met twee fotonen zonder de cortex te ablateren is geschikt voor het registreren van neurale activiteit met een resolutie van één cel met intacte corticale inputs. De breedveldcalciumbeeldvorming is geschikt voor het registreren van neurale activiteit in de gehele SC terwijl de ruimtelijke resolutie wordt opgeofferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenwelzijn en goedgekeurd door de IACUC van het Chinese Institute for Brain Research, Beijing.

NOTITIE: De tijdlijn voor dit protocol is als volgt: 1) maak de zuignap; 2) injecteer het virus; 3) implanteer de kopplaat; 4) implanteer na 3 weken de plug; 5) Voer na een herstel en gewenning van ~3 dagen op de loopband twee-foton/breedveldbeeldvorming uit.

1. Voorbereiding van een zuignap (figuur 1A)

  1. Doe een druppel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 1x) in een acrylschaal en raak deze aan met een platte naald van 21 G om de punt capillair te vullen.
  2. Bedek de punt van de naald met een doorschijnende siliconenlijm en laat ongeveer ~10 minuten fixeren.
  3. Knip de siliconenlijm met een schaar op een schijf met een diameter van ~2 mm.

2. Voorbereiding van pluggen (Figuur 1B)

  1. Maak een 0,75 mm dikke plastic vulplaat en knip in het midden een vierkant van 1 cm x 1 cm uit. Bereid twee acrylblokken voor. Reinig de vulplaat en acrylblokken met alcohol en veeg ze af met lenspapier.
  2. Leg de vulplaat op een acrylblok, deponeer de siliconenlijm in het midden om ~90% van de opening te vullen (vermijd luchtbellen), voeg nog een acrylblok en ~1 kg kracht toe en wacht 20 minuten.
  3. Snijd onder een chirurgische microscoop de siliconenlijm met een scalpel tot 1 mm hoge en 1,5 mm brede driehoekige prisma's boven een stuk papier met driehoeken erop gedrukt.
  4. Verwijder eventueel stof van de driehoekige prisma's met plastic plakband en plak het op een glazen dekglaasje met een diameter van 5 mm en een dikte van 0,15 mm.
  5. Leg het dekglaasje met de driehoekige prisma's onder een coronabehandelaar, zet de coronabehandelaar aan en breng deze dichter bij het dekglaasje totdat er bliksem verschijnt. Houd het een paar minuten op die positie totdat ze aan elkaar vastzitten.
    LET OP: Deze stap kan voor andere coronabehandelaars anders zijn.
  6. Doe de pluggen in een petrischaaltje en plaats deze een nacht in een broedmachine bij 70 °C.

3. Voorbereiding van dieren en injectie van viraal construct

  1. Gebruik C57BL/6J (wild-type) en Emx1-Cre:Pals1flox/wt (partiële-cortex)20 muizen van beide geslachten op een leeftijd van 6 weken (9 weken op het moment van beeldvorming).
  2. Steriliseer alle materialen en instrumenten die voor de chirurgische ingreep worden gebruikt.
  3. Verdoof de muis met 5% isofluraan en houd de isofluraan vervolgens op 1%-2% met een stroomsnelheid van 1 l/min tijdens de operatie. Bevestig het niveau van anesthesie door het ontbreken van een teenknijpreflex.
  4. Bevestig de muis met het hoofd op een stereotaxisch frame met oorbalken. Breng tijdens de operatie oogzalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen en houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met een thermostatisch verwarmingskussen.
  5. Scheer de vacht en steriliseer het huidoppervlak met jodofoor en 75% ethanol. Injecteer lidocaïne (5 mg/kg, subcutane injectie [SQ]), tilidine (2 mg/kg, SQ) en meloxicam (2 mg/kg, SQ).
    OPMERKING: De chirurgische procedure voor sterilisatie, analgesie en lokale anesthesie kan per instelling verschillen.
  6. Verwijder de huid over de SC met een chirurgische schaar om de schedel bloot te leggen. Maak de schedel schoon met een wattenstaafje.
  7. Pas het stereotaxische frame aan totdat het schedeloppervlak vlak is. Boor een gat 0,5 mm lateraal en 0,42 mm voor de lambda totdat de dura bloot komt te liggen.
  8. Injecteer adeno-geassocieerd virus (AAV) dat GCaMP6m tot expressie brengt (rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m; 1 x 1013 GC/ml opgelost in 1x PBS) op een diepte van 1 mm en 1,6 mm van de lambda met een afgeschuinde glazen micropipet (punt is afgeschuind tot 25° met een diameter van 40-50 μm).
  9. Injecteer op elke diepte 100 nL met een snelheid van 50 nL/min en wacht 5 minuten na elke injectie. Trek na de injectie de injector langzaam op.

