Summary
Det mitokondrielle nettverket er ekstremt komplekst, noe som gjør det svært utfordrende å analysere. Et nytt MATLAB-verktøy analyserer levende konfokale avbildede mitokondrier i timelapse-bilder, men resulterer i et stort utgangsvolum som krever individuell manuell oppmerksomhet. For å løse dette problemet ble det utviklet en rutinemessig optimalisering som muliggjorde rask filanalyse.
Abstract
Det komplekse mitokondrielle nettverket gjør det svært utfordrende å segmentere, følge og analysere levende celler. MATLAB-verktøy gjør det mulig å analysere mitokondrier i timelapse-filer, noe som forenkler og fremskynder prosessen med bildebehandling betydelig. Ikke desto mindre produserer eksisterende verktøy et stort utskriftsvolum som krever individuell manuell oppmerksomhet, og grunnleggende eksperimentelle oppsett har tusenvis av filer, som hver krever omfattende og tidkrevende håndtering.
For å løse disse problemene ble det utviklet en rutineoptimalisering, både i MATLAB-kode og live-script-skjemaer, noe som muliggjorde rask filanalyse og betydelig reduksjon av dokumentlesing og databehandling. Med en hastighet på 100 filer/min tillater optimaliseringen en samlet rask analyse. Optimaliseringen oppnår resultatene ved å beregne gjennomsnitt av rammespesifikke data for individuelle mitokondrier gjennom tidsrammer, analysere data på en definert måte, i samsvar med de som sendes ut fra eksisterende verktøy. Levende konfokal avbildning ble utført ved bruk av fargestofftetrametylrhodaminmetylesteren, og rutineoptimaliseringen ble validert ved å behandle nevronceller med retinsyrereseptoragonister, hvis effekter på nevronale mitokondrier er etablert i litteraturen. Resultatene var i samsvar med litteraturen og tillot ytterligere karakterisering av mitokondrienettverksadferd som respons på isoformspesifikk RAR-modulering.
Denne nye metoden tillot rask og validert karakterisering av hele neuron mitokondrier nettverk, men det tillater også differensiering mellom axon og cellelegeme mitokondrier, en viktig funksjon å anvende i nevrovitenskapsfeltet. Videre kan denne protokollen brukes på eksperimenter ved hjelp av hurtigvirkende behandlinger, slik at avbildning av de samme cellene før og etter behandlinger, overskrider nevrovitenskapsområdet.
Introduction
Cellulære mitokondrier sitter i sentrum av alle fysiologiske tilstander, og en grundig forståelse av deres homeostase (mitostase) og oppførsel er avgjørende for å hjelpe til med å identifisere farmakologisk behandling for et bredt spekter av sykdommer, inkludert kreft og Alzheimers sykdom 1,2.
Mitokondrier spiller avgjørende cellulære roller i energihomeostase, ATP-generering, kalsiumbuffering og ROS-regulering, og mitostase er avgjørende for å opprettholde proteinhomeostase, da molekylære chaperoner er energiavhengige3. Disse krever en konstant og dynamisk nettverksmodulasjon og tilpasning for effektivt å møte cellulære behov, og mitokondrietransport reguleres av forskjellige signalveier; Tidligere arbeid har beskrevet en slik vei, den for retinsyrereseptorer (RARs)4,5. Retinsyre (RA) fremmer aksonal og nevrittutvekst via RAR-aktivering. I primære kortikale nevroner fra mus oppmuntrer aktivering av RAR-β mitokondriell vekst, hastighet og mobilitet i nevitt6.
Med tanke på mitokondrienettverkets tilpasningsevne og dynamikk, er muligheten for å vurdere mitostase i "sanntid" viktig, ikke bare for å undersøke energihomeostase, men også for proteostase, cellulær helse, spredning eller signalering. En vanlig metode for evaluering av mitostase er avhengig av konfokalmikroskopi etter å ha fremhevet mitokondrier ved hjelp av et fluorescerende fargestoff eller markør, samt et spesifikt mikroskopioppsett som tillater temperatur og / eller CO2 -regulering7. Denne typen eksperimentelt oppsett innebærer at en eksperimentell replikasjon utføres om gangen. I tillegg til eksperimentell repetisjon av forskjellige behandlinger, bør det tas i betraktning at de fleste eksperimenter bør ha sine tekniske replikater (hvor mer enn én posisjon er avbildet per plate), med en serie fokalplan (z-stabler) som registreres i en rekke tidspunkter. Dermed resulterer et eksperimentelt design med tre repetisjoner av en kontroll og to behandlinger, med fem avbildningsposisjoner per plate og 15 tidspunkter, i 225 stabler som skal behandles. Klassisk ble videoer av levende mitokondrier analysert ved å plotte kymographs, som ville bli individuelt analysert8, i en tidkrevende prosess som krever omfattende manuell inngang, selv når man stoler på dataverktøy.
En algoritme ble nylig beskrevet9 som tillater automatisert segmentering og sporing av mitokondrier i live-celle 2-D og 3-D time-lapse-filer. Andre kvantifiseringsteknikker er tilgjengelige, og alle har sine begrensninger10. Mitometer, en automatisert åpen kildekode-applikasjon, er spesielt tilstrekkelig for tidsforløp og mitokondriedynamikkanalyse, og krever lav brukerinngang. Denne applikasjonen har en rekke fordeler i forhold til andre eksisterende MATLAB-baserte verktøy, nemlig å tillate automatisk behandling av individuelle TIF-stabler, ved hjelp av opptil 13 forskjellige parametere, spesielt interessant for nevrovitenskap, da det skiller mellom peri- og telenukleære mitokondrier.
Men for et eksperiment som beskrevet ovenfor, resulterer disse 13 parametrene som brukes på 225 stabler i 2,925 individuelle utdatafiler. Disse krever fire individuelle datamaskininnganger, som summerer opp til over 10.000 manuelle innganger som kreves for å laste ned alle utdatafiler. For store eksperimentelle design resulterer dette i en unødvendig ekstremt tidkrevende analyse av hver fil og dataintegrasjon. Her presenterer vi en rutinemessig optimalisering som muliggjør rask filanalyse, reduserer dokumentlesing og databehandling, analyserer data på en definert måte, i samsvar med utdataene fra eksisterende verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen har to hovedtrinn: et vått laboratorietrinn, som involverer cellekultur og levende konfokalmikroskopi for å oppnå bilder av levende mitokondrier (figur 1) og et in silico-trinn for å analysere innhentede bilder (figur 2). For automatisert dataanalyse av 3D-levende bildemitokondrier ble MATLAB-applikasjonen Mitometer brukt som levert av Lefebvre et al.9. Rutineoptimaliseringen er skrevet i MATLAB. Programvaren, oppdaterte versjoner og prosessering av ImageJ-makroer er fritt tilgjengelig online via GitHub, på https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. Levende mikroskopi
Figur 1: Eksperimentell protokoll. SH-SY5Y-celler ble differensiert og behandlet med retinoider. (A) TMRM ble brukt til å leve bilde sunne mitokondrier i behandlede celler ved hjelp av et konfokalmikroskop, og fanget en tidsforløp z-stabel med fem visuelle felt. (B) Mitometer-applikasjon MATLAB segmenterer og analyserer automatisk mitokondriebilder. I tillegg til å analysere, diskriminerer denne programvaren automatisk mitokondrier i henhold til kjernefysisk nærhet. Blå prikker er mitokondrielle startposisjoner; Røde prikker er endelige posisjoner. Skala bar = 30 μm. Forkortelse: TMRM = tetrametylrhodamin, metylester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Cellekultur
- Inkuber SH-SY5Y-celler ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5% CO2 og 95% luft, dyrket i like deler av MEM (Minimal Essential Medium) og F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, supplert med 10% føtal bovint serum (FBS).
- Plate SH-SY5Y-celler i glassbunncellefat med en tetthet på 15 × 104 celler / ml.
- Differensiere celler med 5 dagers behandling med 10 μM all-trans retinsyre i 1% FBS-holdig kulturmedium, etterfulgt av 2 dagers behandling med 10 ƞg / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF).
