Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogeler i makroskala

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi to protokoller til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogelmatricer i makroskala uden behov for en ekstern væskefase.

Abstract

Syntetiske gennetværk giver en platform for forskere og ingeniører til at designe og bygge nye systemer med funktionalitet kodet på et genetisk niveau. Mens det dominerende paradigme for udbredelsen af gennetværk er inden for et cellulært chassis, kan syntetiske gennetværk også anvendes i cellefrie miljøer. Lovende anvendelser af cellefrie gennetværk inkluderer biosensorer, da disse enheder er blevet demonstreret mod biotiske (Ebola-, Zika- og SARS-CoV-2-vira) og abiotiske (tungmetaller, sulfider, pesticider og andre organiske forurenende stoffer) mål. Cellefrie systemer implementeres typisk i flydende form i en reaktionsbeholder. At være i stand til at integrere sådanne reaktioner i en fysisk matrix kan imidlertid lette deres bredere anvendelse i et bredere sæt miljøer. Til dette formål er der udviklet metoder til indlejring af cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner i en række hydrogelmatricer. En af de vigtigste egenskaber ved hydrogeler, der bidrager til dette arbejde, er hydrogelmaterialernes højvandsrekonstitutionskapacitet. Derudover har hydrogeler fysiske og kemiske egenskaber, der er funktionelt gavnlige. Hydrogeler kan frysetørres til opbevaring og rehydreres til senere brug. To trinvise protokoller til inkludering og analyse af CFPS-reaktioner i hydrogeler præsenteres. For det første kan et CFPS-system inkorporeres i en hydrogel via rehydrering med et cellelysat. Systemet i hydrogelen kan derefter induceres eller udtrykkes konstitutivt for fuldstændig proteinekspression gennem hydrogelen. For det andet kan cellelysat indføres i en hydrogel ved polymerisationspunktet, og hele systemet kan frysetørres og rehydreres på et senere tidspunkt med en vandig opløsning indeholdende induceren til ekspressionssystemet kodet i hydrogelen. Disse metoder har potentialet til at muliggøre cellefrie gennetværk, der giver sensoriske evner til hydrogelmaterialer, med potentiale for udbredelse uden for laboratoriet.

Introduction

Syntetisk biologi integrerer forskellige tekniske discipliner til at designe og konstruere biologisk baserede dele, enheder og systemer, der kan udføre funktioner, der ikke findes i naturen. De fleste syntetiske biologiske tilgange er stadig bundet til levende celler. I modsætning hertil muliggør cellefrie syntetiske biologiske systemer hidtil usete niveauer af kontrol og frihed i design, hvilket muliggør øget fleksibilitet og en forkortet tid til konstruktion af biologiske systemer, samtidig med at mange af begrænsningerne ved traditionelle cellebaserede genekspressionsmetoder elimineres1,2,3. CFPS anvendes i et stigende antal applikationer på tværs af adskillige discipliner, herunder konstruktion af kunstige celler, prototypning af genetiske kredsløb, udvikling af biosensorer og produktion af metabolitter 4,5,6. CFPS har også været særlig nyttig til fremstilling af rekombinante proteiner, der ikke let kan udtrykkes i levende celler, såsom aggregeringstilbøjelige proteiner, transmembranproteiner og toksiske proteiner 6,7,8.

CFPS udføres typisk i flydende reaktioner. Dette kan dog begrænse deres anvendelse i nogle situationer, da enhver flydende cellefri enhed skal være indeholdt i en reaktionsbeholder. Begrundelsen for udviklingen af de metoder, der præsenteres her, var at tilvejebringe robuste protokoller til indlejring af cellefrie syntetiske biologiske enheder i hydrogeler, ikke som en proteinproduktionsplatform i sig selv, men i stedet for at tillade brugen af hydrogeler som et fysisk chassis til implementering af cellefrie enheder uden for laboratoriet. Brugen af hydrogeler som CFPS-chassis har flere fordele. Hydrogeler er polymere materialer, der på trods af et højt vandindhold (undertiden over 98%) har faste egenskaber 9,10,11. De har anvendelser som pastaer, smøremidler og klæbemidler og er til stede i produkter så forskellige som kontaktlinser, sårforbindinger, marine klæbebånd, jordforbedringsmidler og babybleer 9,11,12,13,14. Hydrogels er også under aktiv efterforskning som narkotikaleveringskøretøjer 9,15,16,17. Hydrogeler kan også være biokompatible, biologisk nedbrydelige og have nogle stimuliresponser af deres egne 9,18,19,20. Derfor er målet her at skabe synergi mellem molekylærbiologisk afledt funktionalitet og materialevidenskab. Til dette formål er der gjort en indsats for at integrere cellefri syntetisk biologi med en række materialer, herunder kollagen, laponit, polyacrylamid, fibrin, PEG-peptid og agarose 11,21,22 samt at belægge overflader af glas, papir og klud 11,23,24 med CFPS-enheder. De protokoller, der præsenteres her, demonstrerer to metoder til indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogelmatricer i makroskala (dvs. >1 mm) ved hjælp af agarose som eksempelmateriale. Agarose blev valgt på grund af dets høje vandabsorptionskapacitet, kontrollerede selvgeleringsegenskaber og justerbare mekaniske egenskaber 11,24,25,26. Agarose understøtter også funktionel CFPS, er billigere end mange andre hydrogelalternativer og er biologisk nedbrydelig, hvilket gør det til et attraktivt valg som et eksperimentelt modelsystem. Disse metoder er imidlertid tidligere blevet påvist som egnede til indlejring af CFPS i en række alternative hydrogeler11. I betragtning af den brede vifte af anvendelser af hydrogeler og funktionaliteten af CFPS kan de metoder, der demonstreres her, danne grundlag for, at forskere er i stand til at udvikle biologisk forbedrede hydrogelmaterialer, der passer til deres egne formål.

I tidligere undersøgelser er mikrogelsystemer med et størrelsesinterval fra 1 μm til 400 μm blevet anvendt til at udføre CFPS i hydrogeler nedsænket i reaktionsbuffer 23,27,28,29,30,31. Kravet om at nedsænke hydrogeler i CFPS-reaktionsbuffere begrænser imidlertid mulighederne for deres anvendelse som materialer i sig selv. De protokoller, der præsenteres her, tillader CFPS-reaktioner at forekomme i hydrogeler uden behov for at nedsænke gelerne i reaktionsbuffere. For det andet tillader brugen af makroskalageler (mellem 2 mm og 10 mm i størrelse) undersøgelsen af den fysiske interaktion mellem hydrogeler og cellefri genekspression. For eksempel er det med denne teknik muligt at studere, hvordan hydrogelmatrixen påvirker CFPS-reaktioner11, og hvordan CFPS-reaktioner kan påvirke hydrogelmatrixen31. Større størrelser af hydrogeler giver også mulighed for udvikling af nye, bioprogrammerbare materialer32. Endelig er der ved at indlejre CFPS-reaktioner i hydrogeler også en potentiel reduktion i behovet for plastreaktionsbeholdere. Til implementering af cellefrie sensorer har dette klare fordele i forhold til enheder, der er afhængige af plastvarer. Samlet set giver indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogeler flere fordele for implementeringen af cellefrie enheder uden for laboratoriet.

Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres her, er at tillade drift af CFPS-reaktioner inden for hydrogelmatricer. To forskellige metoder demonstreres til indlejring af cellefrie proteinproduktionsreaktioner i hydrogelmaterialer i makroskala (figur 1). I metode A introduceres CFPS-komponenter til frysetørrede agarosehydrogeler for at danne et aktivt system. I metode B blandes smeltet agarose med CFPS-reaktionskomponenter for at danne et komplet CFPS-hydrogelsystem, som derefter frysetørres og opbevares, indtil det er nødvendigt. Disse systemer kan rehydreres med en mængde vand eller buffer og analysand for at starte reaktionen.

Denne undersøgelse bruger Escherichia coli-cellelysatbaserede systemer. Disse er nogle af de mest populære eksperimentelle CFPS-systemer, da E. coli-cellelysatpræparat er enkelt, billigt og opnår høje proteinudbytter. Cellelysatet suppleres med de makromolekylære komponenter, der er nødvendige for at udføre transkription og translation, herunder ribosomer, tRNA'er, aminoacyl-tRNA-syntetaser og initiering, forlængelse og termineringsfaktorer. Specifikt demonstrerer dette papir produktionen af eGFP og mCherry i agarosehydrogeler ved hjælp af E. coli-cellelysater og overvåger udseendet af fluorescens ved hjælp af en pladelæser og konfokal mikroskopi. Repræsentative resultater for mikrotiterpladelæseren kan ses i Whitfield et al.31, og de underliggende data er offentligt tilgængelige 33. Endvidere bekræftes ekspressionen af fluorescerende proteiner gennem gelerne ved anvendelse af konfokalmikroskopi. De to protokoller, der er demonstreret i dette papir, giver mulighed for samling og opbevaring af CFPS-baserede genetiske enheder i materia med det endelige mål at skabe et passende fysisk miljø til distribution af cellefrie genkredsløb på en måde, der understøtter feltimplementering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellelysatbuffer og medieforberedelse

