Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выращивание капустной белой бабочки (Pieris rapae) в контролируемых условиях: тематическое исследование толерантности к тяжелым металлам

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65383
Automatic Translation
1, 1,2
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

Summary

В этой статье представлен подробный протокол выращивания капустной белой бабочки в контролируемых лабораторных условиях с искусственной диетой, которая позволяет точно манипулировать питанием в раннем возрасте и воздействием токсинов. Репрезентативные результаты показывают, как токсичность тяжелых металлов может быть определена с помощью этого протокола.

Abstract

Капустная белая бабочка (Pieris rapae) является важной системой для прикладных исследований в области борьбы с вредителями и фундаментальных исследований в области поведенческой и пищевой экологии. Белокочанную капусту можно легко выращивать в контролируемых условиях на искусственной диете, что делает ее образцовым организмом мира бабочек. В этой статье манипуляция с воздействием тяжелых металлов используется для иллюстрации основных методов выращивания этого вида. Общий протокол иллюстрирует, как бабочек можно ловить в полевых условиях, заставлять откладывать яйца в тепличных клетках и переводить в виде личинок на искусственные диеты. Методы показывают, как бабочки могут быть помечены, измерены и изучены для различных исследовательских вопросов. Репрезентативные результаты дают представление о том, как искусственные диеты, которые различаются по компонентам, могут быть использованы для оценки производительности бабочек по сравнению с контрольной диетой. В частности, бабочки были наиболее терпимы к никелю и наименее терпимы к меди, с допуском цинка где-то посередине. Обсуждаются возможные объяснения этих результатов, включая гипераккумуляцию никеля в некоторых растениях-хозяевах горчицы и недавние данные о том, что медь может быть более токсичной, чем считалось ранее. Наконец, в обсуждении сначала рассматриваются варианты протокола и указания по устранению неполадок в этих методах, прежде чем рассматривать, как будущие исследования могут еще больше оптимизировать искусственную диету, используемую в этом исследовании. В целом, предоставляя подробный видеообзор выращивания и измерения белокочанной капусты на искусственных диетах, этот протокол предоставляет ресурс для использования этой системы в широком спектре исследований.

Introduction

Маленькая капустная белая бабочка (Pieris rapae, далее «капуста белая») является космополитическим видом вредителей горчичных культур, таких как капуста, брокколи и рапс 1,2,3. В то же время белокочанная капуста является мощной системой для исследований в области биологии и широко используемой моделью бабочек, поскольку их можно легко выращивать и манипулировать ими в контролируемых лабораторных экспериментах 4,5. Исследования белокочанных бабочек дали критическое представление о поиске хозяина 6,7,8, использовании ресурсов нектара9,10,11, выборе партнера и половом отборе 12,13,14, развитии и эволюции рисунка крыльев15,16,17, а также реакции на новые и меняющиеся среды18,19. Многие из этих идей основаны на том факте, что белокочанную капусту можно выращивать на искусственных диетах 4,20,21, которыми можно точно манипулировать, чтобы отразить плохие условия питания 22,23, экологически значимые уровни загрязняющих веществ 24,25,26,27 или переход к новым растениям-хозяевам 28,29. В настоящем исследовании используется эксперимент по воздействию тяжелых металлов, чтобы проиллюстрировать основные методы выращивания белокочанных бабочек капусты на искусственной диете в лаборатории и ключевые показатели эффективности личинок и взрослых особей. Многие аспекты этих методов применимы к другим бабочкам30,31 и мотылькам32,33,34, которых можно выращивать на искусственной диете.

В данной работе эксперимент по металлоустойчивости используется для иллюстрации общих методов выращивания белокочанных бабочек. Тяжелые металлы являются распространенным антропогенным загрязнителем, возникающим в результате разложения продуктов жизнедеятельности человека, промышленных процессов и унаследованного загрязнения в результате исторического использования пестицидов, красок и других продуктов35,36,37,38. Многие тяжелые металлы, включая свинец, медь, цинк и никель, могут перемещаться из почвы и воды в ткани растений 39,40,41,42, а металлы в пыли могут откладываться на листьях растений43,44,45, что приводит к множественным путям воздействия личинок насекомых-фитофагов. Воздействие тяжелых металлов в раннем возрасте может иметь негативные последствия для развития животных, особенно для нервной ткани, и высокие уровни могут быть смертельными 35,36,46,47,48. Ряд исследований показал негативное влияние воздействия металлов на развивающихся насекомых, включая как вредителей, так и полезных насекомых 49,50,51. Большое количество загрязнителей тяжелых металлов и тот факт, что они часто встречаются в среде обитания человека52, означает, что необходимы точные лабораторные методы, с помощью которых исследователи могут подвергать развивающихся насекомых воздействию различных уровней и комбинаций различных металлов, чтобы понять и смягчить их воздействие на окружающую среду.

В настоящей работе сравнивается влияние обычных металлов на выживание и развитие белокочанной капусты, уделяя особое внимание меди (Cu), цинку (Zn) и никелю (Ni), трем распространенным загрязнителям в среде обитания человека. Например, разнотравье с обочин дорог в сельской местности Миннесоты содержит до 71 ppm Zn, 28 ppm Cu и 5 ppm Ni53. Этот эксперимент манипулирует уровнями этих металлов в искусственных диетах белокочанных бабочек на уровнях, соответствующих и превышающих уровни, наблюдаемые в окружающей среде. Искусственная диета используется для сопоставления относительной токсичности этих металлов, предсказывая, что белокочанная капуста будет более чувствительна к металлическим загрязнителям, которые не являются неотъемлемой частью их физиологии (никель), по сравнению с теми, которые встречаются, хотя и в небольших количествах, в ферментах и тканях (медь и цинк; Рисунок 1). В этом тексте представлены методологические детали и сопроводительные видеовизуализации, иллюстрирующие методы выращивания и исследования этой важной модельной системы бабочек.

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с разрешением APHIS Министерства сельского хозяйства США P526P-13-02979.

1. Коллекция экспериментальных бабочек

  1. Ловите взрослых самок бабочек воздушной сеткой от насекомых. Белокочанная капуста обычно встречается в открытых, нарушенных местах обитания с нектарными растениями и растениями-хозяевами (в семействе Brassicaceae).
    1. Ищите, когда солнце светит и температура теплая. Чтобы нацелиться на самок, ищите особей, медленно порхающих, близко к земле и приземляющихся на растения, чтобы «барабанить» (пробовать) листья своими предплюснами.
  2. Сажают самок в клетки для сбора яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самки, собранные в полевых условиях, в среднем спариваются с одним или двумя самцами12 и должны начать откладывать оплодотворенные яйца вскоре после поимки. Пойманные в дикой природе самки нуждаются в естественном освещении для откладывания яиц и спаривания, поэтому поместите клетку в теплицу или на подоконник.
  3. Домашние самки с растением-хозяином для сбора яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самки принимают различные растения-хозяева, включая зеленую капусту, редьку, капусту, листовую капусту и арабидопсис, но следят за тем, чтобы растения не были обработаны какими-либо пестицидами.
    1. Представьте растения-хозяева либо в горшках, либо в емкостях с водой для поддержания давления листьев, например, стебли капусты в цветочных трубках с водой.
    2. Если исследователь хочет собрать яйца и перенести их непосредственно на диету, сначала используйте резиновую ленту, чтобы прикрепить лист растения-хозяина к верхней части пластикового стаканчика с водой, а затем натяните кусок парапленки вокруг края - самки, касающиеся листа, будут откладывать яйца на парапленку (см.5).
  4. Убедитесь, что в клетке также есть что-то для поддержания относительной влажности на высоком уровне, например, путем ежедневного полива горшечного растения или смачивания полотенца, особенно в сухих условиях. Если растения в горшках поливают в клетке, убедитесь, что под горшком находится полотенце, так как бабочки могут застрять в воде.
  5. Кормите бабочек 10%-ным разбавленным раствором медовой воды, представленным на желтой губке, которой бабочки быстро учатся пользоваться, особенно если они содержатся с опытными особями.
    1. Чтобы побудить бабочек питаться из губок, поместите их прямо на кормушку, особенно после легкого опрыскивания из бутылки с водой, из-за чего они часто выпячивают хоботок.
    2. Чтобы настроить кормушку, сначала тщательно промойте желтые или оранжевые губки, а затем нарежьте их небольшими квадратиками, которые помещаются в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм. Ежедневно меняйте кормушки и очищайте губки в мягком растворе отбеливателя с последующим тщательным ополаскиванием, чтобы предотвратить рост плесени.

2. Составление искусственных диет

  1. Во-первых, используйте рецепт из таблицы 1 или другие соответствующие источники, чтобы определить соответствующий рецепт для эксперимента. Внесите необходимые изменения, характерные для фокальных видов или экспериментов. Распечатайте рецепт, которому нужно следовать при взвешивании ингредиентов.
  2. Взвесьте все сухие ингредиенты, кроме агара, в одну емкость. Убедитесь, что ингредиенты возвращены в соответствующее место хранения, отмечая, что некоторые ингредиенты хранятся при температуре 4 ° C. Поместите предварительно взвешенную смесь сухих ингредиентов в блендер с 5 мл льняного масла.
  3. Для каждой партии диеты следуйте инструкциям, описанным ниже.
    1. Смешайте 15 г мелкоячеистого агара с 400 мл дистиллированной воды в стакане размером не менее 1 л. Готовьте в микроволновой печи до тех пор, пока агар не приблизится к кипению, с мелкими пузырьками по всей смеси, помешивая смесь каждые 30-60 с, чтобы предотвратить выкипание.
    2. К этой смеси горячего агара добавьте 400 мл дистиллированной воды температуры крана, чтобы довести ее до подходящей температуры для смешивания с сухими ингредиентами, так как витаминная смесь чувствительна к теплу.
    3. Добавьте агаровую смесь в блендер и тщательно перемешайте, при необходимости соскребая края блендера.
  4. Пока агар нагревается, поставьте на прилавок не менее семидесяти диетических чашек по четыре унции так, чтобы края соприкасались. После тщательного перемешивания диеты вылейте смесь из блендера в диетические чашки, убедившись, что диета покрывает дно каждой чашки.
  5. После того, как диета остынет, накройте чашки крышками, пометьте диетические чашки диетическим типом, сложите их на подносы и храните до 1 месяца при температуре 4 ° C до использования.

3. Перенос и выращивание на искусственных диетах

  1. Листья домашнего растения-хозяина с яйцами бабочек в стаканчиках для деликатесов по 30 унций с сетчатой крышкой в климатической камере с температурой 24 ° C. Через 1 неделю проверьте чашки, убедившись, что личинки вылупились, и в конце первой или начале второй стадии возраста, хорошее время для перевода на искусственную диету.
  2. Переведите личинок на искусственный рацион с помощью кисти, продезинфицировав ее с помощью отбеливающего спрея и промывки водой между емкостями с личинками. Переложите три личинки в каждую чашку на 4 унции. Хотя искусственная диета является энергоемкой и может поддерживать высокую плотность личинок, избегайте упаковки личинок в чашки, так как болезни и плесень могут распространяться в чашках с высокой плотностью личинок.
  3. Поместите чашки в пластиковый контейнер на боку так, чтобы трещины упали на дно чашек и подальше от диеты, снижая риск появления плесени и заболеваний.
    1. Размещайте диетические чашки в контролируемых температурных условиях с низким и умеренным уровнем освещенности. Следите за чашками на наличие плесени и болезней каждые 1-2 дня, заглядывая через прозрачные крышки чашек.
    2. Чашки с плесенью или болезнями можно поместить в карантин или заморозить, чтобы предотвратить распространение на другие чашки.

4. Появление взрослых и обращение с ними

  1. Дайте личинкам окуклиться и появиться в диетических чашках. Когда взрослые особи выйдут, дайте им несколько часов, чтобы их крылья затвердели, прежде чем снимать их для маркировки. Вынимайте взрослых бабочек из чашек чистыми руками, осторожно захватывая их крылья, отмечая, что захват всех четырех крыльев ближе к их телу является более устойчивым удержанием.
  2. Чтобы пометить бабочек, держите сухих особей за голову и грудную клетку и используйте шулер с тонким наконечником, чтобы слегка отметить номер на их заднем крыле.
    1. Половые особи, использующие комбинацию отметин на крыльях и гениталий; Самки обычно имеют два черных пятна на спинном переднем крыле и более темные, более желтоватые задние крылья, в то время как самцы обычно имеют одно меньшее черное пятно на спинном переднем крыле на более ярком белом фоне54.
    2. Учитывая, что эта окраска показывает индивидуальные и сезонные изменения, подтвердите пол, используя черты брюшной полости - у самцов есть две застежки на дистальном конце брюшка и более узкое брюшко в целом, в то время как у самок есть одно генитальное отверстие.
  3. Перенесите взрослых в восковые конверты из пергамина, открыв конверт одной рукой, держа бабочку за голову и грудную клетку, вставив ее в конверт, а другой рукой захватив крылья через конверт.
    1. Убедитесь, что все четыре крыла нормально закрыты внутри конверта.
    2. Держите бабочек в холодных условиях (5-6 ° C) в течение 1 недели до экспериментов, но дайте не менее 1 дня акклиматизации, когда их вынимают из холодильника.

5. Показатели эффективности

  1. Чтобы измерить черты крыльев у мертвых особей, удалите крылья бабочки, держа грудную клетку в одной руке и используя щипцы, чтобы удалить каждое крыло у его основания. Поместите крылья плашмя в лайтбокс и сделайте фотографии для последующих измерений.
  2. Чтобы получить оценку плодовитости, поместите взрослых особей в брачные клетки, выделив не менее 1 дня на репродуктивное созревание самцов и 1 день на спаривание. Приносите в жертву самок в установленные моменты времени для подсчета яиц путем вскрытия или собирайте яйца каждый день на растениях-хозяевах.
  3. Чтобы оценить нагрузку на яйца, удалите брюшко самки, поместите его в буфер 1x PBS и прорежьте прорезь вдоль брюшной стороны.
    1. Используйте щипцы, чтобы отделить внутренности от кутикулы, затем оттяните яичники от кишечника, трахей и другого содержимого живота.
    2. Разверните четыре скрученных овариола в каждом из двух яичников, отмечая, где зрелые, желтковые и очищенные от скорлупы яйцеклетки переходят в незрелые фолликулы. Используйте счетчик, чтобы подсчитать общее количество зрелых яиц, обычно в диапазоне от 0 до 200 яиц.
  4. Чтобы определить брачный статус рассеченной самки, вскройте копулатрикс бурсы и отделите сперматофоры внутри. Когда сперматофоры перевариваются, у них обычно развивается «хвост» и они вкладываются друг в друга.

6. Пример из практики

ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые самки капустных белых бабочек были собраны в дикой природе в 2014 году, чтобы основать экспериментальные популяции. Взрослые самки произошли из окрестностей Дэвиса, штат Калифорния (N = 8 самок-основателей).