4. Implantatie van de kopplaat

  1. Reinig de spieren en weefsels over de schedel en krab de schedel met een mes. Als er een bloeding optreedt, stop deze dan met gelschuim en reinig het bloed. Bevestig de hoofdplaat (Figuur 1C) aan de schedel met een zelfuithardend tandlijmharscement. Meng in het bijzonder een 3/4 lepel polymeer, drie druppels monomeer en een druppel katalysator in een keramische kom op ijs. Breng het mengsel aan op de kopplaat en de schedel. Bevestig ze aan elkaar en wacht 5 minuten totdat de lijm is uitgehard.
  2. Injecteer antibiotica (ceftiofur natrium, 5 mg/kg, SQ) om infecties te voorkomen. Haal de muis uit het stereotaxische frame en plaats hem op een verwarmingskussen voor herstel. Breng het terug naar de thuiskooi nadat u hersteld bent van de anesthesie. Geef voor pijnbestrijding ibuprofenhoudend drinkwater (0,5 ml/50 ml) aan de muis gedurende 3 dagen na de operatie.

5. Implantatie van de plug (figuur 2)

  1. Implanteer de plug 3 weken na de virale injectie. Verdoof en bevestig de muis op een stereotaxisch frame, zoals beschreven in stap 3.2-3.5. Bereid gelschuim gedrenkt in zoutoplossing om mogelijke bloedingen te stoppen.
  2. Boor een ovaal van 3 mm x 2 mm met een microboor gecentreerd op 0,5 mm achter de lambda. Verdun de grens van het ovaal totdat deze barst. Verdun de schedel voor het ovale opnamevenster om het dekglaasje dicht bij de SC te maken.
  3. Verwijder botflappen met een fijne pincet. Maak een snee in de dura achter de transversale sinus en verwijder het stuk dura. Voeg indien nodig kunstmatig hersenvocht (ACSF) toe aan de hersenen met een spuit van 3 ml om uitdroging te voorkomen. Droog de schedel en het opnamevenster af met gelschuim en wattenstaafjes.
  4. Doe een druppel siliconenlijm in het opnamevenster. Gebruik de zuignap om de plug met onderdruk vast te houden. Gebruik een gemotoriseerde micromanipulator om de zuignap te verplaatsen en laat de plug in de siliconenlijm zakken totdat het dekglaasje de schedel raakt. Beweeg vervolgens de plug ~1 mm naar voren om de transversale sinus weg te duwen en de SC bloot te leggen. Deze stap moet in 1-2 minuten worden uitgevoerd voordat de siliconenlijm plakkerig wordt.
  5. Reinig de kopplaat en breng butylcyanoacrylaat en harscement aan rond de grens van de plug om deze aan de kopplaat te bevestigen.
    OPMERKING: Bied postoperatieve zorg, zoals beschreven in stap 4.2.

6. Beeldvorming met twee fotonen (Figuur 3)

  1. Bevestig het dier met zijn kop op een roterende loopband. Plaats de loopband onder een microscoop met twee fotonen en stel de hoogte in op de juiste positie. Plaats een zwarte aluminium kegel tussen het objectief en de kopplaat om lichtvervuiling van de monitor voor visuele stimulatie te voorkomen. Laat de muis ~15 minuten wennen.
  2. Voer beeldvorming met twee fotonen uit op de microscoop met een vergroting van 16x, een numerieke apertuur van 0,8 (NA) en een werkafstand van 3 mm (WD). Gebruik een Ti:saffierlaser met modusvergrendelingstechniek die wordt bestuurd door twee galvoscanners om GCaMP6m te exciteren bij 920 nm. Stel het laservermogen op het monstervlak in tussen 20-80 mW.
  3. Scan een gezichtsveld van 600 μm x 600 μm bij 4,8 Hz met een ruimtelijke resolutie van 2,4 μ m/pixel en breng neurale activiteit in beeld over de diepte tot 350 μ m.
    OPMERKING: De bemonsteringsfrequentie en ruimtelijke resolutie zijn voor galvoscanners en moeten worden aangepast voor resonantiescanners.
  4. Verzamel uitgezonden fluorescentie met een dichroïsche spiegel en detecteer deze met behulp van een fotomultiplicatorbuis (PMT) nadat deze door een banddoorlaatfilter is gehaald.
  5. Registreer de voortbeweging van de muis op de loopband met een roterende encoder. Gebruik een camera met een 50 mm-lens om de pupilgrootte en -positie vast te leggen. Synchroniseer deze opnames en beeldacquisities met visuele stimulatie door triggers op te nemen die door de stimulatiecomputer worden verzonden.

7. Analyse van calciumresponsen gemeten door middel van beeldvorming met twee fotonen

  1. Corrigeer de hersenbeweging tijdens beeldvorming met behulp van SIMA21 of NoRMCorre22.
  2. Teken handmatig een interessegebied (ROI) met behulp van de Cell Magic Toverstaf (ImageJ) en pas het aan met een ellips in MATLAB. Extractie fluorescentiesporen van elke ROI na het verwijderen van neuropil-besmetting:
    Equation 1
    F true en Frawzijn respectievelijk de gecorrigeerde en ruwe fluorescentie-amplitudes van de ROI, F neuropil is de fluorescentie-amplitude van de omringende neuropil en r is de out-of-focus neuropil-besmettingsfactor(0,7 voor onze opstelling). De r wordt geschat door het meten van de signalen op een bloedvat waarvoor Ftrue= 0, zoals eerder beschreven23,24.
  3. Verwijder langzame basislijnfluctuaties door de achtste percentielwaarde af te trekken van een venster van 15 s gecentreerd op elk frame25.
  4. Definieer visuele reacties van een neuron als de relatieve verandering van fluorescentie-amplitude in zijn ROI tijdens de stimulusperiode:
    Equation 2
    F-piek is de piekamplitude van het fluorescentiespoor tijdens de visuele stimulatie en F-basislijnis de gemiddelde amplitude gedurende een periode van 0,5 s voorafgaand aan de stimulatie.

8. Breedveldbeeldvorming en gegevensanalyse (figuur 4)

  1. Bouw een groothoekmacroscoop met een tandemlens4 (Figuur 4A). De macroscoop met tandemlens bestaat uit twee cameralenzen (50 mm en 105 mm) die via een adapter zijn aangesloten en de vergroting is ~2x.
  2. Bereid muizen met gedeeltelijke cortex mutant voor zoals beschreven in stap 3.2-3.5. Injecteer 100 nL AAV die GCaMP6m tot expressie brengt op een diepte van 200 μm in het midden van elke zijde van de SC.
  3. Implanteer na ~3 weken een dekglaasje met een diameter van 5 mm over de SC. Voer een ovale craniotomie uit van 4 mm x 3 mm gecentreerd op de SC en verdun het bot eromheen. Druk vervolgens het dekglaasje rechtstreeks op de SC en bevestig het met harscement.
  4. Exciteer GCaMP6m met een blue light emitting diode (LED) met een excitatiefilter (469 nm ± 35 nm). Maak beelden met behulp van een CMOS-camera (Complementary Metal Oxide Semiconductor) na het passeren van een emissiefilter (525 nm ± 39 nm) bij 10 Hz. De camera bestrijkt een gebied van 5,36 mm x 2,85 mm bij een ruimtelijke resolutie van 2,63 μm/pixel.
  5. Convolve elke verkregen afbeelding met een genormaliseerd boxfilter en downsamplen deze tot 1/4 van de oorspronkelijke grootte. Definieer voor elke pixel in de afbeelding de respons, zoals beschreven in stap 7.4.
    OPMERKING: Bied postoperatieve zorg, zoals beschreven in stap 4.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuren 1A,B laten zien hoe respectievelijk de zuignap en de pluggen moeten worden gemaakt. Figuur 2 laat zien hoe u de plug met succes kunt implanteren. Na het implanteren van de plug wordt de posterieure-mediale SC blootgelegd, zoals weergegeven in figuur 2D. Figuur 3 toont calciumresponsen van SC-neuronen van een voorbeeld van een wild-type muis die is afgebeeld met behulp van twee-fotonmicroscopie. Het driehoekige prisma, dat gemakkelijk onder de microscoop kan worden vastgelegd, kan worden gebruikt om de beeldvormingsplaats te lokaliseren (Figuur 3B). Visuele reacties worden weergegeven met een resolutie van één cel (figuren 3C, Den video 1). Figuur 4 toont calciumresponsen van SC-neuronen van een voorbeeld van een partiële-cortex mutante muis die is afgebeeld met behulp van breedveldmicroscopie. Het verkregen beeld werd eerst gedownsampled tot een kwart van de oorspronkelijke grootte (Figuur 4B). Visueel opgewekte calciumresponsen worden aan beide zijden van de SC getoond (Figuur 4C en Video 2). Figuur 5 toont de expressie van GCaMP6m in de SC op de injectieplaats en de beeldvormingsplaats; Er zijn minder neuronen op de injectieplaats.

Figure 1
Figuur 1: Voorbereiding. (A) Drie stappen voor het maken van de zuignap (stappen 1.1-1.3); PBS in de naald wordt niet weergegeven. (B) Drie stappen voor het maken van de pluggen (stappen 2.1-2.3). (C) Twee soorten kopplaten met een diameter van 8 mm voor wildtype muizen. Twee soorten kopplaten met een diameter van 7 mm voor muizen met gedeeltelijke cortex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Implantatie van de plug (stappen 5.2-5.5). (A) Het bot wordt uitgedund. De omgeving is van harscement. (B) Het bot en de dura worden verwijderd om de inferieure colliculus en het cerebellum bloot te leggen. (C) De plug wordt neergelaten en duwt de transversale sinus naar voren om de posterieure-mediale SC bloot te leggen. De groene gestippelde cirkel markeert het dekglaasje. De blauwe gestippelde driehoek markeert de stekker. De rode stippellijn markeert de zuignap. (D) De plug is bevestigd met butylcyanoacrylaat en harscement. Het beeld is overbelicht om de posterieure-mediale SC duidelijk te laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Beeldvorming van calcium met twee fotonen . (A) Schema van de anatomie van de hersenen van de muis na implantatie van de plug. De donkere stippellijn markeert de omtrek van de SC. De gele driehoek geeft het driehoekige prisma aan. De groene kleur geeft de GCaMP-expressie aan. (B) Een beeld van het silicium driehoekige prisma onder de microscoop alvorens te scannen. (C) Een afbeelding van de fluorescentie van GCamMP van SC-neuronen, gemeten met twee-fotonmicroscopie van een voorbeeld van een wild-type muis. (D) Een standaarddeviatieprojectie van de fluorescentie over beelden (zie video 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Breedveldcalciumbeeldvorming. (A) Een foto van de opstelling voor breedveldbeeldvorming. (B) Een voorbeeld van een RAW-afbeelding en de gedownsamplede afbeelding. De gele stippellijn markeert de omtrek van de SC. (C) Een enkel frame en een standaarddeviatieprojectie van de calciumresponsen van SC-neuronen, gemeten met breedveldmicroscopie van een voorbeeld van een muis met gedeeltelijke cortex (zie video 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Coronale secties van een muizenbrein op verschillende afstanden van de injectieplaats. De onderste rij toont de sterke vergroting van de vakken die op de bovenste rij zijn gemarkeerd. De geel gestippelde rechthoek markeert de injectieplaats, die minder neuronen bevat dan het gebied aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Ruwe en bewegingsgecorrigeerde video's van de calciumresponsen van SC-neuronen op de visuele stimulus in Video 3 door middel van twee-fotonmicroscopie. De beelden zijn gemaakt bij 4,8 Hz en weergegeven bij 20 Hz. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Ruwe en bewegingsgecorrigeerde video's van de calciumresponsen van SC-neuronen op de visuele stimulus in Video 3 door middel van breedveldmicroscopie. De beelden zijn verkregen bij 10 Hz en weergegeven bij 20 Hz. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Een zwarte schermvullende balk (5° breed) die in 12 verschillende richtingen (50°/s) zweeft. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen in het protocol
De meest kritische stap is de craniotomie in stap 5.2 en 5.3. Ten eerste is het bot op 0,5 mm achter de lambda dik en bevat het bloedvaten aan de binnenkant, die tijdens het boorproces bloedingen kunnen veroorzaken. Er moet voldoende gelschuim worden voorbereid om het bloeden te stoppen. Ten tweede is er een goede kans op angiorrhexis bij het verwijderen van het bot net boven de transversale sinus. Voor het oplossen van problemen is een alternatieve aanpak om het bot in het ovaal te verdunnen en stuk voor stuk te verwijderen. Een andere truc is om het bot te laten weken voordat het wordt opgetild om het loskomen van de dura van het bot gemakkelijker te maken en bloedingen te voorkomen.

Een andere cruciale stap is de implantatie van de plug in stap 5.4, waarbij het hele proces 1-2 minuten moet duren. Voor het oplossen van problemen kan men eerst de stekker met de micromanipulator naar een geschikte positie in de ACSF verplaatsen en de uiteindelijke positie van de stekker instellen. Voeg vervolgens de siliconenlijm toe en beweeg de plug met de juiste snelheid naar de uiteindelijke positie.

Betekenis
Dit protocol heeft twee voordelen. Ten eerste biedt het details voor het in beeld brengen van de posterieure-mediale SC met een resolutie van één cel met een intacte cortex bij wild-type muizen, terwijl in eerdere rapporten de overlappende cortex werd opgezogen om de anterieure-laterale SC bloot te leggen. Ten tweede wordt beschreven hoe de volledige SC van partiële cortex-mutante muizen in beeld kan worden gebracht met behulp van de breedveldcalciumbeeldvormingstechniek. Deze twee benaderingen kunnen worden toegepast om andere hersengebieden in beeld te brengen bij dieren die zich op verschillende schalen gedragen.

Er zijn twee alternatieve methoden gerapporteerd om de posterieure-mediale SC in beeld te brengen zonder de overlappende cortex15,16 op te zuigen. Schröder et al. hadden een cirkelvormige craniotomie van 4 mm en appelden een roestvrijstalen buis met een ring en een glazen dekglaasje aan elk uiteinde om de SC16 bloot te leggen. De grotere craniotomie en het stijvere materiaal, vergeleken met wat we gebruikten, hebben meer kans op bloedingen tijdens de implantatie. Bovendien, omdat roestvrij staal niet biocompatibel is, is de kans groter dat het een infectie veroorzaakt bij chronische beeldvorming. Evenzo was het glazen dekglaasje dat in Savier et al. werd gebruikt ook stijver en niet biocompatibel, en veroorzaakte het waarschijnlijker bloedingen en infecties15. Een ander verschil met deze twee methoden is dat onze virale injectieplaats zich buiten het beeldvormingsvenster bevindt, en dus wordt de beeldvormingskwaliteit minder beïnvloed door de mogelijke schade op de injectieplaats (Figuur 5).

Beperkingen van het protocol
Dit protocol biedt details voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de oppervlakkige laag van de SC. Het in beeld brengen van diepere lagen, bijvoorbeeld met behulp van een prisma26, wordt niet gedekt. De twee-foton calciumbeeldvormingsbenadering wordt gebruikt voor het registreren van de neurale activiteit in de posterieure-mediale SC en dekt niet de anterieure-laterale SC 7,13. Volledige SC-calciumbeeldvorming met breedveldmicroscopie werd toegepast op gemuteerde muizen met gedeeltelijke cortex. Om de hele SC van muizen van het brede type in beeld te brengen, moet men de overlappende cortex opzuigen. Een alternatieve manier om de hele SC in beeld te brengen, zonder virale injectie, is de intrinsieke beeldvormingstechniek; Het heeft echter een lagere signaal-ruisverhouding 6,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. ontwierp het onderzoek, voerde het experiment uit, analyseerde de gegevens en schreef het manuscript. Z.L. en R.W. voerden het experiment uit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Tags

Neurowetenschap nummer 194
Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium… More

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter