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Neuroscience

आइसोफॉर्म-विशिष्ट रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर्स द्वारा लाइव न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया होमियोस्टेसिस मॉड्यूलेशन का अनुकूलित स्वचालित विश्लेषण

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65452
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

Summary

माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क बेहद जटिल है, जिससे विश्लेषण करना बहुत चुनौतीपूर्ण हो जाता है। एक उपन्यास MATLAB उपकरण टाइमलैप्स छवियों में लाइव कॉन्फोकल इमेज वाले माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण करता है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप एक बड़ी आउटपुट वॉल्यूम होती है जिसके लिए व्यक्तिगत मैनुअल ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इस समस्या को हल करने के लिए, एक नियमित अनुकूलन विकसित किया गया था, जिससे त्वरित फ़ाइल विश्लेषण की अनुमति मिलती है।

Abstract

जटिल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क जीवित कोशिकाओं को खंडित करने, उनका पालन करने और उनका विश्लेषण करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण बनाता है। MATLAB उपकरण टाइमलैप्स फ़ाइलों में माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण की अनुमति देते हैं, छवि प्रसंस्करण की प्रक्रिया को काफी सरल और तेज करते हैं। बहरहाल, मौजूदा उपकरण एक बड़ी आउटपुट मात्रा का उत्पादन करते हैं, जिसके लिए व्यक्तिगत मैनुअल ध्यान की आवश्यकता होती है, और बुनियादी प्रयोगात्मक सेटअप में हजारों फाइलों का आउटपुट होता है, प्रत्येक को व्यापक और समय लेने वाली हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।

इन मुद्दों को हल करने के लिए, MATLAB कोड और लाइव-स्क्रिप्ट दोनों रूपों में एक नियमित अनुकूलन विकसित किया गया था, जिससे स्विफ्ट फ़ाइल विश्लेषण की अनुमति मिलती है और दस्तावेज़ पढ़ने और डेटा प्रोसेसिंग को काफी कम किया जाता है। मिनट की गति के साथ, अनुकूलन एक समग्र तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है। अनुकूलन समय सीमा के दौरान व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के लिए फ्रेम-विशिष्ट डेटा का औसत करके परिणाम आउटपुट प्राप्त करता है, एक परिभाषित तरीके से डेटा का विश्लेषण करता है, जो मौजूदा उपकरणों से उन आउटपुट के अनुरूप होता है। डाई टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर का उपयोग करके लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था, और नियमित अनुकूलन को रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर (आरएआर) एगोनिस्ट के साथ न्यूरोनल कोशिकाओं का इलाज करके मान्य किया गया था, जिनके न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया पर प्रभाव साहित्य में स्थापित होते हैं। परिणाम साहित्य के अनुरूप थे और आइसोफॉर्म-विशिष्ट आरएआर मॉड्यूलेशन के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क व्यवहार के आगे लक्षण वर्णन की अनुमति दी।

इस नई पद्धति ने पूरे-न्यूरॉन माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के तेजी से और मान्य लक्षण वर्णन की अनुमति दी, लेकिन यह अक्षतंतु और सेल बॉडी माइटोकॉन्ड्रिया के बीच भेदभाव की भी अनुमति देता है, जो तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में लागू करने के लिए एक आवश्यक विशेषता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल तेजी से अभिनय उपचार का उपयोग कर प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है, उपचार से पहले और बाद में एक ही कोशिकाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है, तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र को पार.

Introduction

सेलुलर माइटोकॉन्ड्रिया सभी शारीरिक राज्यों के केंद्र में बैठते हैं, और उनके होमोस्टैसिस (माइटोस्टेसिस) और व्यवहार की पूरी तरह से समझ कैंसर और अल्जाइमर रोग 1,2 सहित बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए औषधीय उपचार की पहचान करने में सहायता करने के लिए सर्वोपरि है।

माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा होमियोस्टेसिस, एटीपी पीढ़ी, कैल्शियम बफरिंग और आरओएस विनियमन में महत्वपूर्ण सेलुलर भूमिका निभाते हैं, और प्रोटीन होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए माइटोस्टेसिस आवश्यक है क्योंकि आणविक चैपरोन ऊर्जा-निर्भर हैं3. इन्हें सेलुलर जरूरतों को कुशलतापूर्वक पूरा करने के लिए एक निरंतर और गतिशील नेटवर्क मॉड्यूलेशन और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और माइटोकॉन्ड्रिया परिवहन को विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों द्वारा नियंत्रित किया जाता है; पिछले काम रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर्स (आरएआर)4,5की है कि एक तरह के मार्ग का वर्णन किया है. रेटिनोइक एसिड (आरए) आरएआर सक्रियण के माध्यम से एक्सोनल और न्यूराइट आउटग्रोथ को बढ़ावा देता है। माउस प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में, आरएआर -β की सक्रियता न्यूराइट6 में माइटोकॉन्ड्रियल विकास, गति और गतिशीलता को प्रोत्साहित करती है।

माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क अनुकूलनशीलता और गतिशीलता को ध्यान में रखते हुए, "वास्तविक समय" में माइटोस्टेसिस का आकलन करने की संभावना न केवल ऊर्जा होमियोस्टेसिस की जांच के लिए आवश्यक है, बल्कि प्रोटियोस्टेसिस, सेलुलर स्वास्थ्य, प्रसार या सिग्नलिंग के लिए भी आवश्यक है। माइटोस्टेसिस के मूल्यांकन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि फ्लोरोसेंट डाई या मार्कर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया को उजागर करने के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर निर्भर करती है, साथ ही तापमान और / या सीओ2 विनियमन7 की अनुमति देने वाला एक विशिष्ट माइक्रोस्कोपी सेटअप। प्रयोगात्मक सेटअप के इस प्रकार पर जोर देता है कि एक प्रयोगात्मक प्रतिकृति एक समय में प्रदर्शन किया जा. विभिन्न उपचारों की प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति के अलावा, यह माना जाना चाहिए कि अधिकांश प्रयोगों में उनकी तकनीकी प्रतिकृतियां होनी चाहिए (जहां प्रति प्लेट एक से अधिक स्थिति की कल्पना की जाती है), फोकल विमानों (जेड-स्टैक) की एक श्रृंखला के साथ समय बिंदुओं की एक श्रृंखला में दर्ज किया जा रहा है। इस प्रकार, एक नियंत्रण और दो उपचार के तीन पुनरावृत्ति के साथ एक प्रयोगात्मक डिजाइन, प्लेट प्रति पांच इमेजिंग पदों और 15 समय अंक के साथ, 225 ढेर में संसाधित किया जा करने के लिए परिणाम. शास्त्रीय रूप से, लाइव माइटोकॉन्ड्रिया के वीडियो का विश्लेषण काइमोग्राफ की साजिश रचकर किया गया था, जिसे व्यक्तिगत रूप से8 का विश्लेषण किया जाएगा, एक समय लेने वाली प्रक्रिया में व्यापक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता होती है, यहां तक कि कंप्यूटर टूल पर भरोसा करते समय भी।

एक एल्गोरिथ्म हाल ही में9 कि स्वचालित विभाजन और लाइव सेल 2 डी और 3 डी समय चूक फ़ाइलों में माइटोकॉन्ड्रिया की ट्रैकिंग की अनुमति देता है वर्णित किया गया था. अन्य परिमाणीकरण तकनीक उपलब्ध हैं, और सभी की अपनी सीमाएंहैं 10. माइटोमीटर, एक स्वचालित ओपन-सोर्स एप्लिकेशन, विशेष रूप से समय चूक और माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता विश्लेषण के लिए पर्याप्त है, जिसके लिए कम उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता होती है। इस एप्लिकेशन में अन्य मौजूदा MATLAB- आधारित उपकरणों पर फायदे की एक श्रृंखला है, अर्थात् व्यक्तिगत TIF स्टैक के स्वचालित प्रसंस्करण की अनुमति देना, 13 अलग-अलग मापदंडों का उपयोग करना, विशेष रूप से तंत्रिका विज्ञान के लिए दिलचस्प है, क्योंकि यह पेरी- और टेली-न्यूक्लियर माइटोकॉन्ड्रिया के बीच अंतर करता है।

हालांकि, ऊपर वर्णित जैसे प्रयोग के लिए, 225 स्टैक पर लागू इन 13 मापदंडों के परिणामस्वरूप 2,925 व्यक्तिगत आउटपुट फाइलें होती हैं। इनके लिए चार अलग-अलग कंप्यूटर इनपुट की आवश्यकता होती है, जो सभी आउटपुट फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए आवश्यक 10,000 से अधिक मैनुअल इनपुट तक होते हैं। बड़े प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए, इसके परिणामस्वरूप प्रत्येक फ़ाइल और डेटा एकीकरण का अनावश्यक रूप से अत्यधिक समय लेने वाला विश्लेषण होता है। यहां हम एक नियमित अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं जो तेजी से फ़ाइल विश्लेषण की अनुमति देता है, दस्तावेज़ पढ़ने और डेटा प्रोसेसिंग को बहुत कम करता है, परिभाषित तरीके से डेटा का विश्लेषण करता है, मौजूदा उपकरणों से आउटपुट के अनुरूप है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के दो मुख्य चरण हैं: एक गीला प्रयोगशाला कदम, जिसमें लाइव माइटोकॉन्ड्रिया(चित्रा 1)की छवियां प्राप्त करने के लिए सेल संस्कृति और लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी शामिल है और प्राप्त छवियों(चित्रा 2)का विश्लेषण करने के लिए सिलिको चरण में है। 3 डी लाइव इमेज्ड माइटोकॉन्ड्रिया के स्वचालित डेटा विश्लेषण के लिए, MATLAB एप्लिकेशन मिटोमीटर का उपयोग Lefebvre et al.9 द्वारा प्रदान किया गया था। रूटीन ऑप्टिमाइज़ेशन MATLAB में लिखा गया है। सॉफ्टवेयर, अद्यतन संस्करण और प्रसंस्करण ImageJ मैक्रोज़ https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB पर GitHub के माध्यम से स्वतंत्र रूप से ऑनलाइन उपलब्ध हैं।

1. लाइव माइक्रोस्कोपी

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक प्रोटोकॉल। SH-SY5Y कोशिकाओं को विभेदित किया गया और रेटिनोइड्स के साथ इलाज किया गया। (ए) टीएमआरएम का उपयोग एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उपचारित कोशिकाओं में छवि स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया को जीने के लिए किया गया था, जो पांच दृश्य क्षेत्रों के समय चूक जेड-स्टैक को कैप्चर करता था। (बी) माइटोमीटर एप्लिकेशन MATLAB स्वचालित रूप से माइटोकॉन्ड्रिया छवियों को खंडित और विश्लेषण करता है। विश्लेषण के अलावा, यह सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से परमाणु निकटता के अनुसार माइटोकॉन्ड्रिया का भेदभाव करता है। ब्लू डॉट्स माइटोकॉन्ड्रियल प्रारंभिक स्थिति हैं; लाल बिंदु अंतिम स्थिति हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: TMRM = tetramethylrhodamine, मिथाइल एस्टर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. सेल संस्कृति
    1. 5% सीओ2 और 95% हवा के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, एमईएम (न्यूनतम आवश्यक माध्यम) और एफ 12 (हैम के एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण) माध्यम के बराबर भागों में सुसंस्कृत, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक।
    2. प्लेट SH-SY5Y कोशिकाओं को ग्लास-बॉटम सेल डिश में 15 × 104 सेल/एमएल के घनत्व पर।
    3. 1% एफबीएस युक्त संस्कृति माध्यम में 10 माइक्रोन ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड के साथ 5 दिनों के उपचार के साथ कोशिकाओं को अलग करें, इसके बाद 10 Ξg/mL मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF) के साथ 2 दिनों का उपचार करें।
  2. सेल उपचार
    1. बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं और एमईएम (न्यूनतम आवश्यक माध्यम) और एफ 12 (हैम के एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण) मध्यम के बराबर भागों में 10-7 एम आरएआर-आइसोफॉर्म एगोनिस्ट के साथ 72 घंटे के लिए इलाज करें, 1% एफबीएस के साथ पूरक।
      नोट: इस्तेमाल किया गया RARα एगोनिस्ट AM580 था; RARβ एगोनिस्ट का इस्तेमाल CD2314 था; Ch55 को RARα और β सह-एगोनिस्ट के रूप में एगोनिस्ट के रूप में इस्तेमाल किया गया था; परआरए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था; BMS493 को RAR पैन-विरोधी के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
  3. लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग
    1. 45 मिनट के लिए 20 एनएम टेट्रामेथिलरोडामाइन, मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम) के साथ ताजा 1% एफबीएस युक्त संस्कृति माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें।
      नोट: टीएमआरएम एक सेल-परमेन्टेड फ्लोरोसेंट डाई है, जो सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा अनुक्रमित है, और यह इनक्यूबेशन अवधि टीएमआरएम को एक संतुलन तक पहुंचने और ध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया11द्वारा लेने की अनुमति देती है। संतुलन स्थापित होने से पहले इमेजिंग शुरू की जानी चाहिए क्योंकि टीएमआरएम सिग्नल की तीव्रता इमेजिंग के दौरान कृत्रिम रूप से बढ़ सकती है।
    2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से जुड़े इनक्यूबेटर में रखें।
    3. 63x तेल-विसर्जन एपोक्रोमैट उद्देश्य का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें, 1 हवादार इकाई के पिनहोल एपर्चर के साथ प्राप्त 512 x 512 पिक्सल के छवि आकार के साथ, प्रत्येक सेल प्लेट में पांच अलग-अलग दृश्य क्षेत्रों से 15 फ्रेम की समय श्रृंखला कैप्चर करें, और 8 समदूरस्थ जेड-विमानों का जेड-स्टैक। परिणामी .lsm फ़ाइल एक समय-, स्थिति- और z-stack है।
      नोट: लाभ, कंट्रास्ट और चमक के लिए सेटिंग्स को शुरू में डिटेक्टर की पूरी गतिशील रेंज का उपयोग करने के लिए आवश्यक न्यूनतम लेजर शक्ति का उपयोग करके अनुकूलित किया जाना चाहिए और पूरे अध्ययन में स्थिर रखा जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना कि सभी इमेजिंग समान परिस्थितियों में की जाती हैं। अप करने के लिए नौ अलग अलग पदों इस हार्डवेयर सॉफ्टवेयर संयोजन और इमेजिंग पदों के बीच खुटपट चक्र स्वचालित रूप से दर्ज किया जा सकता है.

2. छवि विश्लेषण

Figure 2
चित्रा 2: नियमित अनुकूलन। (ए) नियमित अनुकूलन का प्रतिनिधि कोड। (बी) नियमित अनुकूलन लाइव-स्क्रिप्ट। (सी) नियमित अनुकूलन वर्कफ़्लो। (डी) नियमित अनुकूलन परिणाम सत्यापन: अनुपचारित कोशिकाओं (बाएं पैनल) में माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिनिधि छवि, आरए (10-7 एम, 72 एच, मध्य पैनल) केसाथ इलाज किया जाता है, और आरएआर प्रतिपक्षी बीएमएस 493 (10-7 एम, 72 एच, दाएं पैनल) के साथ इलाज किया जाता है, टीएमआरएम (20 एनएम, 45 मिनट इनक्यूबेशन) के साथ इनक्यूबेशन के बाद इमेज। स्केल बार = 30 माइक्रोन। (ई) टीएमआरएम सेल बॉडी माइटोकॉन्ड्रिया में तीव्रता। नियंत्रण (पी = 0,0062) की तुलना में ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड उपचार (आरए, 10-7 एम, 72 एच पर) के साथ महत्वपूर्ण कमी, आरएआर विरोधी (बीएमएस 493, 10-7 एम, 72 घंटे) के साथ इलाज किए जाने पर नहीं देखा गया। पांच कोशिकाओं हालत प्रति तीन पुनरावृत्ति में से प्रत्येक से मात्रा निर्धारित की गई. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. इमेज प्रोसेसिंग
    1. ImageJ 2.1.0 में फ़ाइलें खोलें और दृश्य क्षेत्र द्वारा अलग-अलग स्थिति स्टैक: ImageJ खोलें और मेनू बार पर क्लिक करें | छवि | डुप्लिकेट | इनपुट स्लाइस/फ्रेम नंबर | ठीक पर टैप करें.
      नोट: सॉफ्टवेयर के लिए दोहराए जाने वाले इनपुट को कम करने के लिए, दृश्य क्षेत्र छवियों के दोहराव और बचत की सुविधा के लिए एक इमेजजे मैक्रो विकसित किया गया था।
  2. मैक्रो प्रोटोकॉल
    1. नि: शुल्क चयन उपकरण के साथ सेल के चारों ओर ब्याज का एक क्षेत्र (आरओआई) ड्रा करें।
    2. ImageJ खोलकर और मेनू बार पर नेविगेट करके मैक्रो चलाएँ | प्लगइन्स | मैक्रोज़ | चलाएँ पृष्ठभूमि साफ़ करें और छवियों को मैक्रो सहेजें।
      नोट: इस प्रक्रिया में छवियों को यादृच्छिक किया जा सकता है, अनुकूलन आवश्यकताओं के अनुसार समाधान कुंजी संग्रहीत करना।
    3. पिक्सेल आकार और वोक्सेल-गहराई निर्धारित करें: इमेजजे | छवि खोलें और मेनू बार पर नेविगेट करें | छवि | गुण।
  3. वैकल्पिक प्रत्यक्ष प्रोटोकॉल
    नोट:: यह विकल्प छवियों को संसाधित करने के लिए मैक्रो का उपयोग नहीं करता है
    1. पिक्सेल आकार और स्वर गहराई का पता लगाएं: ImageJ खोलें | छवि खोलें और मेनू बार पर नेविगेट करें | छवि | गुण।
    2. नि: शुल्क चयन उपकरण के साथ सेल के चारों ओर एक आरओआई ड्रा करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह पूरे सेल को 15 फ्रेम में शामिल करता है।
    3. मेनू पट्टी पर नेविगेट करें | संपादित करें | बाहर साफ़ करें।
    4. मेनू पट्टी पर नेविगेट करें | फ़ाइल | सेव-एज़ | टिफ़ का चयन करें।
    5. सेविंग फोल्डर चुनें और सेव पर क्लिक करें।
      नोट: विश्लेषण जारी रखने से पहले छवियों को इस बिंदु पर मैन्युअल रूप से अंधा/यादृच्छिक किया जा सकता है।
  4. स्वचालित छवि विश्लेषण
    1. विश्लेषण फ़ाइलों के लिए फ़ोल्डर तैयार करें।
      1. "ऑल ट्रैक", "पेरिन्यूक्लियर ट्रैक" और "टेलीन्यूक्लियर ट्रैक" शीर्षक वाले तीन मुख्य फ़ोल्डर बनाएं।
        नोट: ये मुख्य स्वचालित ट्रैक विकल्पों से मेल खाते हैं।
      2. प्रत्येक मुख्य फ़ोल्डर में, प्रत्येक छवि को संसाधित करने के लिए एक उप-फ़ोल्डर बनाएं, जिसे संख्यात्मक रूप से 1 से ऊपर की ओर पहचाना जाता है।
      3. प्रत्येक छवि फ़ोल्डर में दो नियमित अनुकूलन पूरक फ़ाइलों (mitometer2table.m और getTXTfiles.m) की एक प्रति जोड़ें।
        नोट: ये फाइलें डेटा विश्लेषण और अंतिम प्रारूप व्यवस्था में मदद करती हैं। फ़ोल्डरों की संख्या यादृच्छिक स्प्रेडशीट (.xlsx) में तत्वों की संख्या से मेल खाना चाहिए। एक डेटासेट के लिए पूरक फ़ाइलों के साथ सभी क्रमांकित सबफ़ोल्डर बनाने के बाद, उन्हें बैच-कॉपी किया जा सकता है और शेष डेटासेट में चिपकाया जा सकता है।
  5. छवियों का विश्लेषण करने के लिए MATLAB एप्लिकेशन मिटोमीटर का उपयोग करें।
    NOTE: यो प्रोटोकल माइटोमिटरमा चलाउन थियो, MATLAB R2022a मा स्थापना गरिएको थियो। इष्टतम समय और आउटपुट संतुलन के लिए 30 के बैचों में छवियों को लोड करें। अधिकतम मैट-फ़ाइल आकार मूल फ़ाइल सिस्टम द्वारा लगाया जाता है: डिफ़ॉल्ट रूप से, "सहेजें" ऑपरेशन 231 बाइट्स (~ 2 जीबी) < फ़ाइल बना सकते हैं; प्रारूप मैट फ़ाइलें संस्करण 7.3 को बचाने के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में यह अधिकतम चर आकार से बड़ा की अनुमति देता है 2 जीबी.
    1. डिफ़ॉल्ट MAT-फ़ाइल संस्करण की पहचान/परिवर्तन करें: पर्यावरण अनुभाग में होम टैब पर, वरीयताएँ क्लिक करें और MATLAB | सामान्य | मैट-फाइलें।
    2. विश्लेषण करने के लिए MATLAB टूल मिटोमीटर का उपयोग करें: MATLAB खोलें और मेनू बार पर नेविगेट करें | ऐप्स | माइटोमीटर खोलें | प्रारंभ 3D का चयन करें | इनपुट डेटा (पिक्सेल आकार (μm): 0.1395089/फ़्रेम के बीच का समय: 2/संख्या z-विमान: 8/z-विमानों के बीच अक्षीय दूरी (μm): 0.418809 | इनपुट करने के लिए छवियों का चयन करें।
    3. माइटोमीटर साइड मेनू पर जाएं, छवि का चयन करें, हाइलाइट किए गए चयन पर क्लिक करें, माइटोमीटर मेनू बार पर नेविगेट करें | ट्रैक का चयन करें | ट्रैक दृश्य | ऑल-ट्रैक, टेलीन्यूक्लियर या पेरिन्यूक्लियर का चयन करें | माइटोमीटर मेनू बार | विश्लेषण का चयन करें | एक तत्व चुनें (यानी, लंबाई) | ".txt" में सहेजें चुनें.
      नोट: एक से अधिक पैरामीटर एक बार में डाउनलोड किए जा सकते हैं, यदि सहवर्ती रूप से चुना गया हो।
    4. परिणाम फ़ाइलों को बनाए गए फ़ोल्डरों (2.2.1) में निकालें।
  6. नियमित अनुकूलन और डेटा विश्लेषण
    1. छवि एन्कोडिंग के लिए कुंजी वाली "Randomization.xlsx" फ़ाइल तैयार /
      1. स्तंभ A में, 1 से ऊपर की ओर क्रमागत पूर्णांकों की सूची सम्मिलित करें.
        नोट: मूल रूप से नामित छवियों के साथ एक डुप्लिकेट फ़ोल्डर रखने की सलाह दी जाती है।
      2. विश्लेषणात्मक चर को कॉलम बी में रखें, जो अल्फ़ान्यूमेरिक वर्णों से बना है।
        नोट: दस्तावेज़ में लाइनों की संख्या मुख्य डेटासेट में मौजूद फ़ोल्डरों की संख्या के अनुरूप होनी चाहिए। इस "Randomization.xlsx" फ़ाइल को अन्य दो मुख्य डेटासेट में कॉपी और पेस्ट करें।
    2. अनुकूलित डेटा विश्लेषण
      1. "executable.mlx" पर डबल-क्लिक करें, फ़ोल्डरों की संख्या इनपुट करें, फ़ोल्डर निर्देशिका निर्दिष्ट करें (फ़ोल्डर के शीर्ष से निर्देशिका की प्रतिलिपि बनाएँ) | सहेजें निर्देशिका (फ़ोल्डर के शीर्ष से निर्देशिका की प्रतिलिपि बनाएँ) | आउटपुट फ़ाइल में स्प्रेडशीट का नाम और रन पर क्लिक करें।
      2. आवश्यकतानुसार सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
        नोट:: विश्लेषण के अंत तक .txt डेटा और ध्वनि चेतावनी के साथ प्रत्येक फ़ोल्डर में एक .xlsx फ़ाइल का वैकल्पिक निर्माण चुना जा सकता है। लाइव स्क्रिप्ट एक एकल स्प्रेडशीट फ़ाइल को तालिका प्रारूप में आउटपुट करता है। इस आउटपुट में, कॉलम विश्लेषण किए गए मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं (उदाहरण के लिए, "मेजर एक्सिस लेंथ"; "तीव्रता") और रेखाएं विश्लेषणात्मक चर (जैसे, "नियंत्रण") के दृश्य क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करती हैं।

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Representative Results

.txt प्रारूप में आउटपुट फ़ाइलों के विश्लेषण को बढ़ाने और तेज करने के लिए, एक नियमित अनुकूलन को कोडित किया गया था जो माइटोमीटर .txt आउटपुट फ़ाइलों के अनुरूप डेटा पढ़ता है, जिसमें एक फ्रेम का प्रतिनिधित्व करने वाले कॉलम और पहचाने गए माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करने वाली रेखाएं होती हैं। नियमित अनुकूलन प्रत्येक पहचाने गए माइटोकॉन्ड्रिया के लिए फ्रेम के औसत से पैरामीटर प्रति एकल मूल्य में डेटा का उत्पादन करता है और फिर प्रति दृश्य क्षेत्र में सभी माइटोकॉन्ड्रिया के परिणामों का औसत निकालता है। विकसित दिनचर्या 1 से ऊपर की ओर गिने गए फ़ोल्डरों से फ़ाइलों को पढ़ता है। लाइव स्क्रिप्ट रूटीन ऑप्टिमाइज़ेशन एक एकल स्प्रेडशीट फ़ाइल को तालिका प्रारूप में आउटपुट करता है। इस आउटपुट में, कॉलम विश्लेषण किए गए मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं (उदाहरण के लिए, "मेजर एक्सिस लेंथ"; "तीव्रता") और रेखाएं विश्लेषणात्मक चर (जैसे, "नियंत्रण") के दृश्य क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करती हैं।

पहले प्रकाशित परिणाम प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों के सेल शरीर में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को कम करने और एक्सोनल माइटोकॉन्ड्रिया आंदोलन को आरएआरβ सक्रियण 6 के बाद बढ़ाने के लिए वर्णित करतेहैं।

इसी तरह के उपचार विभेदित न्यूरोब्लास्टोमा एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में किए गए थे, 72 घंटे(चित्रा 3)के लिए रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर एगोनिस्ट और विरोधी के साथ इलाज किया गया था। एकत्रित डेटा को गैरदिशात्मक, 2-पूंछ, 2-नमूना, समान विचरण छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके प्लॉट और विश्लेषण किया गया था। आउटपुट स्प्रेडशीट फ़ाइल में, उपयुक्त समूहों के बीच, α = 0.05 के साथ तुलना की गई थी।

Figure 3
चित्रा 3: आइसोफॉर्म-विशिष्ट रेटिनोइड सिग्नलिंग द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल होमियोस्टेसिस का विनियमन। (ए) उपचार (शीर्ष), संबंधित सतह भूखंड (मध्य), और स्वचालित विभाजन (नीचे) के बाद माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिनिधि छवि। ब्लू डॉट्स माइटोकॉन्ड्रियल प्रारंभिक स्थिति हैं; लाल बिंदु अंतिम स्थिति हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन (बी) हीटमैप माइटोकॉन्ड्रिया मापदंडों के लिए पाए गए सभी रूपों को सारांशित करता है; सेल बॉडी और न्यूराइट (दो-तरफा एनोवा, पी = 0.0158) के बीच महत्वपूर्ण विचरण पाया गया, जिसमें सभी माइटोकॉन्ड्रिया (दो-तरफा एनोवा, पी = 0.0082) में आरएआर आइसोफॉर्म-विशिष्ट मॉड्यूलेशन का महत्वपूर्ण प्रभाव था। (सी) माइटोकॉन्ड्रियल लंबाई - एएम 580 (पी = 0.0179) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी। (डी)माइटोकॉन्ड्रियल सतह क्षेत्र - AM580 (पी = 0.000406) और BMS493 (पी = 3.01 × 10-8) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कमी देखी गई। (ई)टीएमआरएम तीव्रता, माइटोकॉन्ड्रियल मात्रा के लिए सामान्यीकृत - आरए (पी = 0.00621) और सीएच 55 (पी = 0.000542) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कमी पाई गई। * पी < 0,05; ** पी < 0,01; # पी < 0,0001. पांच कोशिकाओं हालत प्रति तीन पुनरावृत्ति में से प्रत्येक से मात्रा निर्धारित की गई. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विश्लेषण से पता चलता है कि RARα एगोनिस्ट AM580 के साथ विभेदित SH-SY5Y कोशिकाओं के उपचार के परिणामस्वरूप औसत माइटोकॉन्ड्रिया लंबाई और सतह क्षेत्र में कमी आती है; विशेष रूप से आरएआरα के अलावा अन्य आइसोफॉर्म के लिए एगोनिस्ट के साथ इलाज करते समय यह प्रभाव नहीं पाया गया था, लेकिन आरएआर पैन-प्रतिपक्षी बीएमएस493 (पी = 3.01 x 10-8) के साथ उपचार के बाद माइटोकॉन्ड्रियल सतह क्षेत्र में 35.42 ± 0.5% की दिलचस्प कमी आई थी। इसके विपरीत, रेटिनोइड्स टीएमआरएम तीव्रता के संदर्भ में एक विपरीत प्रभाव पड़ता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली ध्रुवीकरण11 से संबंधित है: जबकि आरएआरα एगोनिस्ट के साथ उपचार टीएमआरएम तीव्रता में महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है , आरएआरमें आरएआर पैन-एगोनिस्ट के साथ उपचार के परिणामस्वरूप 54.82 ± 18.01% (पी = 0.00621) की नाटकीय कमी आती है। यह कमी RARα/β एगोनिस्ट CH55 (28.99 ± 4.97% कमी, p=0.000542) के साथ उपचार के बाद भी पाई जाती है, और संभवतः RARβ विशिष्ट एगोनिस्ट CD2314 (37.01 ± 28.96% कमी, p=0.09134) के साथ उपचार के बाद भी पाई जाती है। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि ने एक्सोनल माइटोकॉन्ड्रिया और सेल बॉडी में लोगों के बीच अंतर किया, जिससे आइसोफॉर्म-विशिष्ट आरएआर उत्तेजना और माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेशन के अध्ययन की अनुमति मिली।

Figure 4
चित्रा 4: इमेजिंग प्रोटोकॉल भर में न्यूनतम फोटोब्लीचिंग। (ए) जेड-स्टैक टाइमलैप्स फिजी में संसाधित किए गए थे, और औसत तीव्रता के जेड-प्रोजेक्ट अनुमानों को सभी समय बिंदुओं के लिए निर्यात किया गया था। (बी) एक ही प्रसंस्करण का एक जेड-अक्ष प्रोफ़ाइल समय के अनुसार प्लॉट किया गया था। (सी) प्रयोगात्मक सेटअप के लिए फोटोब्लीचिंग मात्रा का ठहराव। कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया (पी = 0.7607; पहले और आखिरी फ्रेम मतलब सिग्नल तीव्रता के लिए युग्मित टी-परीक्षण)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

लाइव सेल इमेजिंग बड़ी फ़ाइलों का उत्पादन करती है जिन्हें गंभीर कंप्यूटिंग प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है, लेकिन यहां तक कि सबसे हाल के उपकरणों को संसाधित करने के लिए व्यापक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता होती है। यह नियमित अनुकूलन माइटोमीटर पर माइटोकॉन्ड्रिया विश्लेषण की प्रक्रिया को सरल बनाने पर केंद्रित है क्योंकि यह उपकरण उपयोगकर्ता इनपुट और डेटा आउटपुट के बीच बहुत अच्छा संतुलन प्रस्तुत करता है। माइटोकॉन्ड्रिया छवि विश्लेषण के लिए विभिन्न उपकरणों के बीच एक व्यापक तुलना पहले10 की समीक्षा की गई है. जबकि अन्य पाइपलाइनें माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क और क्लस्टर द्रव्यमान का विश्लेषण करने या झिल्ली संभावित भिन्नता का विश्लेषण करने पर अधिक ध्यान केंद्रित करती हैं, यहां प्रस्तुत यह नई पद्धति पूरे सेल माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के तेजी से और मान्य लक्षण वर्णन की अनुमति देती है, जो अक्षतंतु और सेल बॉडी माइटोकॉन्ड्रिया के बीच भेदभाव की अनुमति देती है, तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में लागू करने के लिए एक आवश्यक विशेषता।

MATLAB एप्लिकेशन मिटोमीटर9 छवि श्रृंखला में माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण करता है: फैलाना पृष्ठभूमि श्रृंखला में हर समय-सीमा और जेड-प्लेन से घटाया जाता है, जो तब उच्च आवृत्ति शोर को खत्म करने के लिए गाऊसी कर्नेल के साथ उलझा होता है, इसके बाद एक तीव्रता सीमा होती है जिसके परिणामस्वरूप खंडित माइटोकॉन्ड्रिया का एक मुखौटा होता है। आदर्श सेटिंग्स माइटोकॉन्ड्रिया की औसत संख्या को अधिकतम करते हुए पहचाने जाते हैं जबकि माइटोकॉन्ड्रिया संख्या और चित्र के आसन्न अस्थायी फ्रेम में क्षेत्र में उतार-चढ़ाव को कम करते हैं, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियन को ट्रांसलेशनल गति के लिए पिछले फ्रेम से अपने ट्रैक को आवंटित किया जाता है।

विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं का उपयोग नियमित अनुकूलन के प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए एक न्यूरोनल मॉडल के रूप में किया गया था। यह मानव कोशिका रेखा एक सजातीय न्यूरोब्लास्ट जैसी कोशिका रेखा है जो एंजाइम गतिविधि, रिसेप्टर्स, या न्यूरोफिलामेंट्स जैसी कई न्यूरोनल जैसी विशेषताओं को व्यक्त करती है, जो आसानी से संस्कृति में फैलती है। यह मॉडल संबंधित नैतिक चिंताओं के बिना और प्राथमिक संस्कृतियों12 का उपयोग करने की तुलना में बहुत कम लागत के साथ मानव व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रयोग की अनुमति देता है. Undifferentiated SH-SY5Y छोटी प्रक्रियाओं के साथ प्रोलिफेरेटिव हैं; अनुक्रमिक रेटिनोइक एसिड और बीडीएनएफ उपचार के साथ इन कोशिकाओं का भेदभाव प्रसार को रोकता है और न्यूराइट बढ़ाव को बढ़ावा देता है, जो इन विट्रो न्यूरोनल मॉडल13 में उपयोगी प्रदान करता है।

ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (10-7 एम) का उपयोग पैन-आरएआर एगोनिस्ट के रूप में किया गया था; AM580 (10-7 M) एक RARα एगोनिस्ट है; CD2314 (10-7 M) एक RARβ एगोनिस्ट है; Ch55 (10-7 M) एक RARα और RARβ एगोनिस्ट है; BMS493 (10-7 M) एक RAR पैन-विरोधी है और इसे औषधीय नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस पद्धति को एक समान मॉडल का उपयोग करके मान्य किया गया था जिसे हाल ही में वर्णित किया गया है: न्यूरोनल कोशिकाओं में आरएआर की सक्रियता न्यूरॉन6 में माइटोकॉन्ड्रिया होमियोस्टेसिस को नियंत्रित करती है। इसी तरह, इस अनुकूलित दिनचर्या का उपयोग करके प्राप्त परिणाम साहित्य के अनुरूप हैं, कई माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों (माइटोकॉन्ड्रिया लंबाई, सतह क्षेत्र, और माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली क्षमता) में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाते हैं, कोशिका शरीर (चित्रा 3) में उन लोगों से न्यूराइट में माइटोकॉन्ड्रिया को भेदभाव करते हैं। माइटोमीटर स्वचालित रूप से नाभिक (चित्रा 1) से दूरी के अनुसार माइटोकॉन्ड्रिया को पहचान और अलग कर सकता है। यह मूल एप्लिकेशन9 की एक विशेषता है और इसका उपयोग इस प्रकार किया गया था।

इस अनुकूलन ने इमेजिंग फ़ाइलों के त्वरित प्रसंस्करण की अनुमति दी, ऑपरेटर इनपुट को काफी कम करने, दस्तावेज़ पढ़ने, डेटा प्रोसेसिंग (प्रति मिनट 100 फ़ाइलों की गति तक), पूर्वाग्रह को कम करने और प्रयोगात्मक अंधा करने में वृद्धि की। इस प्रयोगात्मक सेटअप के साथ, फ्रेम में से प्रत्येक एक चक्र को पूरा करने के लिए लगभग 1 मिनट लेता है; कैप्चर किए गए जेड-विमानों की संख्या को कम करके छोटे अंतराल प्राप्त किए जा सकते हैं (संभवतः पिनहोल एपर्चर बढ़ाने के साथ) या दृश्य क्षेत्रों की संख्या; कब्जा करने से पहले देरी अवधि का चयन करके लंबे अंतराल को पूरा किया जा सकता है।

8 जेड विमानों और 15 फ्रेम के साथ पांच पदों की एक प्रयोगात्मक सेटअप कम से कम photobleaching (चित्रा 4) में जिसके परिणामस्वरूप, सेल संस्कृति पकवान प्रति लगभग 19 मिनट लेता है. माइटोकॉन्ड्रिया लाइव इमेजिंग के साथ मुख्य प्रयोगात्मक सीमा कोशिकाओं के बीच भेदभाव की अनुमति देने के लिए स्वस्थ और विरल होने के लिए पर्याप्त संगम के बीच संतुलन ढूंढ रही है, और, विशेष रूप से, न्यूराइट्स। यदि कोशिकाओं को ग्लास-तल व्यंजनों में बहुत अधिक संगम किया जाता है, तो भेदभाव प्रक्रिया के दौरान उनके प्रसार के परिणामस्वरूप कोशिकाओं को ओवरलैप किया जाता है और न्यूराइट नेटवर्क का गठन होता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं और न्यूराइट्स की इमेजिंग में कठिनाई होती है और परिवहन दिशा की पहचान की जाती है, माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क मैपिंग को भ्रमित किया जाता है। प्रसंस्करण के संदर्भ में, MATLAB में पायथन जैसी अन्य भाषाओं के समान कम्प्यूटेशनल शक्ति नहीं है, लेकिन MATLAB सिग्नल प्रोसेसिंग में विशेष रूप से अच्छा है, जिससे यह माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग प्रयोगों के लिए आदर्श है।

यह प्रोटोकॉल तरल समाधान के साथ तीव्र उपचार से पहले और बाद में इमेजिंग की अनुमति देता है। ऐसा करने के लिए, माइक्रोस्कोप इनक्यूबेशन चैंबर ध्यान से उपचार आवेदन के लिए कांच के नीचे पकवान के लिए उपयोग देने के लिए खोला जाना चाहिए. यह बड़ी मात्रा (>100 μL) के साथ सबसे अच्छा काम करता है, क्योंकि अशांति उपचार आवेदन इसे तैयारी के दौरान वितरित कर सकता है, जबकि छोटे संस्करणों को तैयारी के आंदोलन की आवश्यकता होगी, संभवतः उद्देश्य / प्लेट धारक के सापेक्ष इसके अभिविन्यास को स्थानांतरित करना। इस तरह के कोई बहाव घटित होना चाहिए, सॉफ्टवेयर में दर्ज पदों उपचार से पहले imaged एक ही कोशिकाओं से संबंधित होगा, और एक नया इमेजिंग पाश शुरू किया जा सकता है. हालांकि, यह विचार किया जाना चाहिए कि इस भिन्नता photobleaching वृद्धि होगी, और समझौता प्रारंभिक लेजर तीव्रता में किया जाना चाहिए. इसके अलावा, इस तरह के न्यूरोनल प्राथमिक संस्कृतियों6 या यहां तक कि कोशिकाओं14 के अन्य प्रकार के रूप में अन्य सेलुलर मॉडल, के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह माइक्रोस्कोपी अनुभाग के अनुकूलन की आवश्यकता होगी अगर इमेजिंग अधिक मोबाइल कोशिकाओं या लंबे समय तक इमेजिंग अवधि के लिए.

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

छवि अधिग्रहण iBiMED की LiM सुविधा में किया गया था, PPBI (बायोइमेजिंग का पुर्तगाली प्लेटफ़ॉर्म): POCI-01-0145-FEDER-022122 का एक नोड। इस काम को FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) द्वारा समर्थित किया गया था, Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND) से DT को अनुदान, ATG-The Gabba Alumni Association से VP को अनुदान, और इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिसिन-iBiMED, यूनिवर्सिटी ऑफ एवेइरो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AM580 Sigma-Aldrich A8843
BDNF  Thermo-Fisher RP8642
BMS493 Tocris Bioscience  3409
CD2314 Tocris Bioscience 3824
Ch55 Tocris Bioscience  2020
Foetal Bovine Serum Thermo-Fisher 10270106
GraphPad Prism v4.0 GraphPad Software, La Jolla n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix Thermo-Fisher 21765029
MATLAB R2022a  MathWorks n/a
Minimal Essential Medium Thermo-Fisher 31095
Nunc Glass Bottom Dishes Thermo-Fisher 150680
Phosphate Buffer Saline Solution Thermo-Fisher 28372
Retinoic acid Sigma-Aldrich  R2625
TMRM  Thermo-Fisher T668
Zeiss LSM 510 Carl Zeiss n/a Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective 

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References

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  14. Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).

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Vitória, J. J. M., de Paula, V., da Cruz e Silva, O. A. B., Trigo, D. Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors. J. Vis. Exp. (197), e65452, doi:10.3791/65452 (2023).

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