Summary
הרשת המיטוכונדריאלית מורכבת ביותר, מה שהופך אותה למאתגרת מאוד לניתוח. כלי חדשני של MATLAB מנתח מיטוכונדריה עם תמונות קונפוקליות חיות בתמונות timelapse, אך התוצאה היא נפח פלט גדול הדורש תשומת לב ידנית אישית. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחה אופטימיזציה שגרתית, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר.
Abstract
הרשת המיטוכונדריאלית המורכבת מאתגרת מאוד לפלח, לעקוב ולנתח תאים חיים. כלי MATLAB מאפשרים ניתוח מיטוכונדריה בקובצי timelapse, ובכך מפשטים ומאיצים באופן משמעותי את תהליך עיבוד התמונה. עם זאת, הכלים הקיימים מייצרים נפח פלט גדול, הדורש תשומת לב ידנית פרטנית, ולמערכי ניסוי בסיסיים יש פלט של אלפי קבצים, שכל אחד מהם דורש טיפול נרחב וגוזל זמן.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחה אופטימיזציה שגרתית, הן בקוד MATLAB והן בטופסי סקריפט חי, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר ומפחיתה משמעותית את קריאת המסמכים ועיבוד הנתונים. עם מהירות של 100 קבצים לדקה, האופטימיזציה מאפשרת ניתוח מהיר כולל. המיטוב משיג את תפוקת התוצאות על ידי ממוצע נתונים ספציפיים למסגרת עבור מיטוכונדריה בודדים לאורך מסגרות זמן, ניתוח נתונים באופן מוגדר, עקבי עם אלה פלט מכלים קיימים. הדמיה קונפוקלית חיה בוצעה באמצעות הצבע טטרמתילרודאמין מתיל אסטר, והאופטימיזציה השגרתית אומתה על ידי טיפול בתאים עצביים עם אגוניסטים לקולטן חומצה רטינואית (RAR), שהשפעתם על מיטוכונדריה עצבית מבוססת בספרות. התוצאות תאמו את הספרות ואפשרו אפיון נוסף של התנהגות הרשת המיטוכונדריאלית בתגובה לאפנון RAR ספציפי לאיזופורם.
מתודולוגיה חדשה זו אפשרה אפיון מהיר ותקף של רשת מיטוכונדריה של נוירונים שלמים, אך היא גם מאפשרת הבחנה בין אקסון למיטוכונדריה של גוף התא, תכונה חיונית ליישום בתחום מדעי המוח. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ניסויים באמצעות טיפולים מהירים, המאפשר הדמיה של אותם תאים לפני ואחרי טיפולים, מעבר לתחום מדעי המוח.
Introduction
מיטוכונדריה תאית ניצבת במרכז כל המצבים הפיזיולוגיים, והבנה מעמיקה של ההומאוסטזיס (מיטוסטזיס) והתנהגותם היא בעלת חשיבות עליונה כדי לסייע בזיהוי טיפול תרופתי למגוון רחב של מחלות, כולל סרטן ואלצהיימר 1,2.
מיטוכונדריה ממלאים תפקידים תאיים מכריעים בהומאוסטזיס אנרגיה, בייצור ATP, בחציצה של סידן ובוויסות ROS, ומיטוסטאזיס חיוני לשמירה על הומאוסטזיס חלבונים, שכן מלווים מולקולריים תלויים באנרגיה3. אלה דורשים אפנון רשת קבוע ודינמי והסתגלות כדי לענות ביעילות על הצרכים התאיים, והעברת המיטוכונדריה מווסתת על ידי מסלולי איתות שונים; עבודות קודמות תיארו מסלול אחד כזה, זה של קולטני חומצה רטינואית (RARs)4,5. חומצה רטינואית (RA) מקדמת צמיחה אקסונלית ועצבית באמצעות הפעלת RAR. בתאי עצב ראשוניים בקליפת המוח של עכברים, הפעלת RAR-β מעודדת גדילה מיטוכונדריאלית, מהירות וניידות בנוירוט6.
בהתחשב ביכולת ההסתגלות והדינמיקה של הרשת המיטוכונדריאלית, האפשרות להעריך מיטוסטזיס "בזמן אמת" חיונית לא רק לחקר הומאוסטזיס אנרגיה, אלא גם לפרוטאוסטזיס, בריאות התאים, שגשוג או איתות. שיטה נפוצה להערכת מיטוסטזיס מסתמכת על מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר הדגשת מיטוכונדריה באמצעות צבע פלואורסצנטי או סמן, כמו גם מערך מיקרוסקופיה ספציפי המאפשר ויסות טמפרטורה ו / או CO2 7. סוג זה של מערך ניסיוני כרוך בכך שהעתק ניסיוני אחד יבוצע בכל פעם. בנוסף לחזרה ניסיונית על טיפולים שונים, יש לקחת בחשבון שלרוב הניסויים צריכים להיות העתקים טכניים שלהם (שבהם יותר ממיקום אחד מצולם לכל לוחית), עם סדרה של מישורי מוקד (ערימות z) המתועדים בסדרה של נקודות זמן. לפיכך, תכנון ניסיוני עם שלוש חזרות של בקרה אחת ושני טיפולים, עם חמש עמדות הדמיה לכל צלחת, ו -15 נקודות זמן, מביא לעיבוד של 225 ערימות. באופן קלאסי, סרטונים של מיטוכונדריה חיים נותחו על ידי שרטוט קימוגרפים, אשר ינותחו בנפרד8, בתהליך גוזל זמן הדורש קלט ידני נרחב, גם כאשר מסתמכים על כלי מחשב.
לאחרונה תואר אלגוריתם9 המאפשר פילוח ומעקב אוטומטיים אחר מיטוכונדריה בקבצים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של תאים חיים. קיימות טכניקות כימות אחרות, ולכולן יש מגבלות10. מיטומטר, יישום קוד פתוח אוטומטי, מתאים במיוחד לניתוח דינמיקת מיטוכונדריה בחלוף זמן, הדורש קלט משתמש נמוך. ליישום זה יש שורה של יתרונות על פני כלים קיימים אחרים מבוססי MATLAB, כלומר מאפשר עיבוד אוטומטי של ערימות TIF בודדות, תוך שימוש בעד 13 פרמטרים שונים, מעניין במיוחד עבור מדעי המוח, שכן הוא מבדיל בין מיטוכונדריה פרי-גרעינית וטלה-גרעינית.
עם זאת, עבור ניסוי כמו זה שתואר לעיל, 13 פרמטרים אלה החלים על 225 ערימות מביאים ל- 2,925 קבצי פלט נפרדים. אלה דורשים ארבע כניסות מחשב נפרדות, המסכמות עד 10,000 קלטים ידניים הנדרשים כדי להוריד את כל קבצי הפלט. עבור עיצובים ניסיוניים גדולים, התוצאה היא ניתוח גוזל זמן רב שלא לצורך של כל שילוב קובץ ונתונים. כאן אנו מציגים אופטימיזציה שגרתית המאפשרת ניתוח קבצים מהיר, צמצום משמעותי של קריאת מסמכים ועיבוד נתונים, ניתוח נתונים באופן מוגדר, עקבי עם הפלט מהכלים הקיימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: לפרוטוקול הזה יש שני שלבים עיקריים: שלב מעבדה רטוב, הכולל תרבית תאים ומיקרוסקופ קונפוקלי חי כדי לקבל תמונות של מיטוכונדריה חיים (איור 1), ושלב בסיליקו כדי לנתח תמונות שהתקבלו (איור 2). לניתוח נתונים אוטומטי של מיטוכונדריה תלת-ממדית בהדמיה חיה, נעשה שימוש במיטומטר של יישום MATLAB כפי שסופק על ידי Lefebvre et al.9. האופטימיזציה השגרתית כתובה ב-MATLAB. התוכנה, הגרסאות המעודכנות ועיבוד פקודות המאקרו של ImageJ זמינים באופן חופשי באינטרנט דרך GitHub, בשעה https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. מיקרוסקופ חי
איור 1: פרוטוקול ניסויי. תאי SH-SY5Y התמינו וטופלו ברטינואידים. (A) TMRM שימש להדמיה חיה של מיטוכונדריה בריאה בתאים שטופלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ולכידת ערימת z בהילוך מהיר של חמישה שדות ראייה. (B) יישום מיטומטר MATLAB מפלח ומנתח באופן אוטומטי תמונות מיטוכונדריה. בנוסף לניתוח, תוכנה זו מפלה באופן אוטומטי מיטוכונדריה על פי קרבה גרעינית. נקודות כחולות הן מיקומים התחלתיים מיטוכונדריאליים; נקודות אדומות הן מיקומים סופיים. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. קיצור: TMRM = tetramethylrhodamine, מתיל אסטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- תרבית תאים
- יש לדגור על תאי SH-SY5Y בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה של 5%CO2 ו-95% אוויר, בתרבית בחלקים שווים של MEM (Minimal Essential Medium) ו-F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS).
- צלחת SH-SY5Y תאים בצלחות תא תחתית זכוכית בצפיפות של 15 × 104 תאים / מ"ל.
- להבדיל תאים עם 5 ימי טיפול עם 10 מיקרומטר all-trans חומצה רטינואית בתווך תרבית 1% המכיל FBS, ולאחר מכן יומיים של טיפול עם 10 ƞg / mL גורם נוירוטרופי המוח (BDNF).
- טיפול תאי
- יש לשטוף תאים עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) ולטפל במשך 72 שעות עם אגוניסטים 10-7 M RAR-isoform, בחלקים שווים של MEM (Minimal Essential Medium) ו-F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, בתוספת FBS 1%.
הערה: אגוניסט RARα בשימוש היה AM580; אגוניסט נדיר בשימוש היה CD2314; Ch55 שימש כאגוניסט כ-RARα וכאגוניסט משותף β; ב-RA שימש כבקרה חיובית; BMS493 שימש כאנטגוניסט פאן RAR.
- יש לשטוף תאים עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) ולטפל במשך 72 שעות עם אגוניסטים 10-7 M RAR-isoform, בחלקים שווים של MEM (Minimal Essential Medium) ו-F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, בתוספת FBS 1%.
- הדמיה קונפוקלית חיה
- החלף את מדיום התרבית בתווך תרבית טרי 1% המכיל FBS בטטרמתילרודמין 20 ננומטר, מתיל אסטר (TMRM) למשך 45 דקות.
הערה: TMRM הוא צבע פלואורסצנטי המותאם לתאים, המופרד על ידי מיטוכונדריה פעילה, ותקופת הדגירה הזו מאפשרת ל-TMRM להגיע לשיווי משקל ולהיקלט על ידי מיטוכונדריהמקוטבת 11. יש להתחיל בהדמיה לפני קביעת שיווי משקל מכיוון שעוצמת אות TMRM יכולה לעלות באופן מלאכותי במהלך ההדמיה. - הניחו את התאים באינקובטור המחובר למיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר בטמפרטורה של 37°C.
- צלם תמונות באמצעות מטרה אפוכרומט טבילת שמן 63x, עם גודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים המתקבל עם מפתח צמצם של חור סיכה של יחידה אוורירית אחת, לכידת סדרת זמן של 15 פריימים מחמישה שדות חזותיים שונים בכל לוח תא, וערימת z של 8 מישורי z במרחק שווה. קובץ ה- .lsm המתקבל הוא מחסנית זמן, מיקום ו- z.
הערה: הגדרות הרווח, הניגודיות והבהירות חייבות להיות ממוטבות תחילה תוך שימוש בעוצמת הלייזר המינימלית הדרושה לשימוש בכל הטווח הדינמי של הגלאי ולשמור עליהן קבועות לאורך כל המחקר, כדי להבטיח שכל ההדמיה מבוצעת באותם תנאים. ניתן להקליט עד תשעה מיקומים שונים בשילוב חומרה-תוכנה זה והמיקרוסקופ עובר בין מיקומי הדמיה באופן אוטומטי.
- החלף את מדיום התרבית בתווך תרבית טרי 1% המכיל FBS בטטרמתילרודמין 20 ננומטר, מתיל אסטר (TMRM) למשך 45 דקות.
2. ניתוח תמונות
איור 2: אופטימיזציה שגרתית. (A) קוד מייצג של המיטוב השגרתי. (B) אופטימיזציה שגרתית של Live-Script. (C) זרימת עבודה שגרתית של אופטימיזציה. (D) אימות תוצאת אופטימיזציה שגרתית: תמונה מייצגת של מיטוכונדריה בתאים לא מטופלים (פאנל שמאלי), מטופלים ב- RA (10-7 M, 72 שעות, פאנל אמצעי), ומטופלים עם אנטגוניסט RAR BMS493 (10-7 M, 72 שעות, פאנל ימני), שצולם לאחר הדגירה עם TMRM (20 ננומטר, 45 דקות דגירה). סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. (E) עוצמת TMRM במיטוכונדריה של גוף התא. ירידה משמעותית בטיפול בחומצה רטינואית all-trans (ב- RA, 10-7 M, 72 שעות), בהשוואה לביקורת (p = 0,0062), שלא נצפתה כאשר טופלה עם אנטגוניסט RAR (BMS493, 10-7 M, 72 שעות). חמישה תאים כומתו מכל אחת משלוש חזרות לכל מצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- עיבוד תמונה
- פתיחת קבצים ב- ImageJ 2.1.0 וערימות מיקום נפרדות לפי שדה חזותי: פתח את ImageJ ולחץ על שורת התפריטים | תמונה | שכפול | קלט פרוסות/מספר מסגרת | בסדר.
הערה: כדי להפחית קלט חוזר לתוכנה, פותח מאקרו ImageJ כדי להקל על שכפול ושמירה של תמונות שדה חזותי.
- פתיחת קבצים ב- ImageJ 2.1.0 וערימות מיקום נפרדות לפי שדה חזותי: פתח את ImageJ ולחץ על שורת התפריטים | תמונה | שכפול | קלט פרוסות/מספר מסגרת | בסדר.
- פרוטוקול מאקרו
- צייר אזור עניין (ROI) מסביב לתא באמצעות כלי הבחירה החופשית.
- הפעל את המאקרו על-ידי פתיחת ImageJ וניווט אל שורת התפריטים | תוספים | פקודות מאקרו | הפעל את נקה את הרקע ושמור תמונות מאקרו.
הערה: ניתן לחלק תמונות באופן אקראי בתהליך זה, תוך אחסון מפתח הפתרון בהתאם לדרישות המיטוב. - קביעת גודל פיקסל ועומק ווקסל: פתח את ImageJ | התמונה ונווט אל שורת התפריטים | תמונה | מאפיינים.
- פרוטוקול ישיר חלופי
הערה: חלופה זו אינה משתמשת במאקרו לעיבוד תמונות- מצא את גודל הפיקסל ואת עומק הווקסל: פתח את ImageJ | פתח תמונה ונווט אל שורת התפריטים | תמונה | מאפיינים.
- צייר החזר השקעה סביב התא באמצעות כלי הבחירה החופשית, וודא שהוא מקיף את התא כולו לאורך 15 המסגרות.
- נווט אל שורת התפריטים | עריכה | ברור בחוץ.
- נווט אל שורת התפריטים | קובץ | שמירה בשם | בחר Tiff.
- בחר שמירת תיקיה ולחץ על שמור.
הערה: ניתן לסנוור/אקראי תמונות באופן ידני בשלב זה לפני המשך הניתוח.
- ניתוח תמונה אוטומטי
- הכן את התיקיות עבור קבצי ניתוח.
- צור שלוש תיקיות ראשיות, שכותרתן "כל הרצועות", "רצועות פרי-גרעיניות" ו"רצועות טלגרעיניות".
הערה: אפשרויות אלה תואמות לאפשרויות המסלול האוטומטי העיקריות. - בכל תיקייה ראשית, צרו תיקיית משנה לכל תמונה לעיבוד, המזוהה מספרית מ-1 ומעלה.
- הוסף עותק של שני הקבצים המשלימים למיטוב שגרתי (mitometer2table.m ו- getTXTfiles.m) לכל תיקיית תמונה.
הערה: קבצים אלה מסייעים בניתוח נתונים ובסידור פורמט סופי. מספר התיקיות חייב להתאים למספר הרכיבים בגיליון האלקטרוני האקראי (.xlsx). לאחר יצירת כל תיקיות המשנה הממוספרות עם קבצים משלימים לערכת נתונים אחת, ניתן להעתיק ולהדביק אותן באצווה בערכות הנתונים הנותרות.
- צור שלוש תיקיות ראשיות, שכותרתן "כל הרצועות", "רצועות פרי-גרעיניות" ו"רצועות טלגרעיניות".
- הכן את התיקיות עבור קבצי ניתוח.
- השתמשו במיטומטר של יישום MATLAB כדי לנתח תמונות.
הערה: פרוטוקול זה הופעל על מיטומטר, שהותקן ב-MATLAB R2022a. טען תמונות באצוות של 30 לקבלת זמן ריצה אופטימלי ואיזון פלט. גודל קובץ MAT מרבי מוטל על-ידי מערכת הקבצים המקורית: כברירת מחדל, פעולות "שמירה" יכולות ליצור קובץ < 231 בתים (~ 2 GB); ניתן להשתמש במקום זאת בפורמט שמירה MAT-Files גרסה 7.3, מכיוון שהיא מאפשרת גדלים משתנים מרביים הגדולים מ- 2 GB.- זיהוי/שינוי גרסת ברירת המחדל של קובץ MAT: בכרטיסיה 'בית ' במקטע 'סביבה ', לחצו על 'העדפות ' ובחרו MATLAB | כללי | קבצי MAT.
- השתמשו בכלי MATLAB מיטומטר כדי לנתח: פתחו את MATLAB ונווטו אל שורת התפריטים | אפליקציות | מיטומטר פתוח | בחר התחל תלת-ממד | נתוני קלט (גודל פיקסלים (μm): 0.1395089/זמן בין פריימים (ים): 2/מספר z-מישורים: 8/מרחק ציר בין מישורי z (μm): 0.418809 | בחרו תמונות להזנה.
- עבור לתפריט הצד של המיטומטר, בחר תמונה, לחץ על בחר מסומן, נווט לשורת התפריטים של המיטומטר | בחר מסלולים | מעקב אחר תצוגות | בחר All-Tracks, Telenuclear או Perinuclear | מיטומטר שורת תפריטים | בחר ניתוח | בחר רכיב (כלומר, אורך) | בחר שמור ל- ".txt".
הערה: ניתן להוריד יותר מפרמטר אחד בבת אחת, אם נבחר במקביל. - חלץ קבצי תוצאה לתיקיות שנוצרו (2.2.1).
- אופטימיזציה שוטפת וניתוח נתונים
- הכינו/התאימו את קובץ "Randomization.xlsx" המכיל את המפתח לקידוד תמונה.
- הוסף רשימה של מספרים שלמים עוקבים, מ- 1 ומעלה, בעמודה A.
הערה: מומלץ לשמור תיקייה משוכפלת עם תמונות בשם המקורי. - מקם את המשתנים האנליטיים בעמודה B, המורכבת מתווים אלפאנומריים.
הערה: מספר השורות במסמך חייב להיות עקבי עם מספר התיקיות הקיימות בערכת הנתונים הראשית. העתק והדבק קובץ "Randomization.xlsx" זה בשתי ערכות הנתונים העיקריות האחרות.
- הוסף רשימה של מספרים שלמים עוקבים, מ- 1 ומעלה, בעמודה A.
- ניתוח נתונים ממוטב
- לחץ פעמיים על "executable.mlx", הזן את מספר התיקיות, ציין את ספריית התיקיות (העתק את הספרייה מראש התיקייה) | ספריית השמירה (העתק את הספרייה מראש התיקיה) | שם הגיליון האלקטרוני בקובץ הפלט ולחץ על הפעל.
- ביצוע ניתוח סטטיסטי לפי הצורך.
הערה: ניתן לבחור ביצירה אופציונלית של קובץ .xlsx בכל תיקיה עם נתוני .txt והתראת קול לסוף הניתוח. Live Script מפיק קובץ גיליון אלקטרוני יחיד בתבנית טבלה. בפלט זה, עמודות מייצגות פרמטרים מנותחים (לדוגמה, "אורך ציר ראשי"; "עוצמה") וקווים מייצגים שדות ראייה של משתנים אנליטיים (למשל, "שליטה").
- הכינו/התאימו את קובץ "Randomization.xlsx" המכיל את המפתח לקידוד תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לשפר ולהאיץ את הניתוח של קבצי פלט בפורמט .txt, קודד אופטימיזציה שגרתית הקוראת נתונים התואמים למיטומטר .txt קבצי פלט, עם עמודות המייצגות מסגרת וקווים המייצגים מיטוכונדריה מזוהים. המיטוב השגרתי מפיק נתונים בערך יחיד לכל פרמטר על ידי ממוצע המסגרות עבור כל מיטוכונדריה מזוהה ולאחר מכן ממוצע התוצאות של כל המיטוכונדריה לכל שדה ראייה. השגרה שפותחה קוראת קבצים מתיקיות הממוספרות מ- 1 ומעלה. Live Script Routine Optimization מפיק קובץ גיליון אלקטרוני יחיד בתבנית טבלה. בפלט זה, עמודות מייצגות פרמטרים מנותחים (לדוגמה, "אורך ציר ראשי"; "עוצמה") וקווים מייצגים שדות ראייה של משתנים אנליטיים (למשל, "שליטה").
תוצאות שפורסמו בעבר מתארות את פוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי בגוף התא של תרביות עצביות ראשוניות לרדת ואת תנועת המיטוכונדריה האקסונלית לגדול לאחר הפעלתRAR β 6.
טיפולים דומים בוצעו בתאי נוירובלסטומה ממוינים SH-SY5Y, שטופלו באמצעות אגוניסטים ואנטגוניסטים לקולטן חומצה רטינואית במשך 72 שעות (איור 3). הנתונים שנאספו שורטטו ונותחו באמצעות מבחן t של סטודנט לא כיווני, 2 זנבות, 2 מדגם, שונות שווה. נערכו השוואות, בקובץ הגיליון האלקטרוני של הפלט, בין קבוצות מתאימות, עם α = 0.05.
איור 3: ויסות הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי על-ידי איתות רטינואידי ספציפי לאיזופורם. (A) תמונה מייצגת של מיטוכונדריה לאחר טיפול (למעלה), תרשים פני השטח המתאים (באמצע) וסגמנטציה אוטומטית (למטה). נקודות כחולות הן מיקומים התחלתיים מיטוכונדריאליים; נקודות אדומות הן מיקומים סופיים. פסי קנה מידה = 30 מיקרומטר. (B) מפת חום המסכמת את כל הווריאציות שנמצאו לפרמטרים של מיטוכונדריה; נמצאה שונות משמעותית בין גוף התא לנוריט (ANOVA דו-כיווני, p=0.0158), עם השפעה משמעותית של אפנון ספציפי לאיזופורם RAR בכל המיטוכונדריה (ANOVA דו-כיוונית, p=0.0082). (C) אורך המיטוכונדריה - נצפתה ירידה משמעותית בתאים שטופלו ב-AM580 (p=0.0179). (D) שטח הפנים של המיטוכונדריה - נצפו ירידות משמעותיות בתאים שטופלו ב-AM580 (p=0.000406) וב-BMS493 (p=3.01 × 10-8). (E) עוצמת TMRM, מנורמלת לנפח המיטוכונדריה - ירידות משמעותיות נמצאו בתאים שטופלו ב-RA (p=0.00621) וב-Ch55 (p=0.000542). * עמ' < 0,05; ** עמ' < 0,01; # p < 0,0001. חמישה תאים כומתו מכל אחת משלוש חזרות לכל מצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוח מגלה כי טיפול בתאי SH-SY5Y ממוינים עם אגוניסטα RAR AM580 מביא לירידה באורך הממוצע של המיטוכונדריה ובשטח הפנים; השפעה זו לא נמצאה כאשר מטפלים באגוניסטים עבור איזופורמים אחרים מלבדα RAR בלבד, אך הייתה ירידה מעניינת של 35.42 ± 0.5% בשטח הפנים המיטוכונדריאלי לאחר טיפול עם RAR pan-antagonist BMS493 (p = 3.01 x 10-8). לעומת זאת, נראה כי לרטינואידים יש השפעה הפוכה מבחינת עוצמת TMRM, המתייחסת לקיטוב קרום המיטוכונדריה11: בעוד שנראה כי לטיפול באגוניסט RARα אין השפעה משמעותית על עוצמת TMRM, טיפול באגוניסט פאן RAR ב- RA מביא לירידה דרמטית של 54.82 ± 18.01% (p=0.00621). ירידה זו נמצאה גם לאחר טיפול באגוניסט RARα/β CH55 (ירידה של 28.99 ± 4.97%, p=0.000542), ואולי גם בעקבות טיפול באגוניסט ספציפי RARβ CD2314 (ירידה של 37.01 ± 28.96%, p=0.09134). חשוב לציין כי שיטה זו הבדילה בין מיטוכונדריה אקסונלית לבין אלה שבגוף התא, ואפשרה לחקור גירוי RAR ספציפי לאיזופורם ומודולציה מיטוכונדריאלית.
איור 4: הלבנה מינימלית לאורך פרוטוקול ההדמיה. (A) קיטועי זמן של מחסנית Z עובדו בפיג'י, ותחזיות פרויקט Z של עוצמות ממוצעות יוצאו עבור כל נקודות הזמן. (B) פרופיל ציר z של אותו עיבוד שורטט בהתאם לזמן. (C) כימות פוטו-הלבנה למערך ניסויי. לא נצפו שינויים משמעותיים (p = 0.7607; מבחן t זוגי עבור עוצמת אות ממוצעת של מסגרת ראשונה ואחרונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דימות תאים חי מייצר קבצים גדולים הדורשים עיבוד מחשוב רציני, אך אפילו הכלים העדכניים ביותר דורשים קלט ידני נרחב לעיבוד. אופטימיזציה שגרתית זו מתמקדת בפישוט תהליך ניתוח המיטוכונדריה במיטומטר מכיוון שכלי זה מציג איזון טוב מאוד בין קלט המשתמש לפלט הנתונים. השוואה מקיפה בין כלים שונים לניתוח תמונות מיטוכונדריה נסקרה בעבר10. בעוד צינורות אחרים מתמקדים יותר בניתוח רשתות מיטוכונדריה ומסת אשכול או ניתוח שונות פוטנציאלית של ממברנה, מתודולוגיה חדשה זו המוצגת כאן מאפשרת אפיון מהיר ומאומת של רשת מיטוכונדריה של תאים שלמים, ומאפשרת גם הבחנה בין אקסון למיטוכונדריה של גוף התא, תכונה חיונית ליישום בתחום מדעי המוח.
יישום MATLAB Mitometer9 מנתח מיטוכונדריה בסדרות תמונות: רקע מפוזר מופחת מכל מסגרת זמן ומישור z בסדרה, אשר לאחר מכן מפותלים עם גרעין גאוס כדי לסלק רעש בתדר גבוה, ולאחר מכן סף עוצמה וכתוצאה מכך מסכה של המיטוכונדריה המקוטעת. ההגדרות האידיאליות ממקסמות את המספר החציוני של מיטוכונדריה שזוהו תוך מזעור התנודות במספר המיטוכונדריה ושטחה על פני מסגרות טמפורליות סמוכות של התמונה, כאשר מיטוכונדריה מוקצית למסלול שלה מהפריים הקודם לתנועה תרגומית.
תאי SH-SY5Y ממוינים שימשו כמודל עצבי לאימות ניסיוני של אופטימיזציה שגרתית. קו תאים אנושי זה הוא קו תאים הומוגני דמוי נוירובלסט המבטא מספר תכונות דמויות נוירונים, כגון פעילות אנזימים, קולטנים או נוירופילמנטים, המתרבים בקלות בתרבית. מודל זה מאפשר ניסויים בתאים שמקורם בבני אדם ללא החששות האתיים הכרוכים בכך ובעלויות נמוכות בהרבה מאשר שימוש בתרביות ראשוניות12. SH-SY5Y בלתי מובחנים מתרבים, עם תהליכים קצרים; התמיינות של תאים אלה עם חומצה רטינואית רציפה וטיפול BDNF מפסיק את ההתפשטות ומקדם התארכות עצבית, מתן מודל עצבי שימושי במבחנה 13.
חומצה רטינואית All-trans (10-7 M) שימשה כאגוניסט pan-RAR; AM580 (10-7 M) הוא אגוניסטα RAR; CD2314 (10-7 M) הוא אגוניסטβ RAR; Ch55 (10-7 M) הואα RAR ואגוניסטβ RAR; BMS493 (10-7 M) הוא אנטגוניסט פאן RAR ושימש כבקרה פרמקולוגית. מתודולוגיה זו אומתה באמצעות מודל דומה שתואר לאחרונה: הפעלת RAR בתאים עצביים מווסתת את הומאוסטזיס המיטוכונדריה בנוירון6. באופן דומה, התוצאות שהתקבלו באמצעות השגרה הממוטבת הזו תואמות את הספרות, ומראות שינוי משמעותי במספר פרמטרים מיטוכונדריאליים (אורך מיטוכונדריה, שטח פנים ופוטנציאל קרום מיטוכונדריה), המבחינים בין מיטוכונדריה בנוירוט לאלה שבגוף התא (איור 3). מיטומטר יכול לזהות ולהפריד מיטוכונדריה באופן אוטומטי בהתאם למרחק מהגרעין (איור 1). זוהי תכונה מהיישוםהמקורי 9 ושימשה כפי שהיא.
אופטימיזציה זו אפשרה עיבוד מהיר של קבצי הדמיה, הפחתה משמעותית של קלט המפעיל, קריאת מסמכים, עיבוד נתונים (למהירות של 100 קבצים לדקה), הפחתת הטיה והגברת עיוורון ניסיוני. עם מערך ניסיוני זה, כל אחת מהמסגרות אורכת כדקה אחת כדי להשלים מחזור; ניתן להשיג מרווחי זמן קצרים יותר על ידי הפחתת מספר מישורי ה-z שנלכדו (אולי בליווי הגדלת מפתח הצמצם של חור הסיכה) או מספר שדות הראייה; ניתן לבצע מרווחי זמן ארוכים יותר על-ידי בחירת תקופת השהיה לפני הצילום.
התקנה ניסיונית של חמישה מיקומים עם 8 מישורי z ו-15 פריימים אורכת כ-19 דקות לכל צלחת תרבית תאים, והתוצאה היא הלבנה מינימלית (איור 4). המגבלה הניסויית העיקרית בהדמיה חיה של מיטוכונדריה היא מציאת האיזון בין מספיק מפגש כדי שתאים יהיו בריאים ודלילות שתאפשר הבחנה בין תאים, ובמיוחד בין נוירוטים. אם התאים מצופים בצורה קולחת מדי בצלחות תחתית הזכוכית, התפשטותם בתהליך ההתמיינות גורמת לתאים חופפים ולהיווצרות רשתות עצביות, קושי בהדמיה של תאים בודדים ונוירוטים וזיהוי כיוון הובלה, מיפוי רשת מיטוכונדריה מבלבל. במונחים של עיבוד, ל- MATLAB אין את אותו כוח חישוב כמו לשפות אחרות, כגון Python, אך MATLAB טובה במיוחד בעיבוד אותות, מה שהופך אותה לאידיאלית לניסויי דימות מיטוכונדריה.
פרוטוקול זה מאפשר גם הדמיה לפני ואחרי טיפול אקוטי בתמיסה נוזלית. לשם כך, יש לפתוח בזהירות את תא הדגירה של המיקרוסקופ כדי לתת גישה לצלחת תחתית הזכוכית ליישום הטיפול. זה עובד הכי טוב עם נפחים גדולים יותר (>100 μL), מכיוון שיישום הטיפול במערבולות יכול לפזר אותו לאורך כל ההכנה, בעוד שנפחים קטנים יותר ידרשו תסיסה של התכשיר, ואולי שינוי הכיוון שלו ביחס למטרה/מחזיק הצלחת. אם לא יתרחש סחף כזה, המיקומים שנרשמו בתוכנה יתייחסו לאותם תאים שצולמו לפני הטיפול, וניתן יהיה להתחיל לולאת הדמיה חדשה. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי וריאציה זו תגביר את ההלבנה, ויש להתפשר בעוצמת הלייזר הראשונית. יתר על כן, אותו פרוטוקול יכול להיות מיושם על מודלים תאיים אחרים, כגון תרביות ראשוניות עצביות6 או אפילו סוגים אחרים של תאים14, אבל זה ידרוש אופטימיזציה של החלק מיקרוסקופיה אם הדמיה של תאים ניידים יותר או לתקופות הדמיה ארוכות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
רכישת התמונה בוצעה במתקן LiM של iBiMED, צומת של PPBI (פלטפורמה פורטוגזית של BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. עבודה זו נתמכה על ידי FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), מענק ל- DT מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), מענק מ- ATG-The Gabba Alumni Association לסמנכ"ל, והמכון לביו-רפואה-iBiMED, אוניברסיטת אביירו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