- Celle behandling
- Vask celler med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) og behandle i 72 timer med 10-7 M RAR-isoformagonister, i like deler av MEM (Minimal Essential Medium) og F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, supplert med 1% FBS.
MERK: RARα-agonisten som ble brukt var AM580; RARβ-agonist som ble brukt var CD2314; Ch55 ble brukt som agonist som RARα og β co-agonist; påRA ble brukt som en positiv kontroll; BMS493 ble brukt som RAR-panantagonist.
- Vask celler med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) og behandle i 72 timer med 10-7 M RAR-isoformagonister, i like deler av MEM (Minimal Essential Medium) og F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, supplert med 1% FBS.
- Live konfokal avbildning
- Erstatt kulturmedium med friskt 1% FBS-holdig kulturmedium med 20 nM tetrametylrhodamin, metylester (TMRM) i 45 minutter.
MERK: TMRM er et celle-perment fluorescerende fargestoff, sekvestrert av aktive mitokondrier, og denne inkubasjonsperioden tillater TMRM å nå en likevekt og bli tatt opp av polariserte mitokondrier11. Avbildning bør startes før likevekt er etablert, da TMRM-signalintensiteten kan kunstig øke under avbildning. - Plasser cellene i en inkubator festet til et laserskanning konfokalmikroskop ved 37 ° C.
- Ta bilder med et 63x olje-nedsenking apokromatmål, med en bildestørrelse på 512 x 512 piksler oppnådd med en pinhole-blenderåpning på 1 luftig enhet, fange en tidsserie på 15 bilder fra fem forskjellige visuelle felt i hver celleplate, og en z-stabel med 8 like langt z-plan. Den resulterende LSM-filen er en klokkeslett-, posisjons- og z-stakk.
MERK: Innstillinger for forsterkning, kontrast og lysstyrke må i utgangspunktet optimaliseres ved hjelp av den minste laserkraften som er nødvendig for å bruke hele detektorens dynamiske område, og holdes konstant gjennom hele studien, slik at all avbildning utføres under de samme forholdene. Opptil ni forskjellige posisjoner kan registreres i denne maskinvare-programvarekombinasjonen og mikroskopsyklusene mellom bildeposisjoner automatisk.
- Erstatt kulturmedium med friskt 1% FBS-holdig kulturmedium med 20 nM tetrametylrhodamin, metylester (TMRM) i 45 minutter.
2. Bildeanalyse
Figur 2: Rutineoptimalisering. (A) Representativ kode for rutineoptimalisering. (B) Rutinemessig optimalisering Live-Script. (C) Rutinemessig optimaliseringsarbeidsflyt. (D) Rutinemessig optimaliseringsresultatvalidering: representativt bilde av mitokondrier i ubehandlede celler (venstre panel), behandlet med vedRA (10-7 M, 72 timer, midtpanel) og behandlet med RAR-antagonist BMS493 (10-7 M, 72 timer, høyre panel), avbildet etter inkubasjon med TMRM (20 nM, 45 min inkubasjon). Skala bar = 30 μm. (E) TMRM Intensitet i cellelegemets mitokondrier. Signifikant reduksjon med all-trans retinsyrebehandling (vedRA, 10-7 M, 72 timer), sammenlignet med kontroll (p = 0,0062), ikke observert ved behandling med RAR-antagonist (BMS493, 10-7 M, 72 timer). Fem celler ble kvantifisert fra hver av tre repetisjoner per tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Bildebehandling
- Åpne filer i ImageJ 2.1.0 og separate posisjonsstakker etter visuelt felt: Åpne ImageJ og klikk Menylinje | Bilde | Dupliser | Inngangsstykker/rammenummer | OK.
MERK: For å redusere repeterende innganger til programvaren, ble en ImageJ-makro utviklet for å lette duplisering og lagring av visuelle feltbilder.
- Åpne filer i ImageJ 2.1.0 og separate posisjonsstakker etter visuelt felt: Åpne ImageJ og klikk Menylinje | Bilde | Dupliser | Inngangsstykker/rammenummer | OK.
- Makro-protokoll
- Tegn et interesseområde (ROI) rundt cellen med det frie markeringsverktøyet.
- Kjør makroen ved å åpne ImageJ og navigere til menylinjen | Plugins | Makroer | Kjør Slett bakgrunnen og lagre bilder makro.
MERK: Bilder kan randomiseres i denne prosessen, og lagrer løsningsnøkkelen i henhold til optimaliseringskrav. - Bestem pikselstørrelse og voxel-dybde: Åpne ImageJ | bildet og naviger til menylinjen | Bilde | Eiendommer.
- Alternativ direkte protokoll
Dette alternativet bruker ikke makro til å behandle bilder- Finn pikselstørrelse og voxeldybde: Åpne ImageJ | Åpne bilde og naviger til menylinjen | Bilde | Eiendommer.
- Tegn en avkastning rundt cellen med det frie markeringsverktøyet, slik at det omfatter hele cellen gjennom de 15 rammene.
- Naviger til menylinjen | Rediger | Klar utenfor.
- Naviger til menylinjen | Fil | Lagre-som | Velg Tiff.
- Velg Lagre mappe og klikk på Lagre.
MERK: Bilder kan blindes / randomiseres manuelt på dette tidspunktet før du fortsetter å analysere.
- Automatisert bildeanalyse
- Klargjør mappene for analysefiler.
- Opprett tre hovedmapper, med tittelen "Alle spor", "Perinukleære spor" og "Telenukleære spor".
MERK: Disse samsvarer med de viktigste automatiserte sporalternativene. - I hver hovedmappe oppretter du en undermappe for hvert bilde som skal behandles, identifisert numerisk fra 1 og oppover.
- Legg til en kopi av de to tilleggsfilene for rutineoptimalisering (mitometer2table.m og getTXTfiles.m) i hver bildemappe.
MERK: Disse filene hjelper til med dataanalyse og endelig formatarrangement. Antall mapper må samsvare med antall elementer i det randomiserte regnearket (.xlsx). Når du har opprettet alle nummererte undermapper med tilleggsfiler for ett datasett, kan de kopieres og limes inn i de gjenværende datasettene.
- Opprett tre hovedmapper, med tittelen "Alle spor", "Perinukleære spor" og "Telenukleære spor".
- Klargjør mappene for analysefiler.
- Bruk MATLAB-applikasjonen Mitometer for å analysere bilder.
MERK: Denne protokollen ble kjørt på et mitometer, installert på MATLAB R2022a. Last inn bilder i grupper på 30 for optimal tidskjøring og utskriftsbalanse. Maksimal MAT-filstørrelse pålegges av det opprinnelige filsystemet: Som standard kan "lagre" -operasjoner opprette en fil < 231 byte (~ 2 GB); lagringsformat MAT-Files versjon 7.3 kan brukes i stedet, da det tillater maksimale variable størrelser større enn 2 GB.- Identifisere/endre standard MAT-filversjon: Klikk på Innstillinger i kategorien Hjem i Miljø-delen, og velg MATLAB | Generelt | MAT-filer.
- Bruk MATLAB-verktøyet Mitometer til å analysere: Åpne MATLAB og naviger til menylinjen | APPER | Åpne Mitometer | Velg Start 3D | Inndata (Pikselstørrelse (μm): 0,1395089/Tid mellom bilder (er): 2/Antall z-plan: 8/Aksial avstand mellom z-plan (μm): 0,418809 | Velg bildene du vil legge inn.
- Gå til Mitometer sidemeny, velg Bilde, klikk på Velg uthevet, naviger til mitometeret Menylinje | Velg spor | Spore visninger | velg All-Tracks, Telenuclear eller Perinuclear | mitometer Menylinje | Velg analyse | Velg et element (dvs. lengde) | velg Lagre i ".txt".
MERK: Mer enn én parameter kan lastes ned samtidig, hvis valgt samtidig. - Pakk ut resultatfiler til de opprettede mappene (2.2.1).
- Rutinemessig optimalisering og dataanalyse
- Forbered / tilpass "Randomization.xlsx" -filen som inneholder nøkkelen for bildekoding.
- Sett inn en liste over etterfølgende heltall, fra 1 og oppover, i kolonne A.
MERK: Det anbefales å beholde en duplisert mappe med opprinnelig navngitte bilder. - Plasser analysevariablene i kolonne B, som består av alfanumeriske tegn.
MERK: Antall linjer i dokumentet må være konsistent med antall mapper som finnes i hoveddatasettet. Kopier og lim inn denne "Randomization.xlsx" -filen i de to andre hoveddatasettene.
- Sett inn en liste over etterfølgende heltall, fra 1 og oppover, i kolonne A.
- Optimalisert dataanalyse
- Dobbeltklikk "executable.mlx", skriv inn antall mapper, angi mappene katalogen (kopiere katalogen fra toppen av mappen) | lagre katalogen (kopiere katalogen fra toppen av mappen) | regnearknavnet i utdatafilen og klikk Kjør.
- Utfør statistisk analyse etter behov.
MERK: Valgfri opprettelse av en .xlsx-fil i hver mappe med .txt data og lydvarsel til slutten av analysen kan velges. Live Script sender ut én enkelt regnearkfil i et tabellformat. I denne utdataene representerer kolonner analyserte parametere (f.eks . "Intensitet") og linjer representerer visuelle felt av analytiske variabler (f.eks.
- Forbered / tilpass "Randomization.xlsx" -filen som inneholder nøkkelen for bildekoding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å forbedre og akselerere analysen av utdatafiler i .txt format, ble en rutinemessig optimalisering kodet som leser data konsistent med Mitometer .txt utdatafiler, med kolonner som representerer en ramme og linjer som representerer identifiserte mitokondrier. Den rutinemessige optimaliseringen produserer data i en enkelt verdi per parameter ved å beregne gjennomsnittet av rammene for hver identifiserte mitokondrier og deretter gjennomsnitt av resultatene av alle mitokondrier per synsfelt. Den utviklede rutinen leser filer fra mapper nummerert fra 1 og oppover. Live Script Routine Optimization sender ut én enkelt regnearkfil i et tabellformat. I denne utdataene representerer kolonner analyserte parametere (f.eks . "Intensitet") og linjer representerer visuelle felt av analytiske variabler (f.eks .
Tidligere publiserte resultater beskriver mitokondriemembranpotensialet i cellekroppen til primære nevronkulturer for å redusere og aksonale mitokondriebevegelser for å øke etter RAR-β aktivering6.
Tilsvarende behandling ble utført i differensierte SH-SY5Y-celler i nevroblastom, behandlet med retinsyrereseptoragonister og antagonister i 72 timer (figur 3). Innsamlede data ble plottet og analysert ved hjelp av ikke-retningsbestemt, 2-halet, 2-utvalg, lik varians Student t-test. I regnearkfilen ble det gjort sammenligninger mellom aktuelle grupper med α = 0,05.
Figur 3: Regulering av mitokondriell homeostase ved isoformspesifikk retinoidsignalering. (A) Representativt bilde av mitokondrier etter behandling (øverst), respektive overflateplott (midten) og automatisert segmentering (nederst). Blå prikker er mitokondrielle startposisjoner; Røde prikker er endelige posisjoner. Skalastenger = 30 μm. (B) Varmekart som oppsummerer alle variasjoner funnet til mitokondrieparametere; Det ble funnet signifikant varians mellom cellekroppen og nevritt (toveis ANOVA, p=0,0158), med signifikant påvirkning av RAR-isoformspesifikk modulasjon i alle mitokondrier (toveis ANOVA, p=0,0082). (C) Mitokondriell lengde - en signifikant reduksjon ble observert hos celler behandlet med AM580 (p = 0,0179). (D) Mitokondriell overflateareal - signifikant reduksjon ble observert i celler behandlet med AM580 (p = 0,000406) og med BMS493 (p = 3,01 × 10-8). (E) TMRM-intensitet, normalisert for mitokondrievolum - signifikant reduksjon ble funnet i celler behandlet med RA (p = 0,00621) og Ch55 (p = 0,000542). * p < 0,05; ** p < 0,01; # p < 0,0001. Fem celler ble kvantifisert fra hver av tre repetisjoner per tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Analyse viser at behandling av differensierte SH-SY5Y-celler med RARα agonist AM580 resulterer i en reduksjon i gjennomsnittlig mitokondrielengde og overflateareal; Denne effekten ble ikke funnet ved behandling med agonister for andre isoformer enn utelukkendeRAR-α, men det var en interessant reduksjon på 35,42 ± 0,5 % i mitokondrieoverflaten etter behandling med RAR-panantagonist BMS493 (p = 3,01 x 10-8). I motsetning til dette synes retinoider å ha en motsatt effekt når det gjelder TMRM-intensitet, som relaterer seg til mitokondriemembranpolarisering11: mens behandling med RAR α-agonist ikke ser ut til å ha en signifikant effekt i TMRM-intensitet, resulterer behandling med RAR-panagonist vedRA i en dramatisk reduksjon på 54,82 ± 18,01% (p = 0,00621). Denne reduksjonen er også funnet etter behandling med RARα/β agonist CH55 (28,99 ± 4,97 % reduksjon, p=0,000542), og muligens også etter behandling med RARβ spesifikk agonist CD2314 (37,01 ± 28,96 % reduksjon, p=0,09134). Det er viktig at denne metoden differensiert mellom aksonale mitokondrier og de i cellekroppen, noe som muliggjorde studiet av isoformspesifikk RAR-stimulus og mitokondriell modulering.
Figur 4: Minimal fotobleking gjennom avbildningsprotokollen. (A) Z-stack timelapses ble behandlet i FIJI, og z-prosjekt projeksjoner av gjennomsnittlig intensitet ble eksportert for alle tidspunkter. (B) En z-akseprofil av samme prosessering ble plottet i henhold til tid. (C) Fotobleking kvantifisering for eksperimentelt oppsett. Ingen signifikante endringer ble observert (p = 0,7607; paret t-test for første og siste bilde gjennomsnittlig signalintensitet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live cell imaging produserer store filer som krever seriøs databehandling, men selv de nyeste verktøyene krever omfattende manuell input for å behandle. Denne rutinemessige optimaliseringen er fokusert på å forenkle prosessen med mitokondrieanalyse på Mitometer fordi dette verktøyet gir en veldig god balanse mellom brukerinngang og datautgang. En omfattende sammenligning mellom ulike verktøy for mitokondriebildeanalyse er tidligere gjennomgått10. Mens andre rørledninger er mer fokusert på å analysere mitokondrienettverk og klyngemasse eller analysere membranpotensialvariasjon, tillater denne nye metoden her presentert rask og validert karakterisering av helcelle mitokondrienettverk, noe som også muliggjør differensiering mellom akson- og cellelegememitokondrier, en viktig funksjon å anvende i nevrovitenskapsfeltet.
MATLAB-applikasjonen Mitometer9 analyserer mitokondrier i bildeserier: diffus bakgrunn trekkes fra hvert tidsbilde og z-plan i serien, som deretter vikles med en gaussisk kjerne for å eliminere høyfrekvent støy, etterfulgt av en intensitetsterskel som resulterer i en maske av de segmenterte mitokondriene. De ideelle innstillingene maksimerer medianantallet mitokondrier som er identifisert, samtidig som svingningene i mitokondrieantall og område over tilstøtende temporale rammer i bildet minimeres, med en mitokondrie som tildeles sporet fra forrige ramme for translasjonsbevegelse.
Differensierte SH-SY5Y-celler ble brukt som en nevronmodell for eksperimentell validering av rutineoptimaliseringen. Denne humane cellelinjen er en homogen neuroblastlignende cellelinje som uttrykker flere nevronlignende egenskaper, for eksempel enzymaktivitet, reseptorer eller nevrofilamenter, som lett prolifererer i kultur. Denne modellen tillater eksperimentering av menneskeavledede celler uten tilhørende etiske bekymringer og med mye lavere kostnader enn å bruke primære kulturer12. Udifferensiert SH-SY5Y er proliferativ, med korte prosesser; differensiering av disse cellene med sekvensiell retinsyre og BDNF-behandling stopper spredning og fremmer nevrittforlengelse, noe som gir en nyttig in vitro neuronal modell13.
All-trans retinsyre (10-7 M) ble brukt som en pan-RAR-agonist; AM580 (10-7 M) er en RARα agonist; CD2314 (10-7 M) er en RARβ agonist; Ch55 (10-7 M) er en RARα og RARβ agonist; BMS493 (10-7 M) er en RAR pan-antagonist og ble brukt som farmakologisk kontroll. Denne metoden ble validert ved hjelp av en lignende modell som nylig er beskrevet: aktiveringen av RAR i nevronceller regulerer mitokondriehomeostase i nevronet6. På samme måte er resultatene oppnådd ved hjelp av denne optimaliserte rutinen i samsvar med litteraturen, og viser signifikant endring i flere mitokondrielle parametere (mitokondrielengde, overflateareal og mitokondriemembranpotensial), diskriminerende mitokondrier i nevritten fra de i cellekroppen (figur 3). Mitometer kan automatisk identifisere og separere mitokondrier etter avstand fra kjernen (figur 1). Dette er en funksjon fra den opprinnelige applikasjonen9 og ble brukt som den er.
Denne optimaliseringen tillot rask behandling av bildefiler, noe som betydelig reduserte operatørinngang, dokumentlesing, databehandling (til en hastighet på 100 filer per minutt), reduserte skjevhet og økte eksperimentell blinding. Med dette eksperimentelle oppsettet tar hver av rammene omtrent 1 min å fullføre en syklus; Kortere intervaller kan oppnås ved å redusere antall Z-plan fanget (muligens ledsaget av økende pinhole blenderåpning) eller antall visuelle felt; Lengre intervaller kan oppnås ved å velge en forsinkelsesperiode før opptak.
Et eksperimentelt oppsett med fem posisjoner med 8 z-plan og 15 bilder tar ca. 19 minutter per cellekulturskål, noe som resulterer i minimal fotobleking (figur 4). Den viktigste eksperimentelle begrensningen med mitokondrier live imaging er å finne balansen mellom nok sammenløp for celler å være sunn og sparsity for å tillate diskriminering mellom celler, og spesielt nevritter. Hvis celler blir belagt for konfluent i glassbunnsfatene, resulterer deres spredning under differensieringsprosessen i overlappende celler og dannelse av nevrittnettverk, vanskeligheter med å avbilde individuelle celler og nevritter og identifisere transportretning, forvirrende mitokondrienettverkskartlegging. Når det gjelder prosessering, har MATLAB ikke samme beregningskraft som andre språk, for eksempel Python, men MATLAB er spesielt god på signalbehandling, noe som gjør den ideell for mitokondrieavbildningseksperimenter.
Denne protokollen tillater også avbildning før og etter akutt behandling med flytende løsning. For å gjøre dette må mikroskopets inkubasjonskammer åpnes forsiktig for å gi tilgang til glassbunnsfatet for behandlingsapplikasjon. Dette fungerer best med større volumer (>100 μL), da applikasjonen for turbulensbehandling kan distribuere den gjennom hele preparatet, mens mindre volumer vil kreve omrøring av preparatet, muligens skifte orientering i forhold til målet/plateholderen. Skulle ingen slik drift oppstå, vil posisjonene som er registrert i programvaren forholde seg til de samme cellene som er avbildet før behandling, og en ny bildesløyfe kan initieres. Det bør imidlertid vurderes at denne variasjonen vil øke fotobleking, og kompromisser må gjøres i innledende laserintensitet. Videre kan denne samme protokollen brukes på andre cellulære modeller, for eksempel neuronale primære kulturer6 eller til og med andre typer celler14, men det vil kreve optimalisering av mikroskopiseksjonen hvis du avbilder flere mobile celler eller for lengre bildebehandlingsperioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Bildeinnsamling ble utført i LiM-anlegget til iBiMED, en node av PPBI (portugisisk plattform for BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dette arbeidet ble støttet av FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), et tilskudd til DT fra Fundação para a Ciência e Tecnologia fra Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), et stipend fra ATG-The Gabba Alumni Association til VP, og Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