  1. Fremstilling af 2x YT+P agar og medium
    1. Forbered 2x YT+P agar ved at afmåle 16 g/L trypton, 10 g/L gærekstrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22 ml/L 1 M KH2PO4 og 15 g/L agar. For 2x YT + P bouillon skal du følge den foregående sammensætning, men udelade agaren.
    2. Steriliser ved at autoklavere 2x YT+P.
  2. Forberedelse af S30A-bufferen
    1. S30A-bufferen fremstilles med 5,88 g/l Mg-glutamat, 12,195 g/l K-glutamat og 25 ml/l 2 M Tris, justeret til pH 7,7 med eddikesyre.
    2. Opbevar S30A-bufferen ved 4 °C i op til 1 uge.
  3. Fremstilling af S30B-bufferen
    1. S30B-bufferen fremstilles med 5,88 g/l Mg-glutamat og 12,195 g/l K-glutamat, justeret til pH 8,2 med 2 M Tris.
    2. Opbevar S30B-bufferen ved 4 °C i op til 1 uge.

2. Cellelysatpræparat (4 dages protokol)

  1. Dag 1
    1. Hæld 2x YT+P i agarplader suppleret med 100 μg/ml ampicillin.
    2. Streak E. coli fra -80 °C glycerolstamme, og inkuberes natten over ved 37 °C.
  2. Dag 2
    1. Pod en enkelt koloni fra 2x YT+P-pladen til 400 ml 2x YT+P-bouillon (suppleret med ampicillin) i en 1 L forvirret kolbe.
    2. Der inkuberes i 24 timer ved 37 °C under omrystning ved 220 o/min.
  3. Dag 3
    1. Mål og registrer OD600 af de 24 timers kulturer; væksten er tilstrækkelig ved en OD600 på 3-4.
      BEMÆRK: Tag en 1 ml alikvote bakteriekultur, og udfør en seriel fortynding med medium (2x YT + P bouillon) inden måling af OD600 nm. Der tages højde for fortyndingseffekten ved beregning af OD600.
    2. Overfør kulturen jævnt mellem forkølede 500 ml centrifugeflasker.
    3. Der centrifugeres ved 4,500 x g i 15 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten kasseres.
    4. Under centrifugering færdiggøres S30A-bufferpræparatet ved at tilsætte 2 ml/l 1 M DTT til den tidligere fremstillede S30A-buffer, blande og opretholde bufferen på is.
    5. Resuspender cellepillerne i 200 ml S30A buffer.
    6. Vortex flaskerne kraftigt, indtil hele pelleten er helt opløselig, og hold cellerne på is så meget som muligt.
    7. Der centrifugeres ved 4,500 x g i 15 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten kasseres.
    8. Gentag trin 2.3.5-2.3.7 (inklusive).
    9. Der tilsættes 40 ml S30A-buffer til hver centrifugeflaske, pellets resuspenderes, og overføres til forvejede 50 ml centrifugeglas.
    10. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved dekantering, og restsupernatanten fjernes med pipette, idet den så vidt muligt holdes på is.
    11. Centrifugerørene vejes igen, registrerer den nye masse og beregner pelletsmassen.
    12. Flash-frys pellets i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
  4. Dag 4
    1. Optø pillerne på is.
    2. Pr. 1 g pellet tilsættes følgende: 1,2 ml S30A-buffer (DTT tilsat før brug), 275 μL proteasehæmmer (8 mM stamme) og 25 μL lysozym (10 mg/ml lager).
    3. Vortex kraftigt, indtil pellets er fuldstændigt opløselige uden resterende klumper, og holder dem på is så meget som muligt.
    4. I 50 ml centrifugerør sonikeres cellesuspensionerne ved 120 W, 20 kHz, 30% amplitude og 20 s / 40 s tænd / sluk-impulser i 5 minutters sonikering.
    5. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 1 time ved 4 °C for at pelletere celleresterne.
    6. Supernatanten overføres til friske 50 ml centrifugeglas.
    7. Inkuber glas ved 37 °C ved 220 o/min i 80 min.
    8. Forbered dialysematerialer ved at tilsætte 1 ml/l 1 M DTT til S30B buffer. Bland og tilsæt 900 ml til et 1 L sterilt bægerglas. Tilsæt en magnetomrører, og opbevar den ved 4 °C.
    9. Efter afstrømningsreaktionen overføres celleekstraktet fra trin 2.4.7 til 2 ml mikrocentrifugeglas og centrifugeres ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    10. Den pelletfrie supernatant konsolideres på is i et 50 ml centrifugeglas.
    11. Bestem den samlede mængde produceret celleekstrakt, og hydrat det nødvendige antal 10K MWCO-dialysekassetter ved at nedsænke dem i S30B i 2 minutter.
    12. Læg kassetterne i en sprøjte med op til 3 ml ekstrakt. Dialysere op til tre kassetter pr. 1 l bægerglas under omrøring ved 4 °C i 3 timer.
    13. Når dialysen er afsluttet, hvilket klarer ekstraktet, overføres ekstraktet til 2 ml mikrocentrifugeglas. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    14. Det klarede ekstrakt konsolideres i et frisk centrifugerør på is og hvirvel kort for at blande.
    15. Bestem proteinkoncentrationen af ekstraktet ved hjælp af et fluorometer.
    16. Ekstraktet fortyndes til en koncentration på 44,5 mg/ml ved hjælp af forkølet ddH2O.
    17. Alikvote i 200 μL alikvoter, lynfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.

3. Fremstilling af frysetørrede hydrogeler (metode A)

  1. Væg 0,75 g agarose, tilsæt ddH2O til et volumen på 100 ml og mikrobølgeovn i 30 s udbrud ved høje temperaturer for at skabe smeltet agarosebestand.
  2. Brug en pipette til at overføre 50 μL smeltet agarose til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og lad gelen polymerisere i 20-30 minutter (polymerisation sker hurtigere, hvis gelerne overføres til køleskab).
  3. Flash-frys mikrocentrifugerørene, der indeholder de polymeriserede geler, i flydende nitrogen.
  4. Fjern låget på centrifugerørene, dæk centrifugerøråbningerne med voksfilm, og gennembor filmen flere gange med en nål eller pipettespids.
  5. Mikrocentrifugeglassene indeholdende de polymeriserede geler overføres til -80 °C, opbevares i 1-2 timer.
  6. Genvind centrifugeglassene fra -80 °C opbevaring, og læg dem i en frysetørrer, så det sikres, at glassene er helt tørre.
  7. Aktivér frysetørreren med følgende indstillinger: temperatur: -20 °C, tryk: 0,1 mbar.
  8. Lad gelen frysetørre natten over.
  9. Genvind gelerne fra frysetørreren, og læg dem i -80 °C opbevaring, indtil de skal bruges.
    BEMÆRK: Geler kan opbevares frysetørret i op til 1 år.

4. Klargøring af lageret til 14x energiopløsning

  1. Kombiner alle reaktionskomponenterne (tabel 1) i et 15 ml centrifugerør på is for at producere en 14x energiopløsning.
  2. 14x energiopløsningen alikvote i 1,5 ml mikrocentrifugeglas og opbevares ved -80 °C (alikvoter med mindre volumen kan anvendes).
    BEMÆRK: 14x energiopløsningen kan opbevares i flere måneder ved -80 °C, hvis gentagen optøning af rørene undgås.

5. Fremstilling af 4x aminosyrestammen

  1. Optø alle 20 aminosyrekomponenter i et RTS Amino Acid Sampler-sæt på is. Vortex aminosyrerne for at sikre, at de er helt opløst.
  2. I et 50 ml centrifugerør kombineres alle 20 aminosyrer, og der tilsættes 12 ml sterilddH2O. Vortex, indtil opløsningen bliver klar, med kun en let tåge af hvid farve.
  3. Alikvoten 4x aminosyrerne i 1,5 ml mikrocentrifugeglas (500 μL alikvoter).
  4. De 4x aminosyreopløsninger, der er alikvoter, lynfryses i flydende nitrogen, og de delviste prøver flyttes til -80 °C-opbevaring.

6. Cellefri bufferkalibrering

BEMÆRK: CFPS-bufferen, der blev anvendt til hydrogelreaktionerne, blev kalibreret til optimale DTT-, Mg-glutamat- og K-glutamatkoncentrationer efter protokollen i Banks et al.34 modificeret fra Sun et al.35. Kalibreringsreaktionssammensætningerne blev valgt ved hjælp af design af eksperimenter (DOE) -metoden, hvor syv faktorniveauer blev valgt for K-glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) og DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) lagre. JMP Pro 15 blev brugt til at generere et brugerdefineret DOE-design (tabel 2) og foretage analysen for at bestemme de optimale faktorkoncentrationer.

  1. Det cellefrie ekstrakt genvindes fra -80 °C-opbevaring, og det tøs op på is.
  2. Optø 4x aminosyrer, 14x energiopløsning, 40% PEG-8000, plasmid-DNA, 3 M K-glutamat, 100 mM Mg-glutamat og 100 mM DTT-lagre på is.
  3. Opret en kalibreringsmasterblanding ved at kombinere 12,5 μL af 4x-aminosyrerne, 3,57 μL af 14x energiopløsningen, 2,5 μL 40% PEG-8000, 3 μg plasmid-DNA og 10 μL cellefrit ekstrakt (44,5 mg / ml), og lav op til 35 μL pr. Reaktion med ddH2O.
  4. De 35 μL masterblanding fordeles i hullerne på en sort mikrotiterplade med 384 brønde.
  5. Efter DOE-designet tilsættes det passende volumen Mg-glutamat, K-glutamat og DTT til hver reaktion sammen med ddH2O for at gøre hver reaktion op til 50 μL.
  6. Mikrotiterpladen overføres til en pladelæser til fluorescensdetektion og -analyse ved hjælp af de beskrevne pladelæserindstillinger (for mCherry): excitation: 587 nm, emission: 610 nm, bølgelængdebåndbredde: 12 nm, optik: top, temperatur: 37 °C, hvor fluorescensaflæsninger indsamles hvert 5. minut i 4 timer af den samlede læsetid. Inkuber pladerne med omrystning på en pulserende indstilling ved 60 o / min.
  7. Upload resultaterne til JMP DOE-designet, og generer en forudsigelsesprofil for at bestemme de optimale koncentrationsniveauer for K-glutamat, Mg-glutamat og DTT baseret på ønskede responsvariabler; I dette tilfælde var den maksimale fluorescens og reaktionshastighed responsvariablerne.
  8. Kombiner reagenserne som vist i tabel 3 for at oprette 2X CFPS-bufferen
  9. Alikvote og opbevares ved -80 °C

7. CFPS i rehydrerede frysetørrede hydrogeler (metode A)

BEMÆRK: De plasmider, der blev anvendt i CFPS-reaktionerne, blev skabt ved hjælp af komponenter fra EcoFlex-modulært værktøjssæt til E. coli36 og beskrevet i Whitfield et al.11 mCherry og eGFP var under kontrol af den konstitutive JM23100 promotor. Disse komponenter er tilgængelige fra Addgene.

  1. Det cellefrie ekstrakt genvindes fra -80 °C-opbevaring, og det tøs op på is i ca. 20 minutter.
  2. Opsaml 2x CFPS-bufferen og plasmid-DNA'et, og tø op på is.
  3. Saml de frysetørrede hydrogeler, og lad dem nå stuetemperatur i 15 minutter ved at lade gelerne stå på bænken.
  4. Overfør gelerne til 1,5 ml mikrocentrifugerør, trim gelerne med en skalpel om nødvendigt for at få dem til at passe i brøndene.
  5. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør kombineres 10 μL cellefrit ekstrakt med 25 μL 2x CFPS-buffer og 4 μg plasmid-DNA; fylde op til et samlet volumen på 50 μL med ddH2O for at skabe CFPS-opløsningen.
  6. CFPS-opløsningen pipetteres på de frysetørrede hydrogeler.
  7. Lad gelerne trække i CFPS-systemet i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
  8. Overfør gelerne til en sort 384-brønds mikrotiterplade ved hjælp af en spatel.
  9. Overfør mikrotiterpladen til en pladelæser til fluorescensdetektion og -analyse ved hjælp af pladelæserindstillingerne beskrevet i trin 6.6. Repræsentative resultater er tilgængelige i tidligere undersøgelser31,33.

8. Cellefri proteinsyntese i deployerbare hydrogeler (metode B)

  1. Genvind cellefrit ekstrakt fra -80 °C opbevaring, og tø op på is i ca. 20 minutter.
  2. Saml plasmid-DNA'et, og tø op på is.
  3. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør på is kombineres 10 μL cellefrit ekstrakt med 3 μg plasmid-DNA og 25 μL 2x CFPS-buffer, hvilket giver et samlet volumen på 37,5 μL.
  4. Mål 3 g agarose, og tilsæt til 100 ml ddH2O buffer for at skabe 3% agarose.
  5. Mikrobølgeovn 3% agarose i 30 s bursts ved høj effekt.
  6. Der pipetteres 12,5 μL smeltet agarose i 1,5 ml mikrocentrifugeglas indeholdende CFPS-blanding til et samlet volumen på 50 μL.
  7. Den smeltede agarose afkøles, men polymeriseres ikke, idet agarosen efterlades i en varmeblok indstillet til 50 °C.
  8. Kombiner den smeltede agarose med CFPS-opløsningen; blandes via pipettering og omrøring med spidsen, og sørg for at bevæge dig hurtigt for at undgå gelpolymerisation, før CFPS-opløsningen kan blandes i.
  9. Lad gelerne afkøle ved stuetemperatur og polymeriser i ca. 2 min.
  10. Overfør den polymeriserede agarose til 1,5 ml mikrocentrifugerør med en spatel og lynfrysning i flydende nitrogen.
  11. De flashfrosne hydrogeler anbringes i -80 °C i 1 time.
  12. Gendan gelerne fra opbevaring; Fjern mikrocentrifugerørets låg, dæk rørene med voksfilm, og gennembor filmen, så fugten kan tørres af.
  13. Aktivér frysetørreren med følgende indstillinger: temperatur: -20 °C, tryk: 0,1 mbar, frysetørring i 18 timer (natten over).
  14. Opbevar de frysetørrede CFPS-enheder i -80 °C opbevaring indtil brug.
  15. De frysetørrede CFPS-enheder med et omtrentligt vådt volumen på 50 μL kan rehydreres med 50 μL ddH2O uden overskydende væske. Rehydrering tager cirka 30 min.
  16. Overfør gelerne til en sort 384-brønds mikrotiterplade ved hjælp af en spatel.
  17. Overfør mikrotiterpladen til en pladelæser til fluorescensdetektion og -analyse ved hjælp af pladelæserindstillingerne beskrevet i trin 6.6. Repræsentative resultater er tilgængelige i tidligere publikationer31,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver to metoder til indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogelmatricer, hvor figur 1 viser en skematisk oversigt over de to tilgange. Begge metoder kan frysetørres og langtidsopbevares. Metode A er den mest anvendte metode af to grunde. For det første har det vist sig at være den mest anvendelige metode til at arbejde med en række hydrogelmaterialer11. For det andet giver metode A mulighed for parallel testning af genetiske konstruktioner. Metode B er mere velegnet til fremstilling af et optimeret system og feltimplementering. Begge protokoller gør det muligt at forberede mange prøver på én gang for at hjælpe med eksperimentel reproducerbarhed. Denne funktion er også nyttig til den langsigtede udvikling af teknologien, da frysetørrede enheder kan sendes i tør tilstand og rekonstitueres på stedet, når det er nødvendigt.

Den fremgangsmåde, der er skitseret i protokollen og figur 1 , kan anvendes til ekspression af enkeltgenkonstruktioner eller til co-ekspression af flere gener. Dataene præsenteret i figur 2 viser ekspressionen af både eGFP og mCherry i en 0,75% agarosegel. Konfokal mikroskopi blev anvendt til at bekræfte, at proteinekspression var homogen i hele hydrogelen, herunder inden for de indre planer. Specifikt var proteinsyntese ikke begrænset til hydrogelens ydre kanter, og intern fluorescens var ikke resultatet af proteindiffusion. For at bekræfte dette var det muligt at se proteindiffusion fra en hydrogel til en anden ved at placere en eGFP-ekspresserende hydrogel i fysisk kontakt med en mCherry-ekspressionshydrogel. Diffusionshastigheden mellem de to var utilstrækkelig til at forklare den omfattende lokalisering af enten rød eller grøn fluorescens inde i materialet. Dette eksperiment illustrerer også en vigtig fordel ved at implementere cellefrie enheder i hydrogeler - enhedens funktionalitet kan organiseres rumligt på en måde, der ikke er mulig i flydende cellefrie reaktioner. Derudover er der behov for samtidig syntese af mere end et enkelt genprodukt til oprettelse af gennetværk. Resultaterne vist i figur 2 (nederste række) bekræftede co-ekspressionen af både mCherry og eGFP i agarose. I dette arbejde blev begge proteiner udtrykt, og der var ingen rumlig konkurrence mellem proteinerne. Igen demonstrerer en overlejring af det røde og grønne bølgelængdeområde den jævne rumlige fordeling af begge proteiner i hydrogelen.

Tabel 1: Lagrene af 14x energiopløsninger. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Design af et eksperimentelt array til optimering af DTT, Mg-glutamat og K-glutamat inden for de cellefrie proteinsyntesereaktioner. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: 2x CFPS-bufferkomponenterne. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over de to protokoller. I den første metode (metode A, demonstreret i dette papir) fremstilles hydrogelmaterialer først og frysetørres derefter (trin 1) uden cellefrie komponenter. Disse tørrede hydrogeler kan opbevares og rekonstitueres, når det kræves (trin 2) med det korrekte volumen cellefri reaktion før inkubation til proteinproduktion (trin 3) Variantmetoden, metode B, inkorporerer alle eller nogle af de cellefrie reaktionskomponenter i den oprindelige hydrogelfabrikation. Efter frysetørring (trin 1) kan hydrogelerne rekonstitueres i vand alene eller i buffer indeholdende en analyt af interesse (trin 2). Proteinproduktionen (trin 3) fortsætter som før. En tredje metode, hvor frysetørrede cellefrie komponenter rekonstitueres med hydrogelpolymerer, er beskrevet i Whitfield et al.11 , men har kun fundet anvendelse med et begrænset antal hydrogeler til dato. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Cellefri proteinsyntese af eGFP og mCherry i en hydrogel ved anvendelse af E. coli-cellelysater. Agarosegeler (0,75%) blev fremstillet uden DNA-skabelon (øverst) med 4 μg enten eGFP- eller mCherry-skabelon (midten) eller med 4 μg af både eGFP- og mCherry-skabelon (nederst). Hydrogelerne blev inkuberet i 4 timer før konfokal mikroskopi i de røde og grønne kanaler. Der vises også en overlejring af de to kanaler, og overlejringen indeholder DIC-billedet (differential interference contrast). Hydrogeler indeholdende enten eGFP eller mCherry skabelon blev fremstillet separat, men inkuberet i fysisk kontakt med hinanden. Geldiameteren er 6 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skitseret her er to protokoller til inkorporering af E. coli-cellelysatbaserede CFPS-reaktioner i agarosehydrogeler . Disse metoder muliggør samtidig genekspression i hele materialet. Protokollen kan tilpasses til andre CFPS-systemer og er med succes blevet gennemført med kommercielt tilgængelige CFPS-sæt ud over de laboratoriefremstillede cellelysater, der er beskrevet her. Det er vigtigt, at protokollen tillader genekspression i fravær af en ekstern væskefase. Det betyder, at systemet er selvstændigt og ikke kræver et cellefrit reaktionsbad. Til forskel fra tidligere metoder, hvor CFPS-reaktioner forekom i hydrogeler, fjernes behovet for eksterne buffere og reaktionsbeholdere med denne metode. Det forventes, at disse metoder vil give forskere mulighed for at udforske brugen af hydrogelmaterialer som chassis til cellefrie syntetiske biologiske enheder, hvilket i sidste ende giver en rute til at flytte sådanne enheder ud af laboratoriet.

Afgørende for succesen med begge tilgange er brugen af cellelysater af høj kvalitet. Et cellelysat af høj kvalitet skal have en høj proteinkoncentration (>40 mg/ml), skal holdes koldt under tilberedningen og bør ikke have gennemgået gentagne fryse-optøningscyklusser. Derudover er det afgørende, at DNA-skabelonerne er af høj renhed. For at opnå dette bør plasmider ekstraheres fra celler ved hjælp af et plasmidpræparationssæt med høj renhed og højt udbytte, så transkriptionelle reaktioner kan fortsætte inden for CFPS-miljøet. Disse kritiske faser er fælles for alle CFPS-applikationer og er ikke unikke for denne metode. Ikke desto mindre er det forberedelsen af CFPS-komponenter, der har den største indvirkning på protokollernes effektivitet. Med hensyn til materialerne skal der opnås effektiv, hurtig frysetørring af hydrogelerne. Hvis frysetørreren ikke når en tilstrækkelig kold temperatur (under -45 °C), tørres gelen i stedet for frysetørres, hvilket kan kompromittere hydrogelmatrixens indre struktur og forårsage nedbrydning af de indlejrede CFPS-systemer. Metode B har også en unik bekymring; Når CFPS-blandingen tilsættes til den smeltede agarose for at danne gelen, skal den smeltede agarose efterlades afkøle tilstrækkeligt, før CFPS-blandingen tilsættes for at forhindre termisk nedbrydning til CFPS-reaktionerne. At lade agaroseen afkøle for meget vil imidlertid resultere i polymerisering af gelen og forhindre tilsætning af CFPS-systemet. Endelig har hydrogeler en grad af autofluorescens, som kan være i konflikt med fluorescenssignalerne genereret under CFPS-reaktionerne. Det er derfor vigtigt at inkludere passende negative kontroller og genetiske reportere, der ikke har de samme fluorescensegenskaber som materialet.

De protokoller, der demonstreres her, centrerer sig om brugen af agarose som modelhydrogel. Agarose er et fremragende modelsystem til dette arbejde, da det er bredt tilgængeligt, billigt og demonstrerer fremragende proteinproduktionskapaciteter. Tidligere undersøgelser har også vist, at agarose kan erstatte trængselsmidlet PEG i CFPS-reaktioner, hvilket indikerer, at interaktionerne mellem polymerchassiset og CFPS-reaktionerne kan forbedre proteinproduktionen11. Disse metoder kan imidlertid også modificeres ved hjælp af en lang række alternative hydrogelmatricer med varierende fysiske og kemiske egenskaber. Metoden er blevet anvendt på xanthangummi, alginat, acylgellangummi, polyacrylamid, hyaluronsyrehydrogeler og poloxamergelerne F-108 og F-1279. I nogle scenarier observeres reduceret proteinproduktion sammenlignet med væskekontroller eller andre hydrogeler. Ikke desto mindre kan der i disse scenarier foretages en afvejning, hvis selve materialets funktionalitet (f.eks. dets klæbeegenskaber eller biokompatibilitet) er til væsentlig fordel, således at en reduktion i proteinproduktionen kan accepteres. Ændringer i koncentrationerne af hydrogelerne kan også foretages. For agarose er metoderne modtagelige for polymerkoncentrationer i området 0,5% -1,5% w / v, for eksempel. En højere gelkoncentration resulterer typisk i materiel forstand i en mere robust enhed, der er mere modstandsdygtig over for håndtering og bedre bevarer CFPS-reaktionen indeni. Afvejningen med øget gelkoncentration er imidlertid, at reaktionen kan have en reduceret produktionshastighed eller proteinudbytte11,37. Forholdet mellem polymerkoncentrationen og proteinproduktionen er imidlertid ikke lineært og varierer afhængigt af den anvendte hydrogel11. Som sådan kræves der for enhver ny hydrogelpolymer en grad af eksperimentering for at afbalancere materialefunktionalitet mod cellefri funktionalitet.

Indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogelmaterialer uden behov for eksterne buffere repræsenterer en interessant vej til implementering af cellefrie enheder. Cellefrie enheder har den fordel, at de fjerner behovet for udsætning af genetisk manipulerede organismer uden for et kontrolleret laboratoriemiljø. Desuden fjerner indlejring af reaktioner i hydrogeler behovet for reaktionsbeholdere (typisk plastvarer) efter rekonstitution. I betragtning af at mange hydrogeler er biologisk nedbrydelige, giver dette en potentiel rute til reduktion af plastaffald. På samme måde viser den her beskrevne protokol også, at både hydrogel og CFPS kan frysetørres. Mens gentagne cyklusser af frysetørring ikke anbefales og sandsynligvis vil skade CFPS og hydrogelfunktionen, for engangsudstyr. Evnen til at frysetørre og rekonstituere komponenterne reducerer enhedens vægt og fjerner behovet for en kølekæde under transport. Disse egenskaber forenkler i sidste ende logistikken og reducerer transportomkostningerne for enhederne. Endvidere har hydrogeler mange nyttige funktionelle egenskaber; For eksempel kan de fungere som pastaer, smøremidler og klæbemidler. Hydrogeler kan også være biokompatible, biologisk nedbrydelige og besidder stimuli-reaktioner i sig selv. Samlet set kan der opnås synergi mellem biologisk funktionalitet og materialevidenskab for at skabe en ny klasse af bioprogrammerbare materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender i høj grad støtten fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) og BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) og Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data til støtte for denne publikation er frit tilgængelige på: 10.25405/data.ncl.22232452. Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY) licens til enhver Author Accepted Manuscript version, der opstår.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Tags

Biologi udgave 196 Cellefri proteinsyntese CFPS syntetisk biologi syntetiske gennetværk hydrogeler biosensorer genekspression proteinekspression
Metoder til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogeler i makroskala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield,… More

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter