Summary
Het mitochondriale netwerk is uiterst complex, waardoor het zeer uitdagend is om te analyseren. Een nieuwe MATLAB-tool analyseert live confocale mitochondriën in timelapse-beelden, maar resulteert in een groot uitvoervolume dat individuele handmatige aandacht vereist. Om dit probleem aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is.
Abstract
Het complexe mitochondriale netwerk maakt het zeer uitdagend om levende cellen te segmenteren, te volgen en te analyseren. MATLAB-tools maken de analyse van mitochondriën in timelapse-bestanden mogelijk, waardoor het proces van beeldverwerking aanzienlijk wordt vereenvoudigd en versneld. Desalniettemin produceren bestaande tools een groot uitvoervolume, dat individuele handmatige aandacht vereist, en experimentele basisopstellingen hebben een uitvoer van duizenden bestanden, die elk een uitgebreide en tijdrovende verwerking vereisen.
Om deze problemen aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, zowel in MATLAB-code als in live-script-vormen, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is en het lezen en verwerken van documenten aanzienlijk wordt verminderd. Met een snelheid van 100 bestanden/min maakt de optimalisatie een algehele snelle analyse mogelijk. De optimalisatie bereikt de resultaten door het gemiddelde te nemen van framespecifieke gegevens voor individuele mitochondriën gedurende tijdsbestekken, waarbij gegevens op een gedefinieerde manier worden geanalyseerd, consistent met die uitvoer van bestaande tools. Live confocale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de kleurstof tetramethylrhodaminemethylester, en de routinematige optimalisatie werd gevalideerd door neuronale cellen te behandelen met retinoïnezuurreceptor (RAR)-agonisten, waarvan de effecten op neuronale mitochondriën in de literatuur zijn vastgesteld. De resultaten waren consistent met de literatuur en maakten verdere karakterisering van het gedrag van mitochondriale netwerken mogelijk als reactie op isovormspecifieke RAR-modulatie.
Deze nieuwe methodologie maakte een snelle en gevalideerde karakterisering van het mitochondriënnetwerk van hele neuronen mogelijk, maar het maakt ook differentiatie mogelijk tussen axon- en cellichaammitochondriën, een essentieel kenmerk om toe te passen op het gebied van neurowetenschappen. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op experimenten met snelwerkende behandelingen, waardoor dezelfde cellen voor en na behandelingen kunnen worden afgebeeld, wat het gebied van de neurowetenschappen overstijgt.
Introduction
Cellulaire mitochondriën bevinden zich in het centrum van alle fysiologische toestanden, en een grondig begrip van hun homeostase (mitostase) en gedrag is van het grootste belang om te helpen bij het identificeren van farmacologische behandeling voor een breed scala aan ziekten, waaronder kanker en de ziekte van Alzheimer 1,2.
Mitochondriën spelen een cruciale cellulaire rol bij energiehomeostase, ATP-generatie, calciumbuffering en ROS-regulatie, en mitostase is essentieel voor het handhaven van eiwithomeostase, aangezien moleculaire chaperonnes energieafhankelijk zijn3. Deze vereisen een constante en dynamische netwerkmodulatie en -aanpassing om efficiënt aan de cellulaire behoeften te voldoen, en het transport van mitochondriën wordt gereguleerd door verschillende signaalroutes; Eerder werk heeft zo'n route beschreven, die van retinoïnezuurreceptoren (RAR's)4,5. Retinoïnezuur (RA) bevordert axonale en neurietuitgroei via RAR-activering. In primaire corticale neuronen van muizen stimuleert activering van RAR-β mitochondriale groei, snelheid en mobiliteit in de neuriet6.
Gezien het aanpassingsvermogen en de dynamiek van het mitochondriale netwerk, is de mogelijkheid om mitostase in "realtime" te beoordelen essentieel, niet alleen voor het onderzoeken van energiehomeostase, maar ook voor proteostase, cellulaire gezondheid, proliferatie of signalering. Een veelgebruikte methode voor het evalueren van mitostase is gebaseerd op confocale microscopie na het markeren van mitochondriën met behulp van een fluorescerende kleurstof of marker, evenals een specifieke microscopie-opstelling die temperatuur- en/of CO2 -regulatie mogelijkmaakt 7. Dit type experimentele opstelling houdt in dat één experimentele replicatie tegelijk wordt uitgevoerd. Naast experimentele herhaling van verschillende behandelingen, moet er rekening mee worden gehouden dat de meeste experimenten hun technische replica's moeten hebben (waarbij meer dan één positie per plaat wordt afgebeeld), waarbij een reeks brandpuntsvlakken (z-stacks) wordt geregistreerd in een reeks tijdstippen. Een experimenteel ontwerp met drie herhalingen van één controle en twee behandelingen, met vijf beeldvormingsposities per plaat en 15 tijdstippen, resulteert dus in 225 te verwerken stapels. Klassiek werden video's van levende mitochondriën geanalyseerd door kymografen uit te zetten, die individueel zouden worden geanalyseerd8, in een tijdrovend proces dat uitgebreide handmatige invoer vereiste, zelfs wanneer men vertrouwde op computerhulpmiddelen.
Onlangs is een algoritme beschreven9 dat geautomatiseerde segmentatie en tracking van mitochondriën in live-cell 2D- en 3D-time-lapse-bestanden mogelijk maakt. Er zijn andere kwantificeringstechnieken beschikbaar, die allemaal hun beperkingen hebben10. Mitometer, een geautomatiseerde open-source applicatie, is met name geschikt voor time-lapse en analyse van de dynamiek van mitochondriën, waarvoor een lage gebruikersinput nodig is. Deze toepassing heeft een reeks voordelen ten opzichte van andere bestaande MATLAB-gebaseerde tools, namelijk het mogelijk maken van de automatische verwerking van individuele TIF-stacks, met behulp van maximaal 13 verschillende parameters, vooral interessant voor neurowetenschappen, omdat het onderscheid maakt tussen peri- en telenucleaire mitochondriën.
Voor een experiment zoals hierboven beschreven, resulteren deze 13 parameters toegepast op 225 stapels echter in 2.925 individuele uitvoerbestanden. Deze vereisen vier afzonderlijke computerinvoer, wat neerkomt op meer dan 10.000 handmatige invoer die nodig is om alle uitvoerbestanden te downloaden. Voor grote experimentele ontwerpen resulteert dit in een onnodig extreem tijdrovende analyse van elk bestand en data-integratie. Hierin presenteren we een routinematige optimalisatie die een snelle bestandsanalyse mogelijk maakt, het lezen en verwerken van documenten aanzienlijk vermindert, en gegevens op een gedefinieerde manier analyseert, consistent met de output van bestaande tools.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol bestaat uit twee hoofdstappen: een natte laboratoriumstap, waarbij celkweek en levende confocale microscopie worden gebruikt om beelden van levende mitochondriën te verkrijgen (Figuur 1) en een in silico-stap om verkregen beelden te analyseren (Figuur 2). Voor geautomatiseerde data-analyse van 3D live gebeelde mitochondriën werd de MATLAB-applicatie Mitometer gebruikt zoals geleverd door Lefebvre et al.9. De Routine optimalisatie is geschreven in MATLAB. De software, bijgewerkte versies en verwerking van ImageJ-macro's zijn gratis online beschikbaar via GitHub, op https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. Levende microscopie
Figuur 1: Experimenteel protocol. SH-SY5Y-cellen werden gedifferentieerd en behandeld met retinoïden. (A) TMRM werd gebruikt om gezonde mitochondriën in behandelde cellen live in beeld te brengen met behulp van een confocale microscoop, waarbij een time-lapse z-stack van vijf gezichtsvelden werd vastgelegd. (B) Mitometertoepassing MATLAB segmenteert en analyseert automatisch mitochondriënbeelden. Naast het analyseren discrimineert deze software automatisch mitochondriën op basis van nucleaire nabijheid. Blauwe stippen zijn mitochondriale beginposities; Rode stippen zijn eindposities. Schaalbalk = 30 μm. Afkorting: TMRM = tetramethylrhodamine, methylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Celkweek
- Incubeer SH-SY5Y-cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht, gekweekt in gelijke delen MEM (Minimal Essential Medium) en F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Plaat SH-SY5Y-cellen in celschalen met glazen bodem met een dichtheid van 15 × 104 cellen/ml.
- Differentieer cellen met 5 dagen behandeling met 10 μM all-trans-retinoïnezuur in 1% FBS-bevattend kweekmedium, gevolgd door 2 dagen behandeling met 10 ƞg/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
- Celbehandeling
- Was de cellen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en behandel gedurende 72 uur met 10-7 M RAR-isovormagonisten, in gelijke delen MEM (Minimal Essential Medium) en F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, aangevuld met 1% FBS.
OPMERKING: De gebruikte RARα-agonist was AM580; De gebruikte RARβ-agonist was CD2314; Ch55 werd gebruikt als agonist als RARα en β co-agonist; opRA werd gebruikt als positieve controle; BMS493 werd gebruikt als een RAR-pan-antagonist.
- Was de cellen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en behandel gedurende 72 uur met 10-7 M RAR-isovormagonisten, in gelijke delen MEM (Minimal Essential Medium) en F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, aangevuld met 1% FBS.
- Live confocale beeldvorming
- Vervang het kweekmedium door vers 1% FBS-bevattend kweekmedium met 20 nM tetramethylrhodamine, methylester (TMRM) gedurende 45 min.
OPMERKING: TMRM is een celgepermeaneerde fluorescerende kleurstof, afgezonderd door actieve mitochondriën, en deze incubatietijd stelt TMRM in staat een evenwicht te bereiken en te worden opgenomen door gepolariseerde mitochondriën11. Beeldvorming moet worden gestart voordat het evenwicht is bereikt, aangezien de intensiteit van het TMRM-signaal tijdens beeldvorming kunstmatig kan toenemen. - Plaats de cellen in een incubator die is bevestigd aan een confocale microscoop met laserscanning bij 37 °C.
- Leg beelden vast met behulp van een 63x olie-immersie apochromaat objectief, met een beeldgrootte van 512 x 512 pixels verkregen met een gaatje diafragma van 1 luchtige eenheid, het vastleggen van een tijdreeks van 15 frames van vijf verschillende gezichtsvelden in elke celplaat, en een z-stack van 8 op gelijke afstand z-vlakken. Het resulterende .lsm-bestand is een tijd-, positie- en z-stack.
NOTITIE: Instellingen voor versterking, contrast en helderheid moeten in eerste instantie worden geoptimaliseerd met behulp van het minimale laservermogen dat nodig is om het volledige dynamische bereik van de detector te gebruiken en gedurende het hele onderzoek constant worden gehouden, zodat alle beeldvorming onder dezelfde omstandigheden wordt uitgevoerd. In deze hardware-softwarecombinatie kunnen maximaal negen verschillende posities worden vastgelegd en de microscoop schakelt automatisch tussen beeldposities.
- Vervang het kweekmedium door vers 1% FBS-bevattend kweekmedium met 20 nM tetramethylrhodamine, methylester (TMRM) gedurende 45 min.
2. Beeldanalyse
Figuur 2: Routinematige optimalisatie. (A) Representatieve code van de routinematige optimalisatie. (B) Routinematige optimalisatie Live-Script. (C) Routinematige optimalisatieworkflow. (D) Validatie van routinematige optimalisatieresultaten: representatief beeld van mitochondriën in onbehandelde cellen (linkerpaneel), behandeld met RA(10-7 M, 72 uur, middelste paneel) en behandeld met RAR-antagonist BMS493 (10-7 M, 72 uur, rechterpaneel), afgebeeld na incubatie met TMRM (20 nM, 45 min incubatie). Schaalbalk = 30 μm. (E) TMRM-intensiteit in de mitochondriën van het cellichaam. Significante afname bij behandeling met all-transretinoïnezuur (bijRA, 10-7 M, 72 uur), vergeleken met de controlegroep (p=0,0062), niet waargenomen bij behandeling met RAR-antagonist (BMS493, 10-7 M, 72 uur). Vijf cellen werden gekwantificeerd van elk van de drie herhalingen per aandoening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Beeldverwerking
- Bestanden openen in ImageJ 2.1.0 en positiestapels scheiden per gezichtsveld: Open ImageJ en klik op Menubalk | Afbeelding | Dupliceren | Invoersegmenten/framenummer | Oké.
OPMERKING: Om het aantal herhaalde invoer in de software te verminderen, is een ImageJ Macro ontwikkeld om het dupliceren en opslaan van gezichtsveldbeelden te vergemakkelijken.
- Bestanden openen in ImageJ 2.1.0 en positiestapels scheiden per gezichtsveld: Open ImageJ en klik op Menubalk | Afbeelding | Dupliceren | Invoersegmenten/framenummer | Oké.
- Macro protocol
- Teken een interessegebied (ROI) rond de cel met het gereedschap voor vrije selectie.
- Voer de macro uit door ImageJ te openen en naar Menubalk | Insteekfilters | Macro's | Voer de macro Achtergrond wissen en afbeeldingen opslaan uit.
OPMERKING: Afbeeldingen kunnen in dit proces worden gerandomiseerd, waarbij de oplossingssleutel wordt opgeslagen volgens de optimalisatievereisten. - Pixelgrootte en voxeldiepte bepalen: Open ImageJ | de afbeelding en navigeer naar Menubalk | Afbeelding | Eigenschappen.
- Alternatief direct protocol
OPMERKING: Dit alternatief maakt geen gebruik van Macro om afbeeldingen te verwerken- Zoek de pixelgrootte en voxeldiepte: Open ImageJ | Open Afbeelding en navigeer naar Menubalk | Afbeelding | Eigenschappen.
- Teken een ROI rond de cel met het gereedschap voor vrije selectie en zorg ervoor dat deze de hele cel gedurende de 15 frames omvat.
- Navigeer naar menubalk | Bewerken | Ruim buiten.
- Navigeer naar menubalk | Bestand | Opslaan als | Selecteer Tiff.
- Selecteer Map opslaan en klik op Opslaan.
OPMERKING: Afbeeldingen kunnen op dit punt handmatig worden geblindeerd/gerandomiseerd voordat ze doorgaan met analyseren.
- Geautomatiseerde beeldanalyse
- Bereid de mappen voor analysebestanden voor.
- Maak drie hoofdmappen, getiteld "Alle sporen", "Perinucleaire sporen" en "Telenucleaire sporen".
OPMERKING: Deze komen overeen met de belangrijkste geautomatiseerde trackopties. - Maak in elke hoofdmap een submap voor elke afbeelding die u wilt verwerken, numeriek geïdentificeerd vanaf 1 en hoger.
- Voeg een kopie van de twee aanvullende routinematige optimalisatiebestanden (mitometer2table.m en getTXTfiles.m) toe aan elke afbeeldingsmap.
OPMERKING: Deze bestanden helpen bij de analyse van de gegevens en de uiteindelijke indeling van het formaat. Het aantal mappen moet overeenkomen met het aantal elementen in de gerandomiseerde spreadsheet (.xlsx). Nadat alle genummerde submappen met aanvullende bestanden voor één gegevensset zijn gemaakt, kunnen ze batchgewijs worden gekopieerd en in de resterende gegevenssets worden geplakt.
- Maak drie hoofdmappen, getiteld "Alle sporen", "Perinucleaire sporen" en "Telenucleaire sporen".
- Bereid de mappen voor analysebestanden voor.
- Gebruik de MATLAB-applicatie Mitometer om afbeeldingen te analyseren.
NOTITIE: Dit protocol is uitgevoerd op een mitometer, geïnstalleerd op MATLAB R2022a. Laad afbeeldingen in batches van 30 voor een optimale tijd- en uitvoerbalans. De maximale MAT-bestandsgrootte wordt opgelegd door het native bestandssysteem: standaard kunnen "save"-bewerkingen een bestand maken < 231 bytes (~2 GB); MAT-bestanden opslaan Versie 7.3 kan in plaats daarvan worden gebruikt, omdat deze maximale variabele groottes van meer dan 2 GB toestaat.- Identificeer/wijzig de standaard versie van het MAT-bestand: Klik op het tabblad Start in de sectie Omgeving op Voorkeuren en selecteer MATLAB | Algemeen | MAT-bestanden.
- Gebruik de MATLAB-tool Mitometer om te analyseren: Open MATLAB en navigeer naar Menubalk | APPS | Mitometer openen | Selecteer 3D starten | Invoergegevens (pixelgrootte (μm): 0,1395089 / Tijd tussen frames (s): 2 / Aantal z-vlakken: 8 / Axiale afstand tussen z-vlakken (μm): 0,418809 | Selecteer de afbeeldingen die u wilt invoeren.
- Ga naar het menu aan de zijkant van de mitometer, selecteer Afbeelding, klik op Gemarkeerd selecteren, navigeer naar de menubalk van de mitometer | Tracks selecteren | Weergaven bijhouden | selecteer All-Tracks, Telenuclear of Perinuclear | mitometer Menubalk | Selecteer Analyse | Kies een element (d.w.z. Lengte) | selecteer Opslaan in ".txt".
OPMERKING: Er kan meer dan één parameter tegelijk worden gedownload, indien gelijktijdig geselecteerd. - Pak resultaatbestanden uit in de aangemaakte mappen (2.2.1).
- Routinematige optimalisatie en data-analyse
- Voorbereiden/aanpassen van het "Randomization.xlsx"-bestand met de sleutel voor beeldcodering.
- Voeg een lijst met opeenvolgende gehele getallen, vanaf 1, in kolom A in.
OPMERKING: Het is raadzaam om een gedupliceerde map te bewaren met afbeeldingen met een oorspronkelijke naam. - Plaats de analytische variabelen in kolom B, bestaande uit alfanumerieke tekens.
OPMERKING: Het aantal regels in het document moet consistent zijn met het aantal mappen dat aanwezig is in de hoofdgegevensset. Kopieer en plak dit "Randomization.xlsx"-bestand in de andere twee hoofdgegevenssets.
- Voeg een lijst met opeenvolgende gehele getallen, vanaf 1, in kolom A in.
- Geoptimaliseerde data-analyse
- Dubbelklik op "executable.mlx", voer het aantal mappen in, specificeer de map mappen (kopieer de map van de bovenkant van de map) | de map opslaan (kopieer de map van de bovenkant van de map) | de naam van de spreadsheet in het uitvoerbestand en klik op Uitvoeren.
- Voer indien nodig statistische analyses uit.
OPMERKING: Optioneel kan het maken van een .xlsx bestand in elke map met de .txt gegevens en een geluidssignaal aan het einde van de analyse worden geselecteerd. Live Script voert één spreadsheetbestand uit in een tabelindeling. In deze uitvoer vertegenwoordigen kolommen geanalyseerde parameters (bijv. "Major Axis Length"; "Intensiteit") en lijnen vertegenwoordigen visuele velden van analytische variabelen (bijv. "Controle").
- Voorbereiden/aanpassen van het "Randomization.xlsx"-bestand met de sleutel voor beeldcodering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de analyse van uitvoerbestanden in .txt formaat te verbeteren en te versnellen, werd een routinematige optimalisatie gecodeerd die gegevens leest die consistent zijn met Mitometer- .txt-uitvoerbestanden, met kolommen die een frame vertegenwoordigen en lijnen die geïdentificeerde mitochondriën vertegenwoordigen. De routinematige optimalisatie produceert gegevens in een enkele waarde per parameter door het gemiddelde te nemen van de frames voor elke geïdentificeerde mitochondriën en vervolgens het gemiddelde te nemen van de resultaten van alle mitochondriën per gezichtsveld. De ontwikkelde routine leest bestanden uit mappen die vanaf 1 zijn genummerd. De Live Script Routine Optimization voert een enkel spreadsheetbestand uit in een tabelindeling. In deze uitvoer vertegenwoordigen kolommen geanalyseerde parameters (bijv. "Major Axis Length"; "Intensiteit") en lijnen vertegenwoordigen visuele velden van analytische variabelen (bijv. "Controle").
Eerder gepubliceerde resultaten beschrijven dat het mitochondriale membraanpotentieel in het cellichaam van primaire neuronale culturen afneemt en dat de beweging van axonale mitochondriën toeneemt na activering van RARβ 6.
Vergelijkbare behandelingen werden uitgevoerd in gedifferentieerde neuroblastoom SH-SY5Y-cellen, behandeld met de retinoïnezuurreceptoragonisten en -antagonisten gedurende 72 uur (Figuur 3). De verzamelde gegevens werden uitgezet en geanalyseerd met behulp van niet-directionele, 2-zijdige, 2-steekproef, gelijke variantie Student's t-toets. In het uitvoerbestand van de spreadsheet werden vergelijkingen gemaakt tussen geschikte groepen, met α = 0,05.
Figuur 3: Regulatie van mitochondriale homeostase door isovorm-specifieke retinoïde signalering. (A) Representatief beeld van mitochondriën na behandeling (boven), respectievelijke oppervlakteplot (midden) en geautomatiseerde segmentatie (onder). Blauwe stippen zijn mitochondriale beginposities; Rode stippen zijn eindposities. Schaalbalken = 30 μm. (B) Heatmap met een samenvatting van alle variaties die zijn gevonden in mitochondriënparameters; Er werd een significante variantie gevonden tussen het cellichaam en neuriet (tweerichtings-ANOVA, p=0,0158), met significante invloed van RAR-isovormspecifieke modulatie in alle mitochondriën (tweerichtings-ANOVA, p=0,0082). (C) Mitochondriale lengte - een significante afname werd waargenomen in cellen die werden behandeld met AM580 (p=0,0179). (D) Mitochondriaal oppervlak - significante dalingen werden waargenomen in cellen behandeld met AM580 (p=0,000406) en met BMS493 (p=3,01 × 10-8). (E) TMRM-intensiteit, genormaliseerd voor mitochondriaal volume - significante dalingen werden gevonden in cellen behandeld met RA (p=0,00621) en Ch55 (p=0,000542). * p < 0,05; ** p < 0,01; # p < 0,0001. Vijf cellen werden gekwantificeerd van elk van de drie herhalingen per aandoening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Analyse toont aan dat behandeling van gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen met RAR α-agonist AM580 resulteert in een afname van de gemiddelde lengte en oppervlakte van mitochondriën; dit effect werd niet gevonden bij behandeling met agonisten voor andere isovormen dan uitsluitend RARα, maar er was een interessante afname van 35,42 ± 0,5% in het mitochondriale oppervlak na behandeling met RAR pan-antagonist BMS493 (p = 3,01 x 10-8). Daarentegen lijken retinoïden een tegengesteld effect te hebben in termen van TMRM-intensiteit, wat verband houdt met de polarisatie van het mitochondriënmembraan11: terwijl behandeling met RAR α-agonist geen significant effect lijkt te hebben op de TMRM-intensiteit, resulteert behandeling met RAR-panagonist bijRA in een dramatische afname van 54,82 ± 18,01% (p=0,00621). Deze afname wordt ook gevonden na behandeling met RARα/β-agonist CH55 (28,99 ± 4,97% afname, p=0,000542), en mogelijk ook na behandeling met RARβ specifieke agonist CD2314 (37,01 ± 28,96% afname, p=0,09134). Belangrijk is dat deze methode onderscheid maakte tussen axonale mitochondriën en die in het cellichaam, waardoor de studie van isovorm-specifieke RAR-stimulus en mitochondriale modulatie mogelijk werd.
Figuur 4: Minimale fotobleking in het hele beeldvormingsprotocol. (A) Z-stack timelapses werden verwerkt in FIJI, en z-projectprojecties van gemiddelde intensiteiten werden geëxporteerd voor alle tijdstippen. (B) Een z-asprofiel van dezelfde verwerking werd uitgezet op basis van de tijd. (C) Kwantificering van fotobleken voor experimentele opstelling. Er werden geen significante veranderingen waargenomen (p = 0,7607; gepaarde t-toets voor de gemiddelde signaalintensiteit van het eerste en laatste frame). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live cell imaging produceert grote bestanden die serieuze computerverwerking vereisen, maar zelfs de meest recente tools vereisen uitgebreide handmatige invoer om te verwerken. Deze routinematige optimalisatie is gericht op het vereenvoudigen van het proces van mitochondriënanalyse op de Mitometer, omdat deze tool een zeer goede balans biedt tussen gebruikersinvoer en gegevensuitvoer. Een uitgebreide vergelijking tussen verschillende tools voor beeldanalyse van mitochondriën is eerder besproken10. Terwijl andere pijplijnen meer gericht zijn op het analyseren van mitochondriënnetwerken en clustermassa of het analyseren van membraanpotentiaalvariatie, maakt deze nieuwe methodologie die hier wordt gepresenteerd een snelle en gevalideerde karakterisering van het mitochondriënnetwerk van hele cellen mogelijk, waardoor ook differentiatie mogelijk is tussen mitochondriën van axonen en cellichamen, een essentieel kenmerk om toe te passen op het gebied van neurowetenschappen.
De MATLAB-applicatie Mitometer9 analyseert mitochondriën in beeldreeksen: diffuse achtergrond wordt afgetrokken van elk tijdsbestek en z-vlak in de reeks, die vervolgens worden samengevoegd met een Gaussiaanse kern om hoogfrequente ruis te elimineren, gevolgd door een intensiteitsdrempel die resulteert in een masker van de gesegmenteerde mitochondriën. De ideale instellingen maximaliseren het mediane aantal geïdentificeerde mitochondriën, terwijl de fluctuatie in het aantal mitochondriën en het gebied over aangrenzende temporele frames van het beeld wordt geminimaliseerd, waarbij een mitochondrion wordt toegewezen aan zijn spoor van het vorige frame voor translatiebeweging.
Gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen werden gebruikt als neuronaal model voor experimentele validatie van de routinematige optimalisatie. Deze menselijke cellijn is een homogene neuroblastachtige cellijn die verschillende neuronale kenmerken tot expressie brengt, zoals enzymactiviteit, receptoren of neurofilamenten, die zich gemakkelijk in cultuur vermenigvuldigt. Dit model maakt het mogelijk om te experimenteren met van mensen afkomstige cellen zonder de bijbehorende ethische bezwaren en met veel lagere kosten dan het gebruik van primaire culturen12. Ongedifferentieerde SH-SY5Y zijn proliferatief, met korte processen; differentiatie van deze cellen met sequentieel retinoïnezuur en BDNF-behandeling stopt de proliferatie en bevordert de verlenging van neurieten, wat een bruikbaar in vitro neuronaal model oplevert13.
All-trans-retinoïnezuur (10-7 M) werd gebruikt als pan-RAR-agonist; AM580 (10-7 M) is een RAR α-agonist; CD2314 (10-7 M) is een RAR β-agonist; Ch55 (10-7 M) is een RAR-α en RARβ-agonist; BMS493 (10-7 M) is een RAR-panantagonist en werd gebruikt als farmacologische controle. Deze methodologie werd gevalideerd met behulp van een soortgelijk model dat onlangs is beschreven: de activering van RAR in neuronale cellen reguleert de homeostase van de mitochondriën in het neuron6. Evenzo zijn de resultaten die zijn verkregen met behulp van deze geoptimaliseerde routine consistent met de literatuur en tonen ze een significante verandering in verschillende mitochondriale parameters (mitochondriënlengte, oppervlakte en mitochondriënmembraanpotentiaal), waarbij mitochondriën in de neuriet worden onderscheiden van die in het cellichaam (Figuur 3). Mitometer kan mitochondriën automatisch identificeren en scheiden op basis van de afstand tot de kern (Figuur 1). Dit is een functie uit de oorspronkelijke applicatie9 en werd gebruikt zoals het is.
Deze optimalisatie maakte een snelle verwerking van beeldvormingsbestanden mogelijk, waardoor de invoer van de operator, het lezen van documenten en gegevensverwerking (tot een snelheid van 100 bestanden per minuut) aanzienlijk werden verminderd, de vooringenomenheid werd verminderd en de experimentele blindering werd verhoogd. Met deze experimentele opstelling duurt elk van de frames ongeveer 1 minuut om een cyclus te voltooien; kortere intervallen kunnen worden verkregen door het aantal vastgelegde Z-vlakken te verminderen (mogelijk vergezeld van een grotere gaatjesopening) of het aantal gezichtsvelden; Langere intervallen kunnen worden bereikt door een vertragingsperiode te selecteren voordat deze wordt vastgelegd.
Een experimentele opstelling van vijf posities met 8 z-vlakken en 15 frames duurt ongeveer 19 minuten per celkweekschaaltje, wat resulteert in minimale fotobleking (Figuur 4). De belangrijkste experimentele beperking met levende beeldvorming van mitochondriën is het vinden van de balans tussen voldoende samenvloeiing om cellen gezond te laten zijn en schaarste om onderscheid te kunnen maken tussen cellen, en in het bijzonder neurieten. Als cellen te veel op elkaar worden geplateerd in de schalen met glazen bodem, resulteert hun proliferatie tijdens het differentiatieproces in overlappende cellen en de vorming van neurietnetwerken, moeilijkheden bij het afbeelden van individuele cellen en neurieten en het identificeren van transportrichting, waardoor het in kaart brengen van mitochondriënnetwerken wordt verward. Qua verwerking heeft MATLAB niet dezelfde rekenkracht als andere talen, zoals Python, maar MATLAB is bijzonder goed in signaalverwerking, waardoor het ideaal is voor beeldvormingsexperimenten met mitochondriën.
Dit protocol maakt ook beeldvorming mogelijk voor en na acute behandeling met een vloeibare oplossing. Om dit te doen, moet de incubatiekamer van de microscoop voorzichtig worden geopend om toegang te geven tot de schotel met glazen bodem voor behandelingstoepassing. Dit werkt het beste met grotere volumes (>100 μL), omdat de turbulentiebehandeling het door het hele preparaat kan verdelen, terwijl kleinere volumes het preparaat moeten roeren, waardoor de oriëntatie ten opzichte van het objectief/de plaathouder mogelijk verschuift. Als een dergelijke drift niet optreedt, hebben de posities die in de software zijn vastgelegd betrekking op dezelfde cellen die vóór de behandeling in beeld zijn gebracht en kan een nieuwe beeldvormingslus worden gestart. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat deze variatie het fotobleken zou verhogen en dat er compromissen moeten worden gesloten in de initiële laserintensiteit. Bovendien kan ditzelfde protocol worden toegepast op andere cellulaire modellen, zoals neuronale primaire culturen6 of zelfs andere soorten cellen14, maar het zou optimalisatie van de microscopiesectie vereisen als meer mobiele cellen worden afgebeeld of voor langere beeldvormingsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De beeldacquisitie werd uitgevoerd in de LiM-faciliteit van iBiMED, een knooppunt van PPBI (Portugees Platform voor BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dit werk werd ondersteund door FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), een subsidie aan DT van de Fundação para a Ciência e Tecnologia van het Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), een subsidie van ATG-The Gabba Alumni Association aan VP, en het Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