  1. Размещение бабочек
    1. Размещайте самок в сетчатых клетках «BugDorm» (61 см x 61 см x 61 см) при естественном освещении в теплице. Обеспечьте органический лист капусты растения-хозяина (Brassica oleracea) для яйцекладки.
    2. Для поддержания влажности в клетках включите небольшое растение в горшке (Cosmos), ежедневно поливаемое, положите поверх полотенца внутри каждой клетки.
    3. Собирайте яйца ежедневно, перекладывая листья с новыми яйцами в пластиковые стаканчики объемом 473 мл с отверстиями в крышке и помещайте в климатическую камеру.
    4. Обеспечьте бабочкам свободный доступ к 10% раствору медовой воды (полученному путем разбавления органического меда дистиллированной водой), доступному через желтую губку в небольшой чашке Петри, которую меняют ежедневно.
  2. Приготовление искусственных диет
    1. Готовят искусственные рационы для личинок белокочанной капусты, используя модификации ранее разработанных рационов чешуекрылых4. В одной порции рациона содержалось 50 г зародышей пшеницы, 27 г казеина, 10 г клетчатки, 24 г сахарозы, 15 г капустной муки, 9 г солевой смеси Вессона, 12 г дрожжей Торулы, 3,6 г холестерина, 10,5 г витаминной смеси Вандерзанта, 1,1 г метилпарабена, 1,5 г сорбиновой кислоты, 3 г аскорбиновой кислоты и 0,175 г стрептомицина (см. таблицу материалов).
    2. Предварительно взвесьте сухие ингредиенты для нескольких диетических партий (таблица 1) и тщательно перемешайте для повышения однородности между типами рациона, прежде чем разделить их на отдельные партии для смешивания с металлическими растворами.
    3. Поместите сухие ингредиенты в блендер с льняным маслом и соответствующей металлической смесью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Льняное масло использовалось в настоящем эксперименте, так как оно продавалось прошлым поставщиком диет для насекомых. Теперь используется исключительно органическое льняное масло, которое производится из того же растения, но с меньшей вероятностью будет содержать какие-либо добавки, как коммерческие поставщики льняного масла.
    4. Разлейте приготовленную диету в пластиковые стаканчики объемом 118 мл (4 унции). Используйте растворимые соли металлов для добавления фокальных металлов в искусственные диеты. Стремитесь к концентрациям металлов на основе предварительных наблюдений за содержанием металлов в растениях (например, накопление никеля 55,56,57 или загрязнение растений на дорогах 58,59,60) и толерантности металлов в других чешуекрылых 49,50,51.
    5. Растворите соли металлов в 500-1000 мл дистиллированной воды, прежде чем принимать соответствующие количества для добавления в искусственные диеты. Например, чтобы составить диету с содержанием никеля 100 ppm, добавьте 317,6 мл 1 М раствора NiCl2 в искусственную диету перед смешиванием, чтобы получить конечную концентрацию в рационе 100 мг / г сухого веса Ni (приблизительно 53 мг / г сырого веса). Это количество соответствует средней измеренной концентрации 109,6 ppm (таблица 2) на основе атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни металлов были оценены исследовательскими аналитическими лабораториями Университета Миннесоты с шестью образцами.
  3. Содержание
    1. Храните яйца, собранные на растениях-хозяевах, в климатических камерах при температуре 23 ° C на фотопериодах 14:10 в течение 7 дней. После этого переведите личинок раннего второго возраста на искусственную диету.
    2. При переносе равномерно разделите личинки данного растения по четырем типам рациона, чтобы избежать смешивания партий личинок с типом диеты. Перенесите личинок (всего N = 346) по две особи на 118 мл диетической чашки, чтобы снизить заболеваемость из-за перенаселенности и оставить достаточно места для взрослых особей.
    3. Проделайте отверстия (по три на крышку) в крышках чашек для выращивания. Поместите чашки в пластиковые контейнеры размером с обувную коробку для выращивания, чередуя различные диеты, чтобы избежать каких-либо систематических эффектов расположения в камере для выращивания.
    4. Разместите чашки с личинками в климатических камерах при температуре 23 ° C на фотопериодах 14:10 (с бункерами с водой на дне камеры, чтобы поддерживать влажность около 50-60%, контролируемой с помощью домашнего датчика влажности). В случае, если чашки заплесневели (всего около восьми чашек в этом тематическом исследовании), извлеките чашки из камеры и удалите этих людей из эксперимента.
    5. Дайте личинкам окуклиться и появиться в чашках для выращивания (всего N = 162).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для условий выращивания в этом исследовании время развития от сбора яиц до появления взрослых особей составляло в среднем около 25-30 дней (в диапазоне от 20 до 40 дней, например, 25,28).
    6. По мере того, как куколки приближаются к появлению взрослых особей, ежедневно проверяйте чашки на наличие только что закрытых особей и удаляйте взрослых особей с сухими крыльями. Пометьте взрослых особей на задних крыльях соответствующим индивидуальным номером (присваиваемым при переносе личинок) с помощью черного шарпи с тонким наконечником. Определите пол каждой особи и отметьте на конверте вместе с их количеством и датой появления. Поместите взрослых бабочек в пергаминовые конверты и храните при температуре -20 ° C до дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У небольшой части появляющихся взрослых особей наблюдаются деформации крыльев, которые мешают полету и выживанию взрослых особей (5-8%); Эти люди исключены из анализа выживаемости для этих экспериментов.
  4. Измерение и анализ данных
    1. Измерьте выживаемость как выживание от второго возраста (когда гусеницы были помещены на диету) до появления взрослой особи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящее исследование было сосредоточено на выживаемости и времени развития в качестве показателей производительности на различных диетах.
    2. Измерьте время развития как количество дней между переходом на диету и появлением взрослых особей в климатической камере.
    3. Для анализа данных запустите два набора моделей, которые включали взаимодействие между металлом и концентрацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку оба взаимодействия были значимыми (F 2,194 = 4,56, p = 0,01 для времени развития и X2 = 12,1, p = 0,002 для выживания ), исследование продолжалось с отдельным анализом каждого металла.
    4. Чтобы проанализировать выживаемость, запустите тесты хи-квадрат для каждого металла, чтобы проверить влияние дозы металла (рассматриваемой как четыре категории) на выживаемость до взрослой жизни с полностью неповрежденными крыльями.
    5. При обнаружении значительного эффекта дозы выполните последующее хи-квадрат, чтобы сравнить каждый уровень с контрольной диетой. Чтобы проанализировать время развития (от момента перехода до появления во взрослом возрасте), проверьте влияние пола на время развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом эксперименте не было никакого влияния пола на время разработки (p > 0,10) для любого металла, мы исключили его из рассмотрения в модели.
    6. Запустите отдельный ANOVA для каждого металла, чтобы проверить влияние четырех концентраций на время проявки. Кроме того, проведите t-тесты для каждой концентрации по отношению к контролю, чтобы определить минимальную концентрацию, в которой наблюдается эффект производительности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании для всех анализов использовался JMP v16. Все исходные данные доступны на Mendeley61.

Representative Results

Обзор
Искусственная диета может быть использована для выращивания белых бабочек капусты в стандартных условиях, чтобы проверить влияние определенных диетических ингредиентов на производительность бабочек. В настоящей работе искусственные диеты использовались для изучения токсичности различных металлов, обнаруженных в растениях-хозяевах, растущих на загрязненных территориях (рис. 1). Личинки выращивали на диетах, содержащих возрастающие концентрации трех различных металлов (рис. 2; конкретные методологические детали представлены в разделе 6 протокола). На выживание и развитие бабочек в большей степени влияли медь и цинк и меньше всего на них влиял никель (рис. 3 и рис. 4), с чувствительностью, сравнимой с другими исследованиями бабочек и мотыльков, выращенных на искусственных диетах (рис. 5).

Выживание
Личинки бабочек были переведены на искусственные диеты, содержащие медь, никель, цинк или контроль, где каждый тип металла варьировался по концентрации на трех уровнях (таблица 3). Репрезентативное изображение личинок при возрастающей дозировке токсина показано на рисунке 2. Концентрация металлов не влияла на выживаемость никеля, но наблюдалось значительное влияние как для меди, так и для цинка (таблица 3 и рисунок 3). Последующее сравнение хи-квадрат показало, что цинк показал снижение выживаемости по сравнению с контрольной диетой только при самом высоком уровне цинка (1,000 ppm, post-hoc сравнение X12 = 8,41, p = 0,004; Рисунок 1). Медь также показала значительное снижение выживаемости только на самых высоких используемых уровнях (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008), хотя наблюдалось незначительное положительное увеличение выживаемости на двух самых низких уровнях (50 ppm и 100 ppm; Рисунок 3).

