Analyse automatisée optimisée de la modulation de l’homéostasie des mitochondries neuronales vivantes par des récepteurs d’acide rétinoïque spécifiques aux isoformes

Summary

Le réseau mitochondrial est extrêmement complexe, ce qui le rend très difficile à analyser. Un nouvel outil MATLAB analyse les mitochondries confocales en direct dans des images timelapse, mais il en résulte un volume de sortie important nécessitant une attention manuelle individuelle. Pour résoudre ce problème, une optimisation de routine a été développée, permettant une analyse rapide des fichiers.

Abstract

Le réseau mitochondrial complexe rend très difficile la segmentation, le suivi et l’analyse des cellules vivantes. Les outils MATLAB permettent d’analyser les mitochondries dans les fichiers timelapse, ce qui simplifie et accélère considérablement le processus de traitement des images. Néanmoins, les outils existants produisent un grand volume de sortie, nécessitant une attention manuelle individuelle, et les configurations expérimentales de base ont une sortie de milliers de fichiers, chacun nécessitant une manipulation longue et fastidieuse.

Pour résoudre ces problèmes, une optimisation de routine a été développée, à la fois dans le code MATLAB et sous forme de live-script, permettant une analyse rapide des fichiers et réduisant considérablement la lecture des documents et le traitement des données. Avec une vitesse de 100 fichiers/min, l’optimisation permet une analyse globale rapide. L’optimisation permet d’obtenir les résultats obtenus en faisant la moyenne des données spécifiques à l’image pour les mitochondries individuelles sur des périodes de temps, en analysant les données d’une manière définie, cohérente avec les résultats des outils existants. L’imagerie confocale en direct a été réalisée à l’aide de l’ester méthylique de tétraméthylrhodamine, et l’optimisation de routine a été validée en traitant les cellules neuronales avec des agonistes des récepteurs de l’acide rétinoïque (RAR), dont les effets sur les mitochondries neuronales sont établis dans la littérature. Les résultats étaient cohérents avec la littérature et ont permis une caractérisation plus approfondie du comportement du réseau mitochondrial en réponse à la modulation RAR spécifique à l’isoforme.

Cette nouvelle méthodologie a permis une caractérisation rapide et validée du réseau de mitochondries des neurones entiers, mais elle permet également de différencier les mitochondries axonales et cellulaires, une caractéristique essentielle à appliquer dans le domaine des neurosciences. De plus, ce protocole peut être appliqué à des expériences utilisant des traitements à action rapide, permettant l’imagerie des mêmes cellules avant et après les traitements, transcendant le domaine des neurosciences.

Introduction

Les mitochondries cellulaires sont au centre de tous les états physiologiques, et une compréhension approfondie de leur homéostasie (mitostasie) et de leur comportement est primordiale pour aider à identifier le traitement pharmacologique d’un large éventail de maladies, y compris le cancer et la maladie d’Alzheimer ^1,2.

Les mitochondries jouent un rôle cellulaire crucial dans l’homéostasie énergétique, la génération d’ATP, le tampon du calcium et la régulation des ROS, et la mitostasie est essentielle au maintien de l’homéostasie des protéines car les chaperons moléculaires dépendent de l’énergie³. Ceux-ci nécessitent une modulation et une adaptation constantes et dynamiques du réseau pour répondre efficacement aux besoins cellulaires, et le transport des mitochondries est régulé par différentes voies de signalisation ; Des travaux antérieurs ont décrit l’une de ces voies, celle des récepteurs de l’acide rétinoïque (RAR)^4,5. L’acide rétinoïque (AR) favorise la croissance axonale et neurite via l’activation RAR. Dans les neurones corticaux primaires de souris, l’activation de RAR-β favorise la croissance, la vitesse et la mobilité mitochondriales dans le neurite⁶.

Compte tenu de l’adaptabilité et de la dynamique du réseau mitochondrial, la possibilité d’évaluer la mitosstasie en « temps réel » est essentielle non seulement pour étudier l’homéostasie énergétique, mais aussi pour la protéostasie, la santé cellulaire, la prolifération ou la signalisation. Une méthode couramment utilisée pour évaluer la mitostase repose sur la microscopie confocale après mise en évidence des mitochondries à l’aide d’un colorant ou d’un marqueur fluorescent, ainsi que sur un dispositif de microscopie spécifique permettant la régulation de la température et/ou du_CO2 ⁷. Ce type de configuration expérimentale implique qu’une répétition expérimentale soit effectuée à la fois. En plus de la répétition expérimentale de différents traitements, il faut considérer que la plupart des expériences devraient avoir leurs réplicats techniques (où plus d’une position est imagée par plaque), avec une série de plans focaux (z-stacks) enregistrés dans une série de points temporels. Ainsi, un plan expérimental avec trois répétitions d’un contrôle et de deux traitements, avec cinq positions d’imagerie par plaque et 15 points temporels, aboutit à 225 piles à traiter. Classiquement, les vidéos de mitochondries vivantes étaient analysées en traçant des kymographes, qui seraient analysés individuellement⁸, dans un processus long nécessitant une saisie manuelle importante, même en s’appuyant sur des outils informatiques.

Un algorithme a récemment été décrit⁹ qui permet une segmentation et un suivi automatisés des mitochondries dans des fichiers time-lapse 2D et 3D de cellules vivantes. D’autres techniques de quantification sont disponibles, et toutes ont leurs limites¹⁰. Mitometer, une application open source automatisée, est particulièrement adaptée à l’analyse en accéléré et à l’analyse de la dynamique des mitochondries, nécessitant peu d’intervention de l’utilisateur. Cette application présente une série d’avantages par rapport aux autres outils MATLAB existants, à savoir permettre le traitement automatique d’empilements TIF individuels, en utilisant jusqu’à 13 paramètres différents, particulièrement intéressant pour les neurosciences, car elle différencie les mitochondries périnucléaires et télénucléaires.

Cependant, pour une expérience telle que celle décrite ci-dessus, ces 13 paramètres appliqués à 225 piles donnent 2 925 fichiers de sortie individuels. Ceux-ci nécessitent quatre entrées informatiques individuelles, ce qui représente plus de 10 000 entrées manuelles nécessaires pour télécharger tous les fichiers de sortie. Pour les grands plans d’expérience, cela se traduit par une analyse inutilement extrêmement longue de chaque fichier et de l’intégration des données. Nous présentons ici une optimisation de routine qui permet une analyse rapide des fichiers, réduisant considérablement la lecture des documents et le traitement des données, analysant les données de manière définie, cohérente avec les résultats des outils existants.

Protocol

REMARQUE : Ce protocole comporte deux étapes principales : une étape de laboratoire humide, impliquant la culture cellulaire et la microscopie confocale vivante pour obtenir des images de mitochondries vivantes (Figure 1) et une étape in silico pour analyser les images obtenues (Figure 2). Pour l’analyse automatisée des données de mitochondries en 3D en direct, l’application MATLAB Mitometer a été utilisée comme fourni par Lefebvre et ^al.9. L’optimisation de routine est écrite dans MATLAB. Le logiciel, les versions mises à jour et le traitement des macros ImageJ sont disponibles gratuitement en ligne via GitHub, à l’adresse https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.

1. Microscopie en direct

Figure 1 : Protocole expérimental. Les cellules SH-SY5Y ont été différenciées et traitées avec des rétinoïdes. (A) La TMRM a été utilisée pour imager en direct des mitochondries saines dans des cellules traitées à l’aide d’un microscope confocal, capturant une pile z en accéléré de cinq champs visuels. (B) Application de mitométrie MATLAB segmente et analyse automatiquement les images mitochondriales. En plus d’analyser, ce logiciel discrimine automatiquement les mitochondries en fonction de la proximité nucléaire. Les points bleus sont les positions initiales mitochondriales ; Les points rouges sont les positions finales. Barre d’échelle = 30 μm. Abréviation : TMRM = tétraméthylrhodamine, ester méthylique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Culture cellulaire
   1. Incuber les cellules SH-SY5Y à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ et de 95 % d’air, cultivées à parts égales dans des milieux MEM (Minimal Essential Medium) et F12 (Ham F12 Nutrient Mix), complétées par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS).
   2. Plaquez les cellules SH-SY5Y dans des boîtes à cellules à fond de verre à une densité de 15 × 10⁴ cellules/mL.
   3. Différencier les cellules avec 5 jours de traitement avec 10 μM d’acide rétinoïque tout trans dans un milieu de culture contenant 1 % de FBS, suivi de 2 jours de traitement avec 10 ƞg/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF).
2. Traitement cellulaire
   1. Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) et traiter pendant 72 h avec ^10-7 M d’agonistes isoformes RAR, à parts égales de milieu MEM (Minimal Essential Medium) et F12 (mélange nutritif F12 de Ham), complété par 1% de FBS.
      REMARQUE : L’agoniste RARα utilisé était l’AM580 ; L’agoniste RARβ utilisé était le CD2314 ; Le Ch55 a été utilisé comme agoniste comme RARα et β co-agoniste ; àLa PR a été utilisée comme témoin positif ; BMS493 a été utilisé comme pan-antagoniste RAR.
3. Imagerie confocale en direct
   1. Remplacer le milieu de culture par un milieu de culture frais contenant 1 % de FBS avec 20 nM de tétraméthylrhodamine, ester méthylique (TMRM) pendant 45 min.
      REMARQUE : La TMRM est un colorant fluorescent perméable aux cellules, séquestré par les mitochondries actives, et cette période d’incubation permet à la TMRM d’atteindre un équilibre et d’être absorbée par les mitochondries^{polarisées 11}. L’imagerie doit être commencée avant que l’équilibre ne soit établi, car l’intensité du signal TMRM pourrait augmenter artificiellement pendant l’imagerie.
   2. Placez les cellules dans un incubateur relié à un microscope confocal à balayage laser à 37 °C.
   3. Capturez des images à l’aide d’un objectif apochromatique à immersion dans l’huile 63x, avec une taille d’image de 512 x 512 pixels obtenue avec une ouverture sténopé de 1 unité aérienne, capturant une série temporelle de 15 images à partir de cinq champs visuels différents dans chaque plaque cellulaire, et un empilement z de 8 plans z équidistants. Le fichier .lsm résultant est une pile de temps, de position et de z.
      REMARQUE : Les réglages de gain, de contraste et de luminosité doivent être initialement optimisés en utilisant la puissance laser minimale nécessaire pour utiliser toute la plage dynamique du détecteur et maintenus constants tout au long de l’étude, en veillant à ce que toutes les images soient effectuées dans les mêmes conditions. Jusqu’à neuf positions différentes peuvent être enregistrées dans cette combinaison matériel-logiciel et le microscope passe automatiquement d’une position d’imagerie à l’autre.

2. Analyse des images

Figure 2 : Optimisation de routine. (A) Code représentatif de l’optimisation de routine. (B) Optimisation de routine Live-Script. (C) Flux d’optimisation de routine. (D) Validation des résultats d’optimisation de routine : image représentative des mitochondries dans des cellules non traitées (panneau de gauche), traitée avec atRA (10-7 M, 72 h, panneau du milieu), et traitée avec l’antagoniste RAR BMS493 (^10-7 M, 72 h, panneau de droite), imagée après incubation avec TMRM (20 nM, 45 min d’incubation). Barre d’échelle = 30 μm. (E) TMRM Intensité dans les mitochondries du corps cellulaire. Diminution significative avec le traitement à l’acide rétinoïque tout-trans (àRA, ^10-7 M, 72 h), par rapport au contrôle (p = 0,0062), non observée avec le traitement par antagoniste RAR (BMS493, ^10-7 M, 72 heures). Cinq cellules ont été quantifiées à partir de chacune des trois répétitions par condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Traitement d'images
   1. Ouvrir des fichiers dans ImageJ 2.1.0 et séparer les piles de positions par champ visuel : Ouvrez ImageJ et cliquez sur Barre de menus | Illustration | Dupliquer | Tranches d’entrée/numéro d’image | D’accord.
      REMARQUE : Pour réduire les entrées répétitives dans le logiciel, une macro ImageJ a été développée pour faciliter la duplication et l’enregistrement des images du champ visuel.
2. Protocole macro
   1. Dessinez une région d’intérêt (ROI) autour de la cellule avec l’outil de sélection libre.
   2. Exécutez la macro en ouvrant ImageJ et en accédant à Barre de menus | Plug-ins | Macros | Exécutez la macro Effacer l’arrière-plan et enregistrer les images.
      REMARQUE : Les images peuvent être randomisées dans ce processus, en stockant la clé de solution en fonction des exigences d’optimisation.
   3. Déterminer la taille des pixels et la profondeur du voxel : Ouvrez ImageJ | l’image et accédez à la barre de menus | Illustration | Propriétés.
3. Protocole direct alternatif
   REMARQUE : cette alternative n’utilise pas la macro pour traiter les images
   1. Pour trouver la taille des pixels et la profondeur du voxel : Ouvrir ImageJ | Ouvrez l’image et accédez à la barre de menus | Illustration | Propriétés.
   2. Dessinez un retour sur investissement autour de la cellule avec l’outil de sélection libre, en vous assurant qu’il englobe toute la cellule tout au long des 15 images.
   3. Accédez à la barre de menus | Modifier | Dégagez l’extérieur.
   4. Accédez à la barre de menus | Fichier | Enregistrer sous | Sélectionnez Tiff.
   5. Sélectionnez Enregistrer le dossier et cliquez sur Enregistrer.
      REMARQUE : Les images peuvent être mises en aveugle/randomisées manuellement à ce stade avant de poursuivre l’analyse.
4. Analyse automatisée des images
   1. Préparez les dossiers pour les fichiers d’analyse.
      1. Créez trois dossiers principaux, intitulés « Toutes les pistes », « Pistes périnucléaires » et « Pistes télénucléaires ».
         REMARQUE : Ceux-ci correspondent aux principales options de piste automatisée.
      2. Dans chaque dossier principal, créez un sous-dossier pour chaque image à traiter, identifié numériquement à partir de 1.
      3. Ajoutez une copie des deux fichiers supplémentaires d’optimisation de routine (mitometer2table.m et getTXTfiles.m) à chaque dossier d’image.
         REMARQUE : Ces fichiers aident à l’analyse des données et à l’arrangement final du format. Le nombre de dossiers doit correspondre au nombre d’éléments de la feuille de calcul aléatoire (.xlsx). Après avoir créé tous les sous-dossiers numérotés avec des fichiers supplémentaires pour un ensemble de données, ils peuvent être copiés et collés par lots dans les ensembles de données restants.
5. Utilisez l’application MATLAB Mitometer pour analyser les images.
   REMARQUE : ce protocole a été exécuté sur un mitomètre installé sur MATLAB R2022a. Chargez des images par lots de 30 pour un temps de course et un équilibre de sortie optimaux. La taille maximale du fichier MAT est imposée par le système de fichiers natif : par défaut, les opérations de « sauvegarde » peuvent créer un fichier < 2³¹ octets (~2 Go) ; Le format de sauvegarde MAT-Files Version 7.3 peut être utilisé à la place, car il autorise des tailles variables maximales supérieures à 2 Go.
   1. Identifier/modifier la version par défaut du fichier MAT : dans l’onglet Accueil de la section Environnement , cliquez sur Préférences et sélectionnez MATLAB | Général | Fichiers MAT.
   2. Utiliser l’outil MATLAB Mitometer pour analyser : Ouvrez MATLAB et accédez à la barre de menus | APPLICATIONS | Mitomètre ouvert | Sélectionnez Démarrer 3D | Données d’entrée (Taille de pixel (μm) : 0,1395089 / Temps entre image(s) : 2/Nombre de plans z : 8/Distance axiale entre les plans z (μm) : 0.418809 | Sélectionnez les images à saisir.
   3. Allez dans le menu latéral du mitomètre, sélectionnez Image, cliquez sur Sélectionner en surbrillance, accédez à la barre de menu du mitomètre | Sélectionner des pistes | Vues de piste | sélectionnez All-Tracks, Télénucléaire ou Périnucléaire | Barre de menu mitomètre | Sélectionner Analyse | Choisir un élément (c’est-à-dire Longueur) | sélectionnez Enregistrer dans « .txt ».
      REMARQUE : Plusieurs paramètres peuvent être téléchargés à la fois, s’ils sont sélectionnés simultanément.
   4. Extraire les fichiers de résultats dans les dossiers créés (2.2.1).
6. Optimisation de routine et analyse des données
   1. Préparer/adapter le fichier « Randomization.xlsx » contenant la clé pour l’encodage des images.
      1. Insérez une liste d’entiers consécutifs, à partir de 1, dans la colonne A.
         REMARQUE : Il est conseillé de conserver un dossier dupliqué avec les images nommées à l’origine.
      2. Placez les variables analytiques dans la colonne B, composée de caractères alphanumériques.
         REMARQUE : Le nombre de lignes dans le document doit être cohérent avec le nombre de dossiers présents dans le jeu de données principal. Copiez et collez ce fichier « Randomization.xlsx » dans les deux autres ensembles de données principaux.
   2. Analyse optimisée des données
      1. Double-cliquez sur « executable.mlx », saisissez le nombre de dossiers, spécifiez le répertoire des dossiers (copiez le répertoire en haut du dossier) | le répertoire de sauvegarde (copiez le répertoire en haut du dossier) | le nom de la feuille de calcul dans le fichier de sortie et cliquez sur Exécuter.
      2. Effectuer des analyses statistiques au besoin.
         REMARQUE : La création facultative d’un fichier .xlsx dans chaque dossier avec les données .txt et une alerte sonore à la fin de l’analyse peut être sélectionnée. Live Script génère un fichier de feuille de calcul unique sous forme de tableau. Dans cette sortie, les colonnes représentent les paramètres analysés (par exemple, « Longueur de l’axe principal » ; « Intensité ») et les lignes représentent les champs visuels des variables analytiques (par exemple, « Contrôle »).

Representative Results

Pour améliorer et accélérer l’analyse des fichiers de sortie au format .txt, une optimisation de routine a été codée qui lit les données cohérentes avec les fichiers de sortie .txt Mitometer, avec des colonnes représentant une trame et des lignes représentant des mitochondries identifiées. L’optimisation de routine produit des données en une seule valeur par paramètre en faisant la moyenne des images pour chaque mitochondrie identifiée, puis en faisant la moyenne des résultats de toutes les mitochondries par champ visuel. La routine développée lit les fichiers à partir de dossiers numérotés de 1 à plus. L’optimisation de la routine Live Script génère un fichier de feuille de calcul unique sous forme de tableau. Dans cette sortie, les colonnes représentent les paramètres analysés (par exemple, « Longueur de l’axe principal » ; « Intensité ») et les lignes représentent les champs visuels des variables analytiques (par exemple, « Contrôle »).

Les résultats publiés précédemment décrivent le potentiel de la membrane mitochondriale dans le corps cellulaire des cultures neuronales primaires pour diminuer et le mouvement axonal des mitochondries pour augmenter après_{l’activation de RAR β} ⁶.

Des traitements similaires ont été effectués dans des cellules SH-SY5Y du neuroblastome différencié, traitées avec les agonistes et les antagonistes des récepteurs de l’acide rétinoïque pendant 72 heures (Figure 3). Les données recueillies ont été tracées et analysées à l’aide d’un test t de Student non directionnel, bilatéral, à 2 échantillons et à variance égale. Des comparaisons ont été faites, dans le fichier de feuille de calcul de sortie, entre les groupes appropriés, avec α = 0,05.

Figure 3 : Régulation de l’homéostasie mitochondriale par la signalisation rétinoïde spécifique à l’isoforme. (A) Image représentative des mitochondries après traitement (en haut), tracé de surface respectif (au milieu) et segmentation automatisée (en bas). Les points bleus sont les positions initiales mitochondriales ; Les points rouges sont les positions finales. Barres d’échelle = 30 μm. (B) Carte thermique résumant toutes les variations trouvées dans les paramètres mitochondriaux ; Une variance significative a été trouvée entre le corps cellulaire et le neurite (ANOVA bidirectionnelle, p = 0,0158), avec une influence significative de la modulation spécifique de l’isoforme RAR dans toutes les mitochondries (ANOVA bidirectionnelle, p = 0,0082). (C) Longueur mitochondriale - une diminution significative a été observée dans les cellules traitées avec AM580 (p = 0,0179). (D) Surface mitochondriale - des diminutions significatives ont été observées dans les cellules traitées avec AM580 (p=0,000406) et avec BMS493 (p=3,01 × ^10-8). (E) Intensité de la TMRM, normalisée pour le volume mitochondrial - des diminutions significatives ont été observées dans les cellules traitées par PR (p = 0,00621) et Ch55 (p = 0,000542). * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; # p < 0,0001. Cinq cellules ont été quantifiées à partir de chacune des trois répétitions par condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’analyse révèle que le traitement des cellules SH-SY5Y différenciées avec_{l’agoniste de la α} RAR AM580 entraîne une diminution de la longueur et de la surface moyennes des mitochondries ; cet effet n’a pas été observé lors du traitement par agonistes pour d’autres isoformes autres que exclusivement_α RAR, mais il y a eu une diminution intéressante de 35,42 ± 0,5 % de la surface mitochondriale après traitement avec le pan-antagoniste RAR BMS493 (p = 3,01 x ^10-8). En revanche, les rétinoïdes semblent avoir un effet inverse en termes d’intensité TMRM, qui est liée à la polarisation membranaire mitochondriale¹¹ : alors que le traitement par_l’agoniste RAR α ne semble pas avoir d’effet significatif sur l’intensité TMRM, le traitement par le pan-agoniste RAR àRA entraîne une diminution spectaculaire de 54,82 ± 18,01 % (p = 0,00621). Cette diminution est également observée après un traitement par l’agoniste RAR_α/β CH55 (28,99 ± diminution de 4,97 %, p = 0,000542), et peut-être aussi après un traitement par_l’agoniste spécifique de la RAR β CD2314 (37,01 ± diminution de 28,96 %, p = 0,09134). Il est important de noter que cette méthode différencie les mitochondries axonales de celles du corps cellulaire, permettant l’étude du stimulus RAR spécifique à l’isoforme et de la modulation mitochondriale.

Figure 4 : Photoblanchiment minimal tout au long du protocole d’imagerie. (A) Les timelapses de la pile Z ont été traités dans FIJI, et les projections du projet z d’intensités moyennes ont été exportées pour tous les points temporels. (B) Un profil de l’axe z du même traitement a été tracé en fonction du temps. (C) Quantification du photoblanchiment pour le montage expérimental. Aucun changement significatif n’a été observé (p = 0,7607 ; test t apparié pour l’intensité moyenne du signal de la première et de la dernière trame). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’imagerie de cellules vivantes produit des fichiers volumineux qui nécessitent un traitement informatique sérieux, mais même les outils les plus récents nécessitent une saisie manuelle importante pour être traités. Cette optimisation de routine est axée sur la simplification du processus d’analyse des mitochondries sur le Mitomètre car cet outil présente un très bon équilibre entre l’entrée utilisateur et la sortie des données. Une comparaison complète entre différents outils d’analyse d’images mitochondriales a déjà été examinée¹⁰. Alors que d’autres pipelines sont plus axés sur l’analyse des réseaux mitochondriaux et de la masse des clusters ou sur l’analyse de la variation du potentiel membranaire, cette nouvelle méthodologie présentée ici permet une caractérisation rapide et validée du réseau de mitochondries à cellules entières, permettant également la différenciation entre les mitochondries axonales et cellulaires, une caractéristique essentielle à appliquer dans le domaine des neurosciences.

L’application MATLAB Mitometer⁹ analyse les mitochondries dans les séries d’images : le fond diffus est soustrait de chaque image temporelle et de chaque plan z de la série, qui sont ensuite convolutés avec un noyau gaussien pour éliminer le bruit à haute fréquence, suivi d’un seuil d’intensité résultant en un masque des mitochondries segmentées. Les paramètres idéaux maximisent le nombre médian de mitochondries identifiées tout en minimisant la fluctuation du nombre et de la surface des mitochondries dans les images temporelles adjacentes de l’image, une mitochondrie étant allouée à sa trajectoire à partir de l’image précédente pour le mouvement de translation.

Les cellules SH-SY5Y différenciées ont été utilisées comme modèle neuronal pour la validation expérimentale de l’optimisation de routine. Cette lignée cellulaire humaine est une lignée cellulaire homogène de type neuroblaste exprimant plusieurs caractéristiques neuronales, telles que l’activité enzymatique, les récepteurs ou les neurofilaments, qui prolifèrent facilement en culture. Ce modèle permet l’expérimentation de cellules d’origine humaine sans les préoccupations éthiques associées et avec des coûts bien inférieurs à ceux de l’utilisation de cultures primaires¹². Les SH-SY5Y indifférenciés sont prolifératifs, avec des processus courts ; la différenciation de ces cellules avec un traitement séquentiel à l’acide rétinoïque et au BDNF arrête la prolifération et favorise l’élongation des neurites, fournissant un modèle neuronal in vitro utile¹³.

L’acide rétinoïque tout-trans (^10-7 M) a été utilisé comme agoniste pan-RAR ; AM580 (^10-7 M) est un agoniste_{de la α} RAR ; CD2314 (^10-7 M) est un agoniste_{de la β} RAR ; Ch55 (^10-7 M) est un agoniste_{de la α} RAR et_{de la β} RAR ; BMS493 (^10-7 M) est un pan-antagoniste de RAR et a été utilisé comme contrôle pharmacologique. Cette méthodologie a été validée à l’aide d’un modèle similaire qui a été récemment décrit : l’activation de RAR dans les cellules neuronales régule l’homéostasie mitochondriale dans le neurone⁶. De même, les résultats obtenus à l’aide de cette routine optimisée sont cohérents avec la littérature, montrant une altération significative de plusieurs paramètres mitochondriaux (longueur des mitochondries, surface et potentiel membranaire mitochondrial), discriminant les mitochondries dans le neurite de celles du corps cellulaire (Figure 3). Le mitomètre peut identifier et séparer automatiquement les mitochondries en fonction de la distance par rapport au noyau (Figure 1). Il s’agit d’une fonctionnalité de l’application^{originale 9} et a été utilisée telle quelle.

Cette optimisation a permis un traitement rapide des fichiers d’imagerie, réduisant considérablement les entrées de l’opérateur, la lecture des documents, le traitement des données (à une vitesse de 100 fichiers par minute), réduisant le biais et augmentant la mise en aveugle expérimentale. Avec cette configuration expérimentale, chacune des images prend environ 1 min pour compléter un cycle ; des intervalles plus courts peuvent être obtenus en diminuant le nombre de plans z capturés (éventuellement accompagné d’une augmentation de l’ouverture du sténopé) ou le nombre de champs visuels ; Des intervalles plus longs peuvent être obtenus en sélectionnant une période de délai avant la capture.

Une configuration expérimentale de cinq positions avec 8 plans z et 15 images prend environ 19 minutes par boîte de culture cellulaire, ce qui permet un photoblanchiment minimal (Figure 4). La principale limite expérimentale de l’imagerie en direct des mitochondries est de trouver l’équilibre entre une confluence suffisante pour que les cellules soient saines et une parcimonie permettant de discriminer entre les cellules, et, en particulier, les neurites. Si les cellules sont placées trop confluentes dans les boîtes à fond de verre, leur prolifération au cours du processus de différenciation entraîne un chevauchement des cellules et la formation de réseaux de neurites, des difficultés à imager les cellules et les neurites individuelles et à identifier la direction de transport, ce qui brouille la cartographie des réseaux mitochondriaux. En termes de traitement, MATLAB n’a pas la même puissance de calcul que d’autres langages, tels que Python, mais MATLAB est particulièrement bon pour le traitement du signal, ce qui le rend idéal pour les expériences d’imagerie des mitochondries.

Ce protocole permet également d’obtenir une imagerie avant et après un traitement aigu avec une solution liquide. Pour ce faire, la chambre d’incubation du microscope doit être soigneusement ouverte pour donner accès à la boîte à fond de verre pour l’application du traitement. Cela fonctionne mieux avec des volumes plus importants (>100 μL), car l’application de traitement de la turbulence peut les répartir dans toute la préparation, tandis que des volumes plus petits nécessiteraient une agitation de la préparation, éventuellement en changeant son orientation par rapport à l’objectif/support de plaque. Si une telle dérive ne se produit pas, les positions enregistrées dans le logiciel se rapporteraient aux mêmes cellules imagées avant le traitement, et une nouvelle boucle d’imagerie pourrait être lancée. Cependant, il faut considérer que cette variation augmenterait le photoblanchiment, et des compromis doivent être faits sur l’intensité initiale du laser. De plus, ce même protocole peut être appliqué à d’autres modèles cellulaires, tels que les cultures primaires neuronales⁶ ou même d’autres types de cellules¹⁴, mais il nécessiterait une optimisation de la section microscopie si l’imagerie de cellules plus mobiles ou pour des périodes d’imagerie plus longues.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective