Summary
Mitokondrienetværket er ekstremt komplekst, hvilket gør det meget udfordrende at analysere. Et nyt MATLAB-værktøj analyserer levende konfokale mitokondrier i timelapse-billeder, men resulterer i en stor outputvolumen, der kræver individuel manuel opmærksomhed. For at løse dette problem blev der udviklet en rutineoptimering, der muliggør hurtig filanalyse.
Abstract
Det komplekse mitokondrienetværk gør det meget udfordrende at segmentere, følge og analysere levende celler. MATLAB-værktøjer tillader analyse af mitokondrier i timelapse-filer, hvilket forenkler og fremskynder billedbehandlingsprocessen betydeligt. Ikke desto mindre producerer eksisterende værktøjer en stor outputvolumen, der kræver individuel manuel opmærksomhed, og grundlæggende eksperimentelle opsætninger har et output på tusindvis af filer, der hver kræver omfattende og tidskrævende håndtering.
For at løse disse problemer blev der udviklet en rutinemæssig optimering i både MATLAB-kode og live-script-formularer, hvilket giver mulighed for hurtig filanalyse og reducerer dokumentlæsning og databehandling betydeligt. Med en hastighed på 100 filer / min muliggør optimeringen en samlet hurtig analyse. Optimeringen opnår resultaterne output ved at beregne gennemsnittet af rammespecifikke data for individuelle mitokondrier gennem tidsrammer og analysere data på en defineret måde, i overensstemmelse med output fra eksisterende værktøjer. Live konfokal billeddannelse blev udført ved anvendelse af farvestoffet tetramethylrhodaminmethylester, og den rutinemæssige optimering blev valideret ved behandling af neuronale celler med retinsyrereceptoragonister (RAR), hvis virkninger på neuronale mitokondrier er fastlagt i litteraturen. Resultaterne var i overensstemmelse med litteraturen og tillod yderligere karakterisering af mitokondrienetværksadfærd som reaktion på isoformspecifik RAR-modulering.
Denne nye metode tillod hurtig og valideret karakterisering af mitokondrienetværk for hele neuron, men det giver også mulighed for differentiering mellem axon og cellelegememitokondrier, en væsentlig funktion at anvende inden for neurovidenskabsområdet. Desuden kan denne protokol anvendes til eksperimenter ved hjælp af hurtigtvirkende behandlinger, hvilket muliggør billeddannelse af de samme celler før og efter behandlinger, der overskrider neurovidenskabens område.
Introduction
Cellulære mitokondrier sidder i centrum for alle fysiologiske tilstande, og en grundig forståelse af deres homeostase (mitostase) og adfærd er afgørende for at hjælpe med at identificere farmakologisk behandling for en lang række sygdomme, herunder kræft og Alzheimers sygdom 1,2.
Mitokondrier spiller afgørende cellulære roller i energihomeostase, ATP-generering, calciumbuffering og ROS-regulering, og mitostase er afgørende for at opretholde proteinhomeostase, da molekylære chaperoner er energiafhængige3. Disse kræver en konstant og dynamisk netværksmodulering og tilpasning for effektivt at imødekomme cellulære behov, og mitokondrietransport reguleres af forskellige signalveje; Tidligere arbejde har beskrevet en sådan vej, nemlig retinsyrereceptorer (RAR'er)4,5. Retinsyre (RA) fremmer aksonal og neurit udvækst via RAR aktivering. I mus primære kortikale neuroner, aktivering af RAR-β fremmer mitokondriel vækst, hastighed, og mobilitet i neurit6.
I betragtning af mitokondrienetværkets tilpasningsevne og dynamik er muligheden for at vurdere mitostase i "realtid" afgørende ikke kun for at undersøge energihomeostase, men også for proteostase, cellulær sundhed, spredning eller signalering. En almindeligt anvendt metode til evaluering af mitostase er afhængig af konfokal mikroskopi efter fremhævning af mitokondrier ved anvendelse af et fluorescerende farvestof eller markør samt en specifik mikroskopiopsætning, der tillader temperatur og / eller CO2 -regulering7. Denne type eksperimentel opsætning indebærer, at der udføres én eksperimentel replikat ad gangen. Ud over eksperimentel gentagelse af forskellige behandlinger bør det overvejes, at de fleste eksperimenter bør have deres tekniske replikater (hvor mere end en position er afbildet pr. Plade), hvor en række brændplaner (z-stakke) registreres i en række tidspunkter. Således resulterer et eksperimentelt design med tre gentagelser af en kontrol og to behandlinger med fem billeddannelsespositioner pr. plade og 15 tidspunkter i 225 stakke, der skal behandles. Klassisk blev videoer af levende mitokondrier analyseret ved at plotte kymografer, som ville blive analyseret individuelt8, i en tidskrævende proces, der kræver omfattende manuel input, selv når man stoler på computerværktøjer.
En algoritme blev for nylig beskrevet9 , der tillader automatiseret segmentering og sporing af mitokondrier i live-celle 2-D og 3-D time-lapse filer. Andre kvantificeringsteknikker er tilgængelige, og alle har deres begrænsninger10. Mitometer, en automatiseret open source-applikation, er især velegnet til time lapse og mitokondriedynamikanalyse, der kræver lavt brugerinput. Denne applikation har en række fordele i forhold til andre eksisterende MATLAB-baserede værktøjer, nemlig at tillade automatisk behandling af individuelle TIF-stakke ved hjælp af op til 13 forskellige parametre, især interessante for neurovidenskab, da den skelner mellem peri- og telenukleare mitokondrier.
For et eksperiment som det ovenfor beskrevne resulterer disse 13 parametre anvendt på 225 stakke imidlertid i 2.925 individuelle outputfiler. Disse kræver fire individuelle computerindgange, som tilsammen giver over 10.000 manuelle indgange, der kræves for at downloade alle outputfiler. For store eksperimentelle designs resulterer dette i en unødvendig ekstremt tidskrævende analyse af hver fil og dataintegration. Heri præsenterer vi en rutineoptimering, der muliggør hurtig filanalyse, hvilket i høj grad reducerer dokumentlæsning og databehandling, analyserer data på en defineret måde i overensstemmelse med output fra eksisterende værktøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol har to hovedtrin: et vådt laboratorietrin, der involverer cellekultur og levende konfokalmikroskopi for at få billeder af levende mitokondrier (figur 1) og et in silico-trin for at analysere opnåede billeder (figur 2). Til automatiseret dataanalyse af 3D live imaged mitokondrier blev MATLAB-applikationen Mitometer brugt som leveret af Lefebvre et al.9. Rutineoptimeringen er skrevet i MATLAB. Softwaren, opdaterede versioner og behandling af ImageJ-makroer er frit tilgængelige online via GitHub, på https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. Levende mikroskopi
Figur 1: Eksperimentel protokol. SH-SY5Y-celler blev differentieret og behandlet med retinoider. (A) TMRM blev brugt til at levende billede sunde mitokondrier i behandlede celler ved hjælp af et konfokalmikroskop, der fangede en time lapse z-stak af fem synsfelter. (B) Mitometer-applikation MATLAB segmenterer og analyserer automatisk mitokondriebilleder. Ud over at analysere diskriminerer denne software automatisk mitokondrier i henhold til nuklear nærhed. Blå prikker er mitokondrie startpositioner; Røde prikker er endelige positioner. Skalabjælke = 30 μm. Forkortelse: TMRM = tetramethylrhodamin, methylester. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Cellekultur
- SH-SY5Y-celler inkuberes ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5 % CO2 og 95 % luft, dyrket i lige dele MEM (Minimal Essential Medium) og F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, suppleret med 10 % føtalt bovint serum (FBS).
- Plade SH-SY5Y-celler i glasbundede celleskåle med en densitet på 15 × 104 celler / ml.
- Differentier celler med 5 dages behandling med 10 μM all-trans retinsyre i 1% FBS-holdigt dyrkningsmedium efterfulgt af 2 dages behandling med 10 ƞg/ml hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF).
- Cellebehandling
- Celler vaskes med sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) og behandles i 72 timer med 10-7 M RAR-isoformagonister i lige dele MEM (Minimal Essential Medium) og F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, suppleret med 1% FBS.
BEMÆRK: Den anvendte RARα-agonist var AM580; RARβ agonist anvendt var CD2314; Ch55 blev brugt som agonist som RARα og β co-agonist; vedRA blev anvendt som en positiv kontrol; BMS493 blev brugt som en RAR pan-antagonist.
- Celler vaskes med sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) og behandles i 72 timer med 10-7 M RAR-isoformagonister i lige dele MEM (Minimal Essential Medium) og F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, suppleret med 1% FBS.
- Live konfokal billeddannelse
- Udskift dyrkningsmediet med frisk 1% FBS-holdigt dyrkningsmedium med 20 nM tetramethylrhodamin, methylester (TMRM) i 45 min.
BEMÆRK: TMRM er et celleperment fluorescerende farvestof, sekvestreret af aktive mitokondrier, og denne inkubationsperiode gør det muligt for TMRM at nå en ligevægt og blive optaget af polariserede mitokondrier11. Billeddannelse bør startes, før ligevægt er etableret, da TMRM-signalintensiteten kunstigt kan øges under billeddannelse. - Cellerne anbringes i en inkubator, der er fastgjort til et laserscanningskonfokalmikroskop ved 37 °C.
- Tag billeder ved hjælp af et 63x apochromat-mål med en billedstørrelse på 512 x 512 pixels opnået med en pinhole-blænde på 1 luftig enhed, der fanger en tidsserie på 15 billeder fra fem forskellige synsfelter i hver celleplade og en z-stak med 8 lige store z-planer. Den resulterende .lsm-fil er en tids-, positions- og z-stak.
BEMÆRK: Indstillinger for forstærkning, kontrast og lysstyrke skal først optimeres ved hjælp af den minimale lasereffekt, der er nødvendig for at bruge hele detektorens dynamiske område, og holdes konstant under hele undersøgelsen, hvilket sikrer, at al billeddannelse udføres under de samme betingelser. Op til ni forskellige positioner kan registreres i denne hardware-software-kombination, og mikroskopet cykler automatisk mellem billedpositioner.
- Udskift dyrkningsmediet med frisk 1% FBS-holdigt dyrkningsmedium med 20 nM tetramethylrhodamin, methylester (TMRM) i 45 min.
2. Billedanalyse
Figur 2: Rutineoptimering. (A) Repræsentativ kode for rutineoptimeringen. (b) Rutinemæssig optimering Live-Script. (C) Rutinemæssig optimering workflow. (D) Rutinemæssig optimering resultat validering: repræsentativt billede af mitokondrier i ubehandlede celler (venstre panel), behandlet medRA (10-7 M, 72 timer, midterste panel), og behandlet med RAR antagonist BMS493 (10-7 M, 72 timer, højre panel), afbildet efter inkubation med TMRM (20 nM, 45 min inkubation). Skalabjælke = 30 μm. (E) TMRM-intensitet i mitokondrier i cellelegemer. Signifikant fald ved behandling med all-trans retinsyre (vedleddegigt, 10-7 M, 72 timer) sammenlignet med kontrol (p=0,0062), ikke observeret ved behandling med RAR-antagonist (BMS493, 10-7 M, 72 timer). Fem celler blev kvantificeret fra hver af tre gentagelser pr. Tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Billedbehandling
- Åbn filer i ImageJ 2.1.0, og adskil positionstakke efter synsfelt: Åbn ImageJ, og klik på Menulinje | Billede | Duplikat | Input slices/rammenummer | OK.
BEMÆRK: For at reducere gentagne input til softwaren blev der udviklet en ImageJ-makro for at lette duplikering og lagring af visuelle feltbilleder.
- Åbn filer i ImageJ 2.1.0, og adskil positionstakke efter synsfelt: Åbn ImageJ, og klik på Menulinje | Billede | Duplikat | Input slices/rammenummer | OK.
- Makroprotokol
- Tegn et interesseområde (ROI) rundt om cellen med værktøjet til fri markering.
- Afspil makroen ved at åbne ImageJ og navigere til menulinjen | Plugins | Makroer | Kør Ryd baggrunden og gem billeder makro.
BEMÆRK: Billeder kan randomiseres i denne proces og gemme løsningsnøglen i henhold til optimeringskravene. - Bestem pixelstørrelse og voxeldybde: Åbn ImageJ | billedet, og naviger til menulinjen | Billede | Egenskaber.
- Alternativ direkte protokol
BEMÆRK: Dette alternativ bruger ikke makro til at behandle billeder- Find pixelstørrelse og voxeldybde: Åbn ImageJ | Åbn Billede , og naviger til menulinjen | Billede | Egenskaber.
- Tegn et investeringsafkast rundt om cellen med værktøjet til fri markering, og sørg for, at det omfatter hele cellen gennem de 15 rammer.
- Naviger til menulinjen | Rediger | Ryd udenfor.
- Naviger til menulinjen | Fil | Gem som | Vælg Tiff.
- Vælg Gem mappe, og klik på Gem.
BEMÆRK: Billeder kan blindes / randomiseres manuelt på dette tidspunkt, før du fortsætter til analysen.
- Automatiseret billedanalyse
- Forbered mapperne til analysefiler.
- Opret tre hovedmapper med titlen "Alle spor", "Perinukleare spor" og "Telenukleare spor".
BEMÆRK: Disse matcher de vigtigste automatiserede sporindstillinger. - I hver hovedmappe skal du oprette en undermappe for hvert billede, der skal behandles, identificeret numerisk fra 1 og opefter.
- Tilføj en kopi af de to supplerende rutineoptimeringsfiler (mitometer2table.m og getTXTfiles.m) til hver billedmappe.
BEMÆRK: Disse filer hjælper med dataanalyse og endeligt formatarrangement. Antallet af mapper skal svare til antallet af elementer i det randomiserede regneark (.xlsx). Når du har oprettet alle nummererede undermapper med supplerende filer til ét datasæt, kan de batchkopieres og indsættes i de resterende datasæt.
- Opret tre hovedmapper med titlen "Alle spor", "Perinukleare spor" og "Telenukleare spor".
- Forbered mapperne til analysefiler.
- Brug MATLAB-applikationen Mitometer til at analysere billeder.
BEMÆRK: Denne protokol blev kørt på et mitometer, installeret på MATLAB R2022a. Indlæs billeder i batches på 30 for optimal tidskørsel og outputbalance. Maksimal MAT-filstørrelse pålægges af det oprindelige filsystem: Som standard kan "gem" -operationer oprette en fil < 231 bytes (~ 2 GB); gem format MAT-Files Version 7.3 kan bruges i stedet, da det tillader maksimale variable størrelser større end 2 GB.- Identificer/ændr standard MAT-filversionen: På fanen Hjem i afsnittet Miljø skal du klikke på Indstillinger og vælge MATLAB | Generelt | MAT-filer.
- Brug MATLAB-værktøjet Mitometer til at analysere: Åbn MATLAB, og naviger til menulinjen | APPS | Åben mitometer | Vælg Start 3D | Inputdata (pixelstørrelse (μm): 0,1395089/Tid mellem billeder (er): 2/Antal z-planer: 8/Aksial afstand mellem z-planer (μm): 0,418809 | Vælg billeder, der skal indtastes.
- Gå til Mitometer Side Menu, vælg Billede, klik på Vælg fremhævet, naviger til mitometer Menulinje | Vælg spor | Spor visninger | vælg All-Tracks, Telenuclear eller Perinuclear | mitometer menulinje | Vælg analyse | Vælg et element (dvs. længde) | vælg Gem til ".txt".
BEMÆRK: Mere end én parameter kan downloades ad gangen, hvis den vælges samtidigt. - Uddrag resultatfiler til de oprettede mapper (2.2.1).
- Rutineoptimering og dataanalyse
- Forberede/tilpasse filen "Randomization.xlsx", der indeholder nøglen til billedkodning.
- Indsæt en liste over fortløbende heltal fra 1 og opefter i kolonne A.
BEMÆRK: Det tilrådes at beholde en duplikeret mappe med oprindeligt navngivne billeder. - Placer de analytiske variabler i kolonne B, der består af alfanumeriske tegn.
BEMÆRK: Antallet af linjer i dokumentet skal stemme overens med antallet af mapper, der findes i hoveddatasættet. Kopiér og indsæt denne "Randomization.xlsx"-fil i de to andre hoveddatasæt.
- Indsæt en liste over fortløbende heltal fra 1 og opefter i kolonne A.
- Optimeret dataanalyse
- Dobbeltklik på "executable.mlx", indtast antallet af mapper, angiv mapperne mappe (kopier mappen fra toppen af mappen) | gemme mappe (kopiere mappen fra toppen af mappen) | regnearket navn i outputfilen og klik Kør.
- Udfør statistisk analyse efter behov.
BEMÆRK: Valgfri oprettelse af en .xlsx fil i hver mappe med .txt data- og lydalarm til slutningen af analysen kan vælges. Live Script udsender en enkelt regnearksfil i tabelformat. I dette output repræsenterer kolonner analyserede parametre (f.eks . "Major Axis Length"; "Intensitet") og linjer repræsenterer visuelle felter af analytiske variabler (f.eks. "Kontrol").
- Forberede/tilpasse filen "Randomization.xlsx", der indeholder nøglen til billedkodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at forbedre og fremskynde analysen af outputfiler i .txt format blev der kodet en rutineoptimering, der læser data i overensstemmelse med Mitometer- .txt outputfiler, med kolonner, der repræsenterer en ramme og linjer, der repræsenterer identificerede mitokondrier. Den rutinemæssige optimering producerer data i en enkelt værdi pr. parameter ved at beregne gennemsnittet af rammerne for hver identificeret mitokondrie og derefter beregne gennemsnittet af resultaterne af alle mitokondrier pr. synsfelt. Den udviklede rutine læser filer fra mapper nummereret fra 1 og opefter. Live Script Routine Optimization udsender en enkelt regnearksfil i tabelformat. I dette output repræsenterer kolonner analyserede parametre (f.eks . "Major Axis Length"; "Intensitet") og linjer repræsenterer visuelle felter af analytiske variabler (f.eks . "Kontrol").
Tidligere offentliggjorte resultater beskriver mitokondriemembranpotentiale i cellekroppen af primære neuronale kulturer for at falde og aksonal mitokondriebevægelse for at stige efterRAR-β aktivering6.
Lignende behandlinger blev udført i differentierede neuroblastom SH-SY5Y-celler, behandlet med retinsyrereceptoragonister og antagonister i 72 timer (figur 3). Indsamlede data blev plottet og analyseret ved hjælp af ikke-retningsbestemt, 2-halet, 2-prøve, lige varians Student's t-test. Der blev foretaget sammenligninger i outputregnearksfilen mellem relevante grupper med α = 0,05.
Figur 3: Regulering af mitokondriehomeostase ved isoformspecifik retinoidsignalering. (A) Repræsentativt billede af mitokondrier efter behandling (øverst), respektive overfladeplot (midten) og automatiseret segmentering (nederst). Blå prikker er mitokondrie startpositioner; Røde prikker er endelige positioner. Skalastænger = 30 μm. (B) Heatmap, der opsummerer alle variationer, der findes i mitokondrieparametre; Signifikant varians blev fundet mellem cellekroppen og neurit (tovejs ANOVA, p = 0,0158) med signifikant indflydelse af RAR isoform-specifik modulation i alle mitokondrier (tovejs ANOVA, p = 0,0082). (C) Mitokondrielængde - et signifikant fald blev observeret i celler behandlet med AM580 (p = 0,0179). (D) Mitokondrieoverfladeareal - signifikante fald blev observeret i celler behandlet med AM580 (p = 0,000406) og med BMS493 (p = 3,01 × 10-8). (E) TMRM-intensitet, normaliseret for mitokondrievolumen - signifikante fald blev fundet i celler behandlet med RA (p = 0,00621) og Ch55 (p = 0,000542). * p < 0,05; ** p < 0,01; # p < 0,0001. Fem celler blev kvantificeret fra hver af tre gentagelser pr. Tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Analyse afslører, at behandling af differentierede SH-SY5Y-celler med RAR α-agonist AM580 resulterer i et fald i gennemsnitlig mitokondrielængde og overfladeareal; Denne effekt blev ikke fundet ved behandling med agonister for andre isoformer end udelukkendeRAR-α, men der var et interessant fald på 35,42 ± 0,5% i mitokondrieoverfladearealet efter behandling med RAR pan-antagonist BMS493 (p = 3,01 x 10-8). I modsætning hertil synes retinoider at have en modsat virkning med hensyn til TMRM-intensitet, som vedrører mitokondriemembranpolarisering11: mens behandling med RAR-α-agonist ikke synes at have en signifikant effekt i TMRM-intensitet, resulterer behandling med RAR-panagonist vedRA i et dramatisk fald på 54,82 ± 18,01% (p = 0,00621). Dette fald findes også efter behandling med RARα/β agonist CH55 (28,99 ± 4,97% fald, p=0,000542), og muligvis også efter behandling med RARβ specifik agonist CD2314 (37,01 ± 28,96% fald, p=0,09134). Det er vigtigt, at denne metode differentierede mellem aksonale mitokondrier og dem i cellelegemet, hvilket tillod undersøgelse af isoformspecifik RAR-stimulus og mitokondriemodulering.
Figur 4: Minimal fotoblegning i hele billedbehandlingsprotokollen. (A) Z-stack timelapses blev behandlet i FIJI, og z-projektfremskrivninger af gennemsnitlige intensiteter blev eksporteret for alle tidspunkter. (B) En z-akseprofil af samme behandling blev plottet efter tid. C) Kvantificering af fotoblegning med henblik på forsøgsopstilling. Der blev ikke observeret signifikante ændringer (p = 0,7607; parret t-test for første og sidste billedes gennemsnitlige signalintensitet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live cellebilleddannelse producerer store filer, der kræver seriøs databehandling, men selv de nyeste værktøjer kræver omfattende manuel input for at behandle. Denne rutinemæssige optimering er fokuseret på at forenkle processen med mitokondrieanalyse på Mitometeret, fordi dette værktøj præsenterer en meget god balance mellem brugerinput og dataoutput. En omfattende sammenligning mellem forskellige værktøjer til mitokondriebilledanalyse er tidligere blevet gennemgået10. Mens andre rørledninger er mere fokuseret på at analysere mitokondrienetværk og klyngemasse eller analysere membranpotentialevariation, tillader denne nye metode her præsenteret hurtig og valideret karakterisering af helcellemitokondrienetværk, hvilket også giver mulighed for differentiering mellem axon- og cellelegememitokondrier, en væsentlig funktion at anvende inden for neurovidenskabsområdet.
MATLAB-applikationen Mitometer9 analyserer mitokondrier i billedserier: diffus baggrund trækkes fra hver tidsramme og z-plan i serien, som derefter vikles med en gaussisk kerne for at eliminere højfrekvent støj efterfulgt af en intensitetstærskel, der resulterer i en maske af de segmenterede mitokondrier. De ideelle indstillinger maksimerer medianantallet af identificerede mitokondrier, samtidig med at udsvingene i mitokondriernes antal og areal minimeres på tværs af tilstødende tidsmæssige rammer i billedet, hvor et mitokondrie tildeles dets spor fra det forrige billede til translationel bevægelse.
Differentierede SH-SY5Y-celler blev anvendt som en neuronal model til eksperimentel validering af rutineoptimeringen. Denne humane cellelinje er en homogen neuroblastlignende cellelinje, der udtrykker flere neuronallignende træk, såsom enzymaktivitet, receptorer eller neurofilamenter, der let spredes i kultur. Denne model gør det muligt at eksperimentere med celler fra mennesker uden de dermed forbundne etiske betænkeligheder og med meget lavere omkostninger end ved brug af primære kulturer12. Udifferentieret SH-SY5Y er proliferativ med korte processer; differentiering af disse celler med sekventiel retinsyre og BDNF-behandling stopper spredning og fremmer neuriteforlængelse, hvilket giver en nyttig in vitro neuronal model13.
All-trans retinsyre (10-7 M) blev anvendt som en pan-RAR agonist; AM580 (10-7 M) er en RARα agonist; CD2314 (10-7 M) er en RARβ agonist; Ch55 (10-7 M) er en RARα og RARβ agonist; BMS493 (10-7 M) er en RAR pan-antagonist og blev brugt som farmakologisk kontrol. Denne metode blev valideret ved hjælp af en lignende model, der for nylig er blevet beskrevet: aktiveringen af RAR i neuronale celler regulerer mitokondrier homeostase i neuronen6. Tilsvarende er resultater opnået ved hjælp af denne optimerede rutine i overensstemmelse med litteraturen og viser signifikant ændring i flere mitokondrieparametre (mitokondrielængde, overfladeareal og mitokondrimembranpotentiale), der adskiller mitokondrier i neuritten fra dem i cellelegemet (figur 3). Mitometer kan automatisk identificere og adskille mitokondrier i henhold til afstanden fra kernen (figur 1). Dette er en funktion fra den oprindelige applikation9 og blev brugt som den er.
Denne optimering muliggjorde hurtig behandling af billedfiler, hvilket reducerede operatørinput, dokumentlæsning, databehandling betydeligt (til en hastighed på 100 filer pr. minut), reducerede bias og øgede eksperimentel blinding. Med denne eksperimentelle opsætning tager hver af rammerne cirka 1 min at gennemføre en cyklus; kortere intervaller kan opnås ved at mindske antallet af fangede z-planer (muligvis ledsaget af stigende pinhole blænde) eller antallet af synsfelter; Længere intervaller kan opnås ved at vælge en forsinkelsesperiode, før den registreres.
En eksperimentel opsætning af fem positioner med 8 z-planer og 15 billeder tager ca. 19 minutter pr. cellekulturskål, hvilket resulterer i minimal fotoblegning (figur 4). Den vigtigste eksperimentelle begrænsning med mitokondrier levende billeddannelse er at finde balancen mellem nok sammenløb til, at celler er sunde og sparsomhed til at tillade at skelne mellem celler og især neuritter. Hvis celler er belagt for sammenflydende i glasbundsskålene, resulterer deres spredning under differentieringsprocessen i overlappende celler og dannelsen af neuritnetværk, vanskeligheder med at afbilde individuelle celler og neuritter og identificere transportretning, forvirrende mitokondrienetværkskortlægning. Med hensyn til behandling har MATLAB ikke den samme beregningskraft som andre sprog, såsom Python, men MATLAB er særlig god til signalbehandling, hvilket gør den ideel til mitokondrierbilleddannelseseksperimenter.
Denne protokol tillader også billeddannelse før og efter akut behandling med en flydende opløsning. For at gøre dette skal mikroskopets inkubationskammer åbnes omhyggeligt for at give adgang til glasbundskålen til behandlingsapplikation. Dette fungerer bedst med større mængder (>100 μL), da turbulensbehandlingsapplikationen kan fordele den gennem hele præparatet, mens mindre volumener ville kræve omrøring af præparatet, muligvis skifte orientering i forhold til målet/pladeholderen. Hvis der ikke forekommer en sådan afdrift, vil de positioner, der registreres i softwaren, vedrøre de samme celler, der er afbildet før behandlingen, og en ny billeddannelsessløjfe kan startes. Det skal dog overvejes, at denne variation vil øge fotoblegningen, og der skal indgås kompromiser i den indledende laserintensitet. Desuden kan den samme protokol anvendes på andre cellulære modeller, såsom neuronale primære kulturer6 eller endda andre typer celler14, men det ville kræve optimering af mikroskopisektionen, hvis der blev afbildet flere mobile celler eller i længere billeddannelsesperioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Billedoptagelse blev udført i LiM-faciliteten hos iBiMED, en node i PPBI (Portuguese Platform of BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dette arbejde blev støttet af FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), et tilskud til DT fra Fundação para a Ciência e Tecnologia under Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), et tilskud fra ATG-The Gabba Alumni Association til VP og Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