Время разработки
Наблюдалось значительное влияние концентрации меди и цинка на время проявки (табл . 4 и рис. 4). По мере увеличения концентрации меди наблюдалось увеличение времени проявки со значительным отклонением от контроля, начиная с 50 ppm (p = 0,027; Рисунок 3). По мере увеличения концентрации цинка наблюдалось увеличение времени проявки со значительным отклонением от контроля, начиная со 100 ppm (p = 0,03; Рисунок 4). Наблюдалась тенденция к увеличению содержания никеля, что приводило к увеличению времени развития (p = 0,08; Таблица 4), а сравнение каждой диеты с контролем показало значительные эффекты, начиная со 100 частей на миллион (p = 0,022; Рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1: Наблюдаемые уровни фокальных металлов в тканях бабочек и растениях-хозяевах. (Данные из62.) Уровни меди, никеля и цинка показаны для тканей бабочек Pieris (выращенных на бок-чой в лаборатории) и дикой горчицы (Bertorea sp.). Автомобили показывают уровни, наблюдаемые в листьях растений вдоль дорог с интенсивным движением53. Уровни металлов в искусственных диетах, используемых в этом исследовании, представлены в таблице 1; Точки представляют собой средние значения, а столбцы ошибок представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Изображение личинок белокочанной капусты, переведенных в тот же день на искусственные диеты с возрастающей концентрацией токсина. На этом изображении показаны личинки из исследования доза-реакция (представленного в 28 с использованием высушенного растительного материала для токсичного растения Aristolochia). Фото ESR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Различия в выживаемости при использовании металлических диет с возрастающими концентрациями. Звездочки указывают на значительное отклонение в выживаемости относительно контрольной диеты. Точные концентрации металлов в рационах указаны в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Влияние концентрации металлов на время разработки. Звездочками обозначена наименьшая концентрация металла, для которой имеется достоверная разница относительно контроля (с использованием t-критерия). Точные концентрации металлов в рационах указаны в таблице 2. Точки представляют собой средние значения, а полосы погрешности представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Сводная информация о толерантности к металлам у других чешуекрылых. Показаны сводные данные о выживаемости, построенные на основе 11 существующих исследований 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. Переменной ответа является уровень (в ppm) концентрации металла, на котором впервые проявляется негативное воздействие на выживаемость. Бабочки указывают на результаты этого исследования, отмечая, что значения допуска для никеля были выше, чем те, которые были измерены в этом исследовании. Точки представляют собой средние значения, а полосы погрешности представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ингредиент Взвешивайте как g мл
Зародыши пшеницы Сухие ингредиенты 50
Целлюлоза Сухие ингредиенты 10
Капустная мука Сухие ингредиенты 15
Казеин Сухие ингредиенты 27
Сахароза Сухие ингредиенты 24
Соляная смесь Wesson Сухие ингредиенты 9
Дрожжи Торула Сухие ингредиенты 12
Холестерин Сухие ингредиенты 3.6
Витаминный микс Сухие ингредиенты 10.5
Метилпарабен Сухие ингредиенты 0.75
Сорбиновая кислота Сухие ингредиенты 1.5
Аскорбиновая кислота Сухие ингредиенты 3
Стрептомицин Сухие ингредиенты 0.175
Льняное масло Влажные ингредиенты 5
Агар агар 15

Таблица 1: Рецепт искусственного питания. Показаны веса (и объемы) ингредиентов в одной партии диеты капустной белой бабочки. Сухие ингредиенты (и льняное масло) готовят отдельно от агаровой смеси (растворяют в 400 мл кипятка, затем доводят до более низкой температуры с 400 мл воды комнатной температуры).

Тип диеты Медь (ppm) Никель (ppm) Цинк (ppm)
Медь-"100 ppm" 96.1 1.75 69.9
Никель-"100 ppm" 7.29 109.6 68.9
Цинк - "100 ppm" 7.96 1.06 186.2
Цинк-"500 ppm" 6.51 1.16 708
Контроль 5.89 0.59 59.3

Таблица 2: Меры металлов в рационах. Показаны средние уровни меди, никеля и цинка в подмножестве искусственных диет, используемых в исследовании. Слева показано название диеты («тип» в анализе), а значения в кавычках являются расчетным уровнем. Целевая концентрация указана в кавычках. Подмножество диет, использованных в исследовании, было проанализировано, чтобы убедиться, что рассчитанные значения соответствовали целевому показателю с реализованными значениями; Следует отметить, что часто существует некоторая небольшая степень различий в составе компонентов диеты, и каждая зарегистрированная линия представляет собой только одну реплику.

Metal Пирсон Х32 P
Медь (N = 118) 17.82 0.0005
Никель (N = 152) 3.45 0.33
Цинк (N = 152) 12.52 0.006

Таблица 3: Влияние концентрации металлов на выживаемость. Показаны результаты теста хи-квадрат для каждого металла, противопоставляющие три концентрации металла по сравнению с контрольной диетой.

Металл F P
Медь (N = 61) Ф3,57 = 9,84 <0,0001
Никель (N = 75) Ф3,71 = 2,35 0.079
Цинк (N = 64) Ф3,60= 3,79 0.015

Таблица 4: Влияние концентрации металлов на время проявки. Приведены результаты индивидуальных ANOVA для каждого металла.

Доступность данных:

Все данные доступны по Mendeley61.

Discussion

В этом исследовании белокочанные бабочки (Pieris rapae) были выращены на искусственной диете, чтобы изучить различия в токсичности тяжелых металлов. При этом в этом исследовании представлены общие методы выращивания и лабораторные исследования этой простой в управлении системы бабочек. В этом обсуждении сначала рассматриваются более общие вопросы о методах, рассмотренных здесь, затем рассматриваются наши научные результаты, прежде чем закончить размышлениями о компонентах искусственной диеты.

Рассмотренный здесь протокол дает шаги общего метода выращивания бабочек капустной белянки, но в этом протоколе есть много моментов, которые можно изменить. Например, в то время как в представленном здесь тематическом исследовании для кормления используются губки, другим исследователям повезло с зубными фитилями и шелковыми цветами, наполненными медовой водой5. В то время как настоящее исследование использует медовую воду в качестве пищи, другие исследователи использовали растворы сахара и даже Gatorade. Если куколок необходимо взвесить или переместить в другие условия для появления (например, вызвать диапаузу и необходимость хранения в холодильнике в течение 1 месяца), исследователь может легко удалить их из чашек, сбрызнув их водой, чтобы смочить их шелковые насадки, и захватить их перьевыми щипцами, а затем снова повесить их с помощью двустороннего скотча. Если исследователям нужна большая гибкость с точки зрения того, когда взрослых бабочек перемещают в клетки для взрослого поведения, их можно держать в холодильнике в течение нескольких недель, но их нужно кормить. Раз в несколько дней бабочек следует выводить, чтобы их кормили разбавленным медовым водным раствором. При комнатном освещении это можно сделать, используя булавку, чтобы развернуть хоботок в пищу. Что касается взрослых, то на белокочанных бабочках можно принять широкий спектр фитнес-мер. Размер тела может быть измерен как влажная или сухая масса личинок на определенных стадиях, куколок или взрослых особей (принесенных в жертву или содержащихся в пергаминовых конвертах), или путем измерения длины крыльев в программе ImageJ (см. 12,24,25,28). Плодовитость самок в течение жизни может быть измерена с помощью ежедневных сборов яиц на растениях-хозяевах 25,69,70, а размер определенных признаков может быть измерен как показатель производительности; Например, масса или объем мозга или отдельных областей мозга 62,71,72, или масса или содержание белка в грудной клетке или летательной мышце 62,70. Наконец, взрослые особи могут быть использованы в поведенческих исследованиях для проверки любого количества вопросов, изучающих влияние манипуляций с диетой на кормление или выбор яйцекладки27,73.

Если протокол выращивания не работает должным образом, необходимо устранить несколько аспектов. Во-первых, можно спросить, достаточно ли высок уровень освещенности, чтобы вызвать нормальное поведение взрослого человека. В то время как адаптированные к лаборатории линии Pieris будут откладывать яйца под флуоресцентным светом, единственным искусственным светом, который работает для линий дикого типа, являются мощные тепличные светильники широкого спектра. Естественное освещение в теплицах, на подоконниках или на открытом воздухе лучше всего подходит для стимулирования спаривания и яйцекладки. Во-вторых, если яйца не вылупляются или личинки умирают на ранних стадиях развития, необходимо учитывать несколько моментов. Растительный материал-хозяин должен быть органическим, отмечая, что «органические» растения из магазинов иногда обрабатываются химическими веществами, которые могут убить личинок, поэтому выращивание собственных растений-хозяев часто лучше. Если уровень принятия хозяина ниже, можно попробовать более молодые листья с более высоким содержанием азота, представляя горшечные растения вместо отдельных листьев и обеспечивая спаривание самок. Самки примут посев капусты, даже небольшие ростки, которым исполнилось 2 недели. Парафиновый метод хорошо работает для переноса яиц в различные условия, но следует отметить, что уровень принятия, как правило, ниже, чем у целых растений. В-третьих, все составляющие рациона должны быть качественными и не просроченными. Льняное масло следует заменять ежегодно и хранить в холодильнике24,25. Зародыши пшеницы, витаминная смесь и антибиотики также следует хранить в прохладном месте. В-четвертых, можно подумать о настройке диетической чашки. Для выращивания можно использовать любое количество одноразовых пластиковых стаканчиков, от 1 унции до 15 унций. Мы обнаружили, что 4 унции - это хороший размер, чтобы обеспечить появление взрослых особей, и он прекрасно упаковывается в наши климатические камеры. Отверстия, проткнутые в крышках, пропускают воздух, но слишком большое количество отверстий может высушить рацион в условиях низкой влажности, поэтому это число, возможно, придется скорректировать. В-пятых, условия в климатической камере, возможно, придется отрегулировать в сочетании с условиями чашки. Если условия слишком сухие, растения-хозяева с яйцами могут высохнуть до того, как личинки могут быть перенесены, а чашки с диетой могут высохнуть до появления бабочек. С другой стороны, если условия слишком влажные, чашки могут содержать плесень и болезни. Исследователям, возможно, придется регулировать воздушный поток в чашках с помощью сетчатых крышек или большего или меньшего количества отверстий в крышках. Другой распространенной проблемой является освещение камеры, которое достаточно яркое, чтобы вызвать колебания температуры в чашках и накопление конденсата; Использование диммерного света - простой вариант для выращивания личинок.

Что касается исследовательских вопросов в этой статье, это исследование показало, что белокочанная капуста была относительно более чувствительна к меди, чем к никелю или цинку. Медь оказала значительное негативное воздействие на время развития при концентрациях до 50 частей на миллион (рис. 3 и таблица 3) и на выживаемость при концентрации 500 ppm (рис. 4, таблица 4). Напротив, не было выявлено негативного влияния никеля на выживаемость (до 500 ppm; Рисунок 3) или отрицательное влияние на время разработки при 100 ppm (рис. 4). Белокочанная капуста была довольно терпима к цинку, при этом эффекты выживания наблюдались только при 1000 ppm (рис. 3), а отрицательные эффекты на время развития начинались со 100 ppm (рис. 4). Исходя из относительно больших концентраций цинка в тканях бабочек и горчицы (их растения-хозяина; 1), ожидалось, что будет наблюдаться относительно более высокая толерантность к цинку. Однако чувствительность к меди и толерантность к никелю были несколько неожиданными, учитывая очень низкий уровень никеля в тканях бабочек (рис. 1) и необходимость меди в качестве микроэлемента. Эти неожиданные результаты обсуждаются ниже после рассмотрения толерантности этих металлов у других бабочек и мотыльков.

Для сопоставления имеющихся данных с чувствительностью к металлам, измеренной у других чешуекрылых, были собраны данные существующих исследований о минимальной концентрации, где тяжелые металлы отрицательно влияли на выживаемость 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; эти исследования были сосредоточены на мотыльках, особенно на видах вредителей (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Все измеренные значения чувствительности в этом исследовании близки к диапазону, измеренному для этих других видов (рис. 5). Тем не менее, мера толерантности к никелю в этом исследовании, по-видимому, выше, чем ожидалось - хотя не было значительного эффекта выживания при 500 ppm, предыдущее исследование Pieris rapae также обнаружило очень высокую толерантность к никелю (значительные эффекты, начиная с 1,000 ppm56), несмотря на низкие уровни в их тканях естественным образом (рис. 1). Мера чувствительности к меди в этом исследовании также, по-видимому, находится на низком уровне для исследований чешуекрылых. В то время как использование искусственной диеты позволяет удобно и контролируемо сравнивать относительную чувствительность к металлам, важно отметить, что компоненты диеты могут изменить измерение абсолютной чувствительности к металлам. Например, витамин С в рационе может компенсировать индуцированный металлами окислительный стресс74, или антибиотики в рационе могут изменять любое воздействие микробов на обработку металлов75. Интересным направлением будущих исследований будет систематическое манипулирование такими компонентами диеты для проверки влияния на токсичность металлов, особенно с учетом вопросов о функциональной роли кишечных микробов чешуекрылых 76,77 и компонентов нектара, которые могут обладать антиоксидантными свойствами78. Кроме того, различия в диетических потребностях у разных видов могут затруднить межвидовые сравнения, и методы, основанные на искусственной диете, должны дополняться манипуляциями с растениями-хозяевами.

Эти бабочки особенно терпимы к никелю и чувствительны к меди. Предыдущие исследования показали, что многие растения семейства горчичных, в которое входят растения, предпочитаемые Pieridae, гипераккумулируют никель в качестве защитного механизма против травоядных 55,56,63,79,80,81. Эта гипераккумуляция составляет более 1000 частей на миллион в растительной ткани, что на порядки больше, чем у большинства растений (рис. 1). Вполне возможно, что Pieris имеют особенно высокую толерантность к никелю из-за прошлого отбора такими никелевыми аккумуляторами, как предполагалось ранее26. Хотя медь реже изучается в качестве микроэлемента в рационах насекомых, есть некоторые свидетельства того, что она играет небольшую роль в размножении и иммунитете, хотя в первую очередь у насекомых, питающихся кровью (например, 82,83). Возможно, что медь играет менее важную физиологическую роль у бабочек, чем у других животных 84,85,86, что согласуется с недавней работой, в которой подчеркивается, что медь может быть таким же опасным загрязнителем для насекомых, как свинец, кадмий и ртуть (например, 87,88,89). В то время как было показано, что Pieris избегает загрязнения медью на низких уровнях90, подвижность меди в растениях (например, перемещение в листья и цветы) также указывает на то, что она является металлическим загрязнителем, вызывающим беспокойство91.

Хотя эти результаты предоставляют интересные данные об относительной токсичности этих металлов для белокочанных бабочек, эта статья также направлена на то, чтобы быть широко используемой в качестве подробной визуальной иллюстрации методов выращивания этой мощной системы. Белокочанную капусту легко выращивать и манипулировать ею в контролируемых лабораторных экспериментах 4,5, облегчая исследования поиска хозяина 6,7,8, кормления 9,10,11 и полового отбора12,13,14. Способность выращивать этих бабочек на искусственной диете является ключом к созданию общих условий сада для сравнений и манипулирования питательными веществами, токсинами и даже новыми растениями-хозяевами. Тем не менее, важно отметить, что эта искусственная диета не обязательно является оптимальной искусственной диетой для этого вида и, вероятно, может быть улучшена с помощью будущих манипуляций. Например, соляная смесь в этой диете (и других диетах чешуекрылых) была первоначально разработана для позвоночных и имеет более высокий уровень кальция, чем то, что нужно большинству насекомых92,93. Таким образом, некоторые из наших усилий по выращиванию сделали специальные солевые смеси с более низким уровнем кальция (например, 62), а другие используют «соляную смесь Бека», которая может быть более подходящей для многих видов насекомых94. В наших собственных манипуляциях мы также обнаружили, что бабочки лучше работали с относительно меньшим количеством зародышей пшеницы и относительно большим количеством целлюлозы по сравнению с исходными концентрациями4. Одной из областей, требующих дальнейшего внимания, является источник липидов и их концентрация в рационе. Например, прошлая работа показала, что переход от льняного масла (используемого в этом исследовании) к фосфолипидам увеличил скорость спаривания и темпы роста пиериса на искусственных диетах95. Добавление определенных жирных кислот в искусственные диеты может иметь дополнительные положительные эффекты96,97. Оптимизация искусственной диеты Пиериса98,99 создает возможности для решения интересных вопросов об экологии питания 100,101,102, эволюционной экологии и экотоксикологии. Эти подходы к искусственному питанию позволяют исследователям ответить на вопросы о роли специфических липидов в когнитивной эволюции 103, предварительной адаптации к токсинам28, диетических компонентах, снижающих токсичность загрязняющих веществ 104, или стехиометрических взаимодействиях между питательными веществами105.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарны за поддержку этой работы ассистентам бакалавриата во время воспитания, в частности Регине Курандиной и Рее Смыкальской. Кэролин Калиновски помогла собрать литературу о токсичности металлов у других чешуекрылых. Эта работа стала возможной благодаря летнему исследовательскому гранту Департамента экологии, эволюции и поведения Университета Миннесоты.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-L Pyrex beaker Fisher Scientific 07-250-059
500 mL graduated cylinder Fisher Scientific 03-007-43
60-mm plastic petri dish lid Fisher Scientific 08-757-100B
Ascorbic Acid Frontier 6015
Blender Amazon - Ninja Store BL610 Professional
Cabbage Flour Frontier 1086
Casein Frontier 1100
Celluose Frontier 3425
Cholsterol Sigma C3045
Cups for rearing (4 oz) Wasserstrom 6094583 purchase with matching lids
Fine Mesh Agar Sigma
Flaxseed Oil amazon B004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch Amazon - Yimaa Direct B08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) Amazon - Wizard Coin Supply B0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") Amazon B07SK6P94S
Methyl Paraben Frontier 7685
Ohaus Portable Scale Fisher Scientific 02-112-228
Organic Honey Amazon B07DHQQFGM
Photo studio portable lightbox Amazon B07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox size Amazon B09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-680-50
Sorbic Acid Sigma S1626
Spatulas Fisher Scientific 14-357Q
Streptomycin Sigma S9137
Sucrose Target
Torula Yeast Frontier 1720
Vanderzant vitamin mix Frontier F8045
Weigh boats Fisher Scientific 01-549-750
Wesson Salt Mix Frontier F8680
Wheat Germ Frontier G1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoop Amazon - Educational Science B00O5JDLVC
Yellow sponges Amazon-Celox B0B8HTHY5B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snyder, L. D., Gomez, M. I., Mudrak, E. L., Power, A. G. Landscape-dependent effects of varietal mixtures on insect pest control and implications for farmer profits. Ecological Applications. 31 (2), 2246 (2021).
  2. Shelton, A., Andaloro, J. T., Barnards, J. Effects of cabbage looper, imported cabbageworm, and diamondback moth on fresh market and processing cabbage. Journal of Economic Entomology. 75 (4), 742-745 (1982).
  3. Cartea, M. E., Padilla, G., Vilar, M., Velasco, P. Incidence of the major Brassica pests in northwestern Spain. Journal of Economic Entomology. 102 (2), 767-773 (2009).
  4. Troetschler, R. G., Malone, C. M., Bucago, E. R., Johnston, M. R. System for rearing Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae) on a noncruciferous artificial diet developed for Manduca sexta (Lepidoptera: Sphingidae). Journal of Economic Entomology. 78 (6), 1521-1523 (1985).
  5. Webb, S., Shelton, A. Laboratory rearing of the imported cabbageworm. New Yorks Food and Life Sciences Bulletin. 122, 1-6 (1988).
  6. Root, R. B., Kareiva, P. M. The search for resources by cabbage butterflies (Pieris rapae): ecological consequences and adaptive significance of Markovian movements in a patchy environment. Ecology. 65 (1), 147-165 (1984).
  7. Hern, A., Edwards-Jones, G., McKinlay, R. G. A review of the pre-oviposition behaviour of the small cabbage white butterfly, Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae). Annals of Applied Biology. 128 (2), 349-371 (1996).
  8. Renwick, J. A. A., Radke, C. D. Sensory cues in host selection for oviposition by the cabbage butterfly, Pieris-Rapae. Journal of Insect Physiology. 34 (3), 251-257 (1988).
  9. Lewis, A. C. Memory constraints and flower choice in Pieris rapae. Science. 232 (4752), 863-865 (1986).
  10. Kandori, I., Ohsaki, N. The learning abilities of the white cabbage butterfly, Pieris rapae, foraging for flowers. Researches on Population Ecology. 38, 111-117 (1996).
  11. Alm, J., Ohmeiss, T. E., Lanza, J., Vriesenga, L. Preference of cabbage white butterflies and honey-bees for nectar that contains amino-acids. Oecologia. 84 (1), 53-57 (1990).
  12. Espeset, A., et al. Anthropogenic increases in nutrients alter sexual selection dynamics: a case study in butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 598-608 (2019).
  13. Tigreros, N. Linking nutrition and sexual selection across life stages in a model butterfly system. Functional Ecology. 27 (1), 145-154 (2013).
  14. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
  15. Stoehr, A. M., Goux, H. Seasonal phenotypic plasticity of wing melanisation in the cabbage white butterfly, Pieris rapae L. (Lepidoptera: Pieridae). Ecological Entomology. 33 (1), 137-143 (2008).
  16. Stoehr, A. M., Walker, J. F., Monteiro, A. Spalt expression and the development of melanic color patterns in pierid butterflies. Evodevo. 4 (1), 6 (2013).
  17. Stoehr, A. M., Wojan, E. M. Multiple cues influence multiple traits in the phenotypically plastic melanization of the cabbage white butterfly. Oecologia. 182 (3), 691-701 (2016).
  18. Ryan, S. F., et al. Global invasion history of the agricultural pest butterfly Pieris rapae revealed with genomics and citizen science. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 20015-20024 (2019).
  19. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R. Patterns of phenotypic plasticity in common and rare environments: a study of host use and color learning in the cabbage white butterfly Pieris rapae. American Naturalist. 173 (5), 615-631 (2009).
  20. Kono, Y. Rearing Pieris rapae crucivora Boisduval (Lepidoptera: Pieridae) on artificial diets. Applied Entomology and Zoology. 3 (2), 96-98 (1968).
  21. Parra, J. R. The Evolution of Artificial Diets and their Interactions in Science and Technology. Insect Bioecology and Nutrition for Integrated Pest Management. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2012).
  22. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. Developmental responses to variable diet composition in a butterfly: the role of nitrogen, carbohydrates and genotype. Oikos. 119 (4), 636-645 (2010).
  23. Rotem, K., Agrawal, A. A., Kott, L. Parental effects in Pieris rapae in response to variation in food quality: adaptive plasticity across generations. Ecological Entomology. 28 (2), 211-218 (2003).
  24. Shephard, A. M., et al. Assessing zinc tolerance in two butterfly species: consequences for conservation in polluted environments. Insect Conservation and Diversity. 13 (2), 201-210 (2020).
  25. Shephard, A. M., Zambre, A. M., Snell-Rood, E. C. Evaluating costs of heavy metal tolerance in a widely distributed, invasive butterfly. Evolutionary Applications. 14 (5), 1390-1402 (2021).
  26. Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Nickel exposure has complex transgenerational effects in a butterfly. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 1008-1017 (2018).
  27. Philips, K. H., Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Developmental lead exposure has mixed effects on butterfly cognitive processes. Animal Cognition. 20 (1), 87-96 (2017).
  28. Sikkink, K. L., et al. Tolerance of novel toxins through generalized mechanism simulating gradual host shifts of butterflies. American Naturalist. 195 (3), 485-503 (2020).
  29. Pentzold, S., et al. excretion and avoidance of cyanogenic glucosides in insects with different feeding specialisations. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 66, 119-128 (2015).
  30. Lampert, E. C., Dyer, L. A., Bowers, M. D. Dietary specialization and the effects of plant species on potential multitrophic interactions of three species of nymphaline caterpillars. Entomologia Experimentalis et Applicata. 153 (3), 207-216 (2014).
  31. Genc, H., Nation, J. L. An artificial diet for the butterfly Phyciodes phaon (Lepidoptera: Nymphalidae). Florida Entomologist. 87 (2), 194-198 (2004).
  32. Brinton, F., Proverbs, M., Carty, B. Artificial diet for mass production of the codling moth, Carpocapsa Pomonella (Lepidoptera: Olethreutidae)1. The Canadian Entomologist. 101 (6), 577-584 (1969).
  33. Metwally, H. M., et al. Low cost artificial diet for rearing the greater wax moth, Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) as a host for entomopathogenic nematodes. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 22 (1), 15 (2012).
  34. Carpenter, J. E., Bloem, S. Interaction between insect strain and artificial diet in diamondback moth development and reproduction. Entomologia Experimentalis et Applicata. 102 (3), 283-294 (2002).
  35. Jaiswal, A., Verma, A., Jaiswal, P. Detrimental effects of heavy metals in soil, plants, and aquatic ecosystems and in humans. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology. 37 (3), 183-197 (2018).
  36. Kumar, A., et al. Lead toxicity: Health hazards, influence on food chain, and sustainable remediation approaches. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (7), 2179 (2020).
  37. Gall, J. E., Boyd, R. S., Rajakaruna, N. Transfer of heavy metals through terrestrial food webs: a review. Environmental Monitoring and Assessment. 187, 201 (2015).
  38. Mohammed, A. S., Kapri, A., Goel, R. Heavy Metal Pollution: Source, Impact, and Remedies. Biomanagement of Metal-Contaminated Soils. , Springer. 1-28 (2011).
  39. Mitra, A., Chatterjee, S., Voronina, A. V., Walther, C., Gupta, D. K. Lead toxicity in plants: a review. Lead in Plants and the Environment. , Springer. 99-116 (2020).
  40. Perugini, M., et al. Heavy metal (Hg, Cr, Cd, and Pb) contamination in urban areas and wildlife reserves: Honeybees as bioindicators. Biological Trace Element Research. 140 (2), 170-176 (2011).
  41. Rycewicz-Borecki, M., McLean, J. E., Dupont, R. R. Bioaccumulation of copper, lead, and zinc in six macrophyte species grown in simulated stormwater bioretention systems. Journal of Environmental Management. 166, 267-275 (2016).
  42. Zulfiqar, U., et al. Lead toxicity in plants: Impacts and remediation. Journal of Environmental Management. 250, 109557 (2019).
  43. Spliethoff, H. M., et al. Estimated lead (Pb) exposures for a population of urban community gardeners. Environmental Geochemistry and Health. 38, 955-971 (2016).
  44. Li, C. C., et al. Foliar dust as a reliable environmental monitor of heavy metal pollution in comparison to plant leaves and soil in urban areas. Chemosphere. 287, 132341 (2022).
  45. Ram, S. S., et al. Plant canopies: bio-monitor and trap for re-suspended dust particulates contaminated with heavy metals. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 19, 499-508 (2014).
  46. Karri, V., Schuhmacher, M., Kumar, V. Heavy metals (Pb, Cd, As and MeHg) as risk factors for cognitive dysfunction: A general review of metal mixture mechanism in brain. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 203-213 (2016).
  47. Tong, S., von Schirnding, Y. E., Prapamontol, T. Environmental lead exposure: a public health problem of global dimensions. Bulletin of the World Health Organization. 78 (9), 1068-1077 (2000).
  48. Liu, J. H., Lewis, G. Environmental toxicity and poor cognitive outcomes in children and adults. Journal of Environmental Health. 76 (6), 130-138 (2014).
  49. Gintenreiter, S., Ortel, J., Nopp, H. J. Effects of different dietary levels of cadmium, lead, copper, and zinc on the vitality of the forest pest insect Lymantria-Dispar L (Lymantriidae, Lepid). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 25, 62-66 (1993).
  50. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. Testing the joint effects hypothesis of elemental defense using Spodoptera exigua. Journal of Chemical Ecology. 41 (2), 168-177 (2015).
  51. Coleman, C. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Extending the elemental defense hypothesis: Dietary metal concentrations below hyperaccumulator levels could harm herbivores. Journal of Chemical Ecology. 31 (8), 1669-1681 (2005).
  52. Kaushal, S. S., et al. Making 'chemical cocktails'-Evolution of urban geochemical processes across the periodic table of elements. Applied Geochemistry. 119, 104632 (2020).
  53. Shephard, A. M., et al. Traffic patterns, more than adjacent land use, influence element content of roadside forbs for insect pollinators. Ecological Solutions and Evidence. 3 (4), 12195 (2022).
  54. Scott, J. A. The Butterflies of North America: A Natural History and Field Guide. , Stanford University Press. (1992).
  55. Boyd, R. S. High-nickel insects and nickel hyperaccumulator plants: A review. Insect Science. 16 (1), 19-31 (2009).
  56. Boyd, R. S., Martens, S. N. Nickel hyperaccumulated by thlaspi-montanum var montanum is acutely toxic to an insect herbivore. Oikos. 70 (1), 21-25 (1994).
  57. Cempel, M., Nickel, G. A review of its sources and environmental toxicology. Polish Journal of Environmental Studies. 15 (3), 375-382 (2006).
  58. Aslam, J., Khan, S. A., Khan, S. H. Heavy metals contamination in roadside soil near different traffic signals in Dubai, United Arab Emirates. Journal of Saudi Chemical Society. 17 (3), 315-319 (2013).
  59. Mitchell, T. S., et al. Traffic influences nutritional quality of roadside plants for monarch caterpillars. Science of the Total Environment. 724, 138045 (2020).
  60. Voegborlo, R., Chirgawi, M. Heavy metals accumulation in roadside soil and vegetation along a major highway in Libya. Journal of Science and Technology. 27 (3), 86-97 (2007).
  61. Snell-Rood, E., Kobiela, M. Data for: Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. , Mendeley Data. (2023).
  62. Snell-Rood, E. C., Espeset, A., Boser, C. J., White, W. A., Smykalski, R. Anthropogenic changes in sodium affect neural and muscle development in butterflies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10221-10226 (2014).
  63. Boyd, R. S., Moar, W. J. The defensive function of Ni in plants: response of the polyphagous herbivore Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) to hyperaccumulator and accumulator species of Streptanthus (Brassicaceae). Oecologia. 118 (2), 218-224 (1999).
  64. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. J. Exploring lower limits of plant elemental defense by cobalt, copper, nickel, and zinc. Journal of Chemical Ecology. 39 (5), 666-674 (2013).
  65. Davis, M. A., Boyd, R. S., Cane, J. H. Host-switching does not circumvent the Ni-based defence of the Ni hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). South African Journal of Science. 97 (11-12), 554-557 (2001).
  66. Dubovskiy, I. M., Grizanova, E. V., Ershova, N. S., Rantala, M. J., Glupov, V. V. The effects of dietary nickel on the detoxification enzymes, innate immunity and resistance to the fungus Beauveria bassiana in the larvae of the greater wax moth Galleria mellonella. Chemosphere. 85 (1), 92-96 (2011).
  67. Jhee, E. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Nickel hyperaccumulation as an elemental defense of Streptanthus polygaloides (Brassicaceae): influence of herbivore feeding mode. New Phytologist. 168 (2), 331-343 (2005).
  68. Zhou, J. L., Shu, Y. H., Zhang, G. R., Zhou, Q. Lead exposure improves the tolerance of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) to cypermethrin. Chemosphere. 88 (4), 507-513 (2012).
  69. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Reproductive tradeoffs of learning in a butterfly. Behavioral Ecology. 22 (2), 291-302 (2011).
  70. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Plasticity in learning causes immediate and trans-generational changes in allocation of resources. Integrative and Comparative Biology. 53 (2), 329-339 (2013).
  71. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R., Brain Gronenberg, W. size: A global or induced cost of learning. Brain Behavior and Evolution. 73 (2), 111-128 (2009).
  72. Snell-Rood, E. C., et al. Nutritional constraints on brain evolution: Sodium and nitrogen limit brain size. Evolution. 74 (10), 2304-2319 (2020).
  73. Jaumann, S., Snell-Rood, E. C. Adult nutritional stress decreases oviposition choosiness and fecundity in female butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 852-863 (2019).
  74. Sahiti, H., Bislimi, K., Bajgora, A., Rexhepi, A., Dalo, E. Protective effect of vitamin C against oxidative stress in common carp (Cyprinus carpio) induced by heavy metals. International Journal of Agriculture and Biosciences. 7 (2), 71-75 (2018).
  75. Rothman, J. A., Leger, L., Graystock, P., Russell, K., McFrederick, Q. S. The bumble bee microbiome increases survival of bees exposed to selenate toxicity. Environmental Microbiology. 21 (9), 3417-3429 (2019).
  76. Hammer, T. J., Janzen, D. H., Hallwachs, W., Jaffe, S. P., Fierer, N. Caterpillars lack a resident gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (36), 9641-9646 (2017).
  77. Hammer, T. J., Sanders, J. G., Fierer, N. Not all animals need a microbiome. FEMS Microbiology Letters. 366 (10), (2019).
  78. Baker, H. G., Baker, I. Coevolution of Animals and Plants. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
  79. Boyd, R. S., Davis, M. A., Wall, M. A., Balkwill, K. Metal concentrations of insects associated with the South African Ni hyperaccumulator Berkheya coddii (Asteraceae). Insect Science. 13 (2), 85-102 (2006).
  80. Boyd, R. S., Wall, M. A., Jaffre, T. Nickel levels in arthropods associated with Ni hyperaccumulator plants from an ultramafic site in New Caledonia. Insect Science. 13 (4), 271-277 (2006).
  81. Kramer, U. Metal hyperaccumulation in plants. Annual Review of Plant Biology. 61, 517-534 (2010).
  82. Cardoso-Jaime, V., Broderick, N. A., Maya-Maldonado, K. Metal ions in insect reproduction: a crosstalk between reproductive physiology and immunity. Current Opinion in Insect Science. 52, 100924 (2022).
  83. Rivera-Perez, C., Clifton, M. E., Noriega, F. G. How micronutrients influence the physiology of mosquitoes. Current Opinion in Insect Science. 23, 112-117 (2017).
  84. Lee, J. H. Micronutrient deficiency syndrome: zinc, copper and selenium. Pediatric Gastroenterology, Hepatology & Nutrition. 15 (3), 145-150 (2012).
  85. Nube, M., Voortman, R. L. Human micronutrient deficiencies: linkages with micronutrient deficiencies in soils, crops and animal nutrition. Combating Micronutrient Deficiencies: Food-Based Approaches. , CABI International. Wallingford, UK. 289-311 (2011).
  86. Wysocka, D., Snarska, A., Sobiech, P. Copper-An essential micronutrient for calves and adult cattle. Journal of Elementology. 24 (1), 101-110 (2019).
  87. Oliveira, C. S., et al. Toxic metals that interact with thiol groups and alteration in insect behavior. Current Opinion in Insect Science. 52, 100923 (2022).
  88. Mogren, C. L., Trumble, J. T. The impacts of metals and metalloids on insect behavior. Entomologia Experimentalis et Applicata. 135 (1), 1-17 (2010).
  89. Hladun, K. R., Di, N., Liu, T. X., Trumble, J. T. Metal contaminant accumulation in the hive: Consequences for whole-colony health and brood production in the honey bee (Apis mellifera L.). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (2), 322-329 (2016).
  90. Elbassiouny, S. A. Changes in food-related behavioral-patterns of some phytophagous insect species following exposures to an antifeedant. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 26 (3-4), 483-496 (1991).
  91. Hladun, K. R., Parker, D. R., Trumble, J. T. Cadmium, copper, and lead accumulation and bioconcentration in the vegetative and reproductive organs of Raphanus sativus: Implications for plant performance and pollination. Journal of Chemical Ecology. 41, 386-395 (2015).
  92. Nation, J., Robinson, F. Concentration of some major and trace elements in honeybees, royal jelly and pollens, determined by atomic absorption spectrophotometry. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 35-43 (1971).
  93. Herbert Jr, E. W., Shimanuki, H. Mineral requirements for brood-rearing by honeybees fed a synthetic diet. Journal of Apicultural Research. 17 (3), 118-122 (1978).
  94. Beck, S. D., Chippendale, G., Swinton, D. Nutrition of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. VI. A larval rearing medium without crude plant fractions. Annals of the Entomological Society of America. 61 (2), 459-462 (1968).
  95. Junnikkala, E. Rearing Pieris-Brassicae (L.) on a phospholipid and vitamin-supplemented semi-artificial diet. Annales Zoologici Fennici. 17 (1), 39-42 (1980).
  96. Hixson, S. M., et al. Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids have developmental effects on the crop pest, the Cabbage White Butterfly Pieris rapae. PLoS One. 11 (3), e0152264 (2016).
  97. Turunen, S. Lipid utilization in adult Pieris brassicae with special reference to the role of linolenic acid. Journal of Insect Physiology. 20 (7), 1257-1269 (1974).
  98. Vanderzant, E. S. Development, significance, and application of artificial diets for insects. Annual Review of Entomology. 19, 139-160 (1974).
  99. Cohen, A. C. Insect Diets: Science and Technology. , CRC Press. (2003).
  100. Balluffi-Fry, J., Leroux, S. J., Champagne, E., Vander Wal, E. In defense of elemental currencies: can ecological stoichiometry stand as a framework for terrestrial herbivore nutritional ecology. Oecologia. 199 (1), 27-38 (2022).
  101. Coogan, S. C. P., Raubenheimer, D., Zantis, S. P., Machovsky-Capuska, G. E. Multidimensional nutritional ecology and urban birds. Ecosphere. 9 (4), 02177 (2018).
  102. Raubenheimer, D., Simpson, S. J., Mayntz, D. Nutrition, ecology and nutritional ecology: toward an integrated framework. Functional Ecology. 23 (1), 4-16 (2009).
  103. Arien, Y., Dag, A., Zarchin, S., Masci, T., Shafir, S. Omega-3 deficiency impairs honey bee learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (51), 15761-15766 (2015).
  104. Man, K. Y., et al. Use of biochar as feed supplements for animal farming. Critical Reviews in Environmental Science and Technology. 51 (2), 187-217 (2021).
  105. Shephard, A. M., Knudsen, K., Snell-Rood, E. C. Anthropogenic sodium influences butterfly responses to nitrogen-enriched resources: implications for the nitrogen limitation hypothesis. Oecologia. 201 (4), 941-952 (2023).

Tags

Биология выпуск 198
Выращивание капустной белой бабочки (<em>Pieris rapae</em>) в контролируемых условиях: тематическое исследование толерантности к тяжелым металлам
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E.… More

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E. Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. J. Vis. Exp. (198), e65383, doi:10.3791/65383 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter