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Biology

Procédés d’intégration de réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des hydrogels à l’échelle macroscopique

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici deux protocoles permettant d’intégrer des réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des matrices d’hydrogel à l’échelle macroscopique sans avoir besoin d’une phase liquide externe.

Abstract

Les réseaux de gènes synthétiques fournissent une plate-forme aux scientifiques et aux ingénieurs pour concevoir et construire de nouveaux systèmes avec des fonctionnalités codées au niveau génétique. Alors que le paradigme dominant pour le déploiement des réseaux de gènes se trouve à l’intérieur d’un châssis cellulaire, les réseaux de gènes synthétiques peuvent également être déployés dans des environnements sans cellules. Les applications prometteuses des réseaux de gènes acellulaires comprennent les biocapteurs, car ces dispositifs ont été démontrés contre des cibles biotiques (virus Ebola, Zika et SRAS-CoV-2) et abiotiques (métaux lourds, sulfures, pesticides et autres contaminants organiques). Les systèmes acellulaires sont généralement déployés sous forme liquide dans une cuve de réaction. Cependant, être capable d’intégrer de telles réactions dans une matrice physique peut faciliter leur application plus large dans un ensemble plus large d’environnements. À cette fin, des méthodes d’intégration des réactions de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) dans une variété de matrices d’hydrogel ont été développées. L’une des principales propriétés des hydrogels propices à ce travail est la grande capacité de reconstitution en eau des matériaux hydrogels. De plus, les hydrogels possèdent des caractéristiques physiques et chimiques fonctionnellement bénéfiques. Les hydrogels peuvent être lyophilisés pour le stockage et réhydratés pour une utilisation ultérieure. Deux protocoles étape par étape pour l’inclusion et le dosage des réactions CFPS dans les hydrogels sont présentés. Tout d’abord, un système CFPS peut être incorporé dans un hydrogel par réhydratation avec un lysat cellulaire. Le système à l’intérieur de l’hydrogel peut alors être induit ou exprimé de manière constitutive pour une expression complète de la protéine à travers l’hydrogel. Deuxièmement, le lysat cellulaire peut être introduit dans un hydrogel au point de polymérisation, et l’ensemble du système peut être lyophilisé et réhydraté à un point ultérieur avec une solution aqueuse contenant l’inducteur du système d’expression codé dans l’hydrogel. Ces méthodes ont le potentiel de permettre la création de réseaux de gènes acellulaires qui confèrent des capacités sensorielles aux matériaux hydrogel, avec un potentiel de déploiement au-delà du laboratoire.

Introduction

La biologie synthétique intègre diverses disciplines d’ingénierie pour concevoir et concevoir des pièces, des dispositifs et des systèmes biologiques qui peuvent remplir des fonctions que l’on ne trouve pas dans la nature. La plupart des approches de biologie synthétique sont encore liées aux cellules vivantes. En revanche, les systèmes de biologie synthétique acellulaires offrent des niveaux de contrôle et de liberté de conception sans précédent, ce qui permet une flexibilité accrue et un temps plus court pour l’ingénierie des systèmes biologiques, tout en éliminant de nombreuses contraintes des méthodes traditionnelles d’expression génique cellulaires 1,2,3. Le CFPS est utilisé dans un nombre croissant d’applications dans de nombreuses disciplines, notamment la construction de cellules artificielles, le prototypage de circuits génétiques, le développement de biocapteurs et la production de métabolites 4,5,6. Le CFPS s’est également avéré particulièrement utile pour produire des protéines recombinantes qui ne peuvent pas être facilement exprimées dans les cellules vivantes, telles que les protéines sujettes à l’agrégation, les protéines transmembranaires et les protéines toxiques 6,7,8.

Le CFPS est généralement effectué dans les réactions liquides. Ceci, cependant, peut limiter leur déploiement dans certaines situations, car tout dispositif sans cellule liquide doit être contenu dans un récipient de réaction. La raison d’être du développement des méthodes présentées ici était de fournir des protocoles robustes pour l’intégration de dispositifs de biologie synthétique acellulaires dans des hydrogels, non pas en tant que plate-forme de production de protéines en soi, mais plutôt pour permettre l’utilisation d’hydrogels comme châssis physique pour le déploiement de dispositifs sans cellules au-delà du laboratoire. L’utilisation d’hydrogels comme châssis CFPS présente plusieurs avantages. Les hydrogels sont des matériaux polymères qui, malgré une teneur élevée en eau (parfois supérieure à 98%), possèdent des propriétés solides 9,10,11. Ils ont des utilisations comme pâtes, lubrifiants et adhésifs et sont présents dans des produits aussi divers que les lentilles de contact, les pansements, les rubans adhésifs marins, les amendements de sol et les couches pour bébés 9,11,12,13,14. Les hydrogels font également l’objet d’études actives en tant que véhicules d’administration de médicaments 9,15,16,17. Les hydrogels peuvent également être biocompatibles, biodégradables et posséder des réponses aux stimuli qui leur sont propres 9,18,19,20. Par conséquent, l’objectif ici est de créer une synergie entre la fonctionnalité dérivée de la biologie moléculaire et la science des matériaux. À cette fin, des efforts ont été faits pour intégrer la biologie synthétique acellulaire à une gamme de matériaux, notamment le collagène, la laponite, le polyacrylamide, la fibrine, le peptide PEG et l’agarose 11,21,22, ainsi que pour recouvrir les surfaces de verre, de papier et de tissu 11,23,24 avec les appareils CFPS. Les protocoles présentés ici démontrent deux méthodes d’intégration des réactions CFPS dans des matrices d’hydrogel à l’échelle macroscopique (c’est-à-dire >1 mm), en utilisant l’agarose comme matériau exemplaire. L’agarose a été choisie en raison de sa grande capacité d’absorption d’eau, de ses propriétés autogélifiantes contrôlées et de ses propriétés mécaniques réglables 11,24,25,26. L’agarose prend également en charge les CFPS fonctionnels, est moins chère que de nombreuses autres alternatives à l’hydrogel et est biodégradable, ce qui en fait un choix attrayant en tant que système modèle expérimental. Cependant, il a déjà été démontré que ces méthodes étaient appropriées pour l’intégration du CFPS dans une gamme d’hydrogels alternatifs11. Compte tenu du large éventail d’applications des hydrogels et de la fonctionnalité des CFPS, les méthodes démontrées ici peuvent fournir une base à partir de laquelle les chercheurs sont en mesure de développer des matériaux hydrogels biologiquement améliorés adaptés à leurs propres fins.

Dans des études antérieures, des systèmes de microgel d’une gamme de tailles de 1 μm à 400 μm ont été utilisés pour effectuer des CFPS dans des hydrogels immergés dans des tampons de réaction 23,27,28,29,30,31. Cependant, l’obligation d’immerger les hydrogels dans les tampons de réaction du CFPS limite les possibilités de leur utilisation en tant que matériaux à part entière. Les protocoles présentés ici permettent aux réactions CFPS de se produire dans les hydrogels sans qu’il soit nécessaire d’immerger les gels dans des tampons de réaction. Deuxièmement, l’utilisation de gels à l’échelle macroscopique (d’une taille comprise entre 2 mm et 10 mm) permet d’étudier l’interaction physique entre les hydrogels et l’expression des gènes acellulaires. Par exemple, avec cette technique, il est possible d’étudier comment la matrice d’hydrogel affecte les réactions CFPS11 et comment les réactions CFPS peuvent avoir un impact sur la matrice d’hydrogel31. Des hydrogels de plus grande taille permettent également le développement de nouveaux matériaux bioprogrammables32. Enfin, l’intégration des réactions CFPS dans les hydrogels permet également de réduire considérablement les besoins en récipients de réaction en plastique. Pour le déploiement de capteurs sans cellules, cela présente des avantages évidents par rapport aux appareils dépendant de la vaisselle en plastique. Dans l’ensemble, l’intégration des réactions CFPS dans les hydrogels offre plusieurs avantages pour le déploiement de dispositifs acellulaires au-delà du laboratoire.

L’objectif global des méthodes présentées ici est de permettre l’exploitation des réactions CFPS au sein de matrices d’hydrogel. Deux méthodes différentes sont démontrées pour intégrer des réactions de production de protéines acellulaires dans des matériaux hydrogel à l’échelle macroscopique (Figure 1). Dans la méthode A, les composants du CFPS sont introduits dans des hydrogels d’agarose lyophilisés pour former un système actif. Dans la méthode B, l’agarose fondue est mélangée avec des composants de réaction CFPS pour former un système complet d’hydrogel CFPS, qui est ensuite lyophilisé et stocké jusqu’à ce que cela soit nécessaire. Ces systèmes peuvent être réhydratés avec un volume d’eau ou un tampon et un analyte pour commencer la réaction.

Cette étude utilise des systèmes à base de lysat de cellules d’Escherichia coli. Ce sont quelques-uns des systèmes expérimentaux CFPS les plus populaires, car la préparation de lysat de cellules E. coli est simple, peu coûteuse et permet d’obtenir des rendements protéiques élevés. Le lysat cellulaire est complété par les composants macromoléculaires nécessaires à la transcription et à la traduction, notamment les ribosomes, les ARNt, les aminoacyl-ARNt synthétases et les facteurs d’initiation, d’élongation et de terminaison. Plus précisément, cet article démontre la production d’eGFP et de mCherry dans des hydrogels d’agarose à l’aide de lysats cellulaires d’E. coli et surveille l’apparence de la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques et d’une microscopie confocale. Des résultats représentatifs pour le lecteur de plaques de microtitration peuvent être consultés dans Whitfield et al.31, et les données sous-jacentes sont accessibles au public 33. De plus, l’expression des protéines fluorescentes dans les gels est confirmée par microscopie confocale. Les deux protocoles présentés dans cet article permettent l’assemblage et le stockage de dispositifs génétiques basés sur le CFPS dans des matériaux dans le but ultime de créer un environnement physique approprié pour la distribution de circuits génétiques acellulaires d’une manière favorable au déploiement sur le terrain.

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Protocol

1. Tampon de lysat cellulaire et préparation du milieu

  1. Préparation de 2x gélose YT+P et médium
    1. Préparez 2 gélose YT+P en mesurant 16 g/L de tryptone, 10 g/L d’extrait de levure, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 et 15 g/L de gélose. Pour le bouillon 2x YT+P, suivez la composition précédente mais omettez l’agar-agar.
    2. Stériliser à l’autoclavage des 2x YT+P.
  2. Préparation du tampon S30A
    1. Préparez le tampon S30A avec 5,88 g/L de Mg-glutamate, 12,195 g/L de K-glutamate et 25 mL/L de 2 M Tris, ajustés à un pH de 7,7 avec de l’acide acétique.
    2. Conservez le tampon S30A à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
  3. Préparation du tampon S30B
    1. Préparez le tampon S30B avec 5,88 g/L de Mg-glutamate et 12,195 g/L de K-glutamate, ajustés à un pH de 8,2 avec 2 M Tris.
    2. Conservez le tampon S30B à 4 °C jusqu’à 1 semaine.

2. Préparation du lysat cellulaire (protocole de 4 jours)

  1. Jour 1
    1. Versez les 2x YT+P dans des plaques de gélose complétées par 100 μg/mL d’ampicilline.
    2. Filtrer E. coli à partir d’un stock de glycérol de −80 °C et incuber pendant la nuit à 37 °C.
  2. Jour 2
    1. Inoculer une seule colonie de la plaque 2x YT+P dans 400 mL de bouillon 2x YT+P (complété par de l’ampicilline) dans une fiole à chicanes de 1 L.
    2. Incuber pendant 24 h à 37 °C avec 220 tr/min d’agitation.
  3. Jour 3
    1. Mesurer et enregistrer la OD600 des cultures de 24 h ; la croissance est suffisante à un OD600 de 3-4.
      REMARQUE : Prendre une aliquote de 1 mL de culture bactérienne et effectuer une dilution en série avec un milieu (2x bouillon YT+P) avant de mesurer le diamètre extérieurde 600 nm. Tenez compte de l’effet de dilution lors du calcul de l’OD600.
    2. Transférer la culture uniformément entre des bouteilles à centrifuger de 500 ml pré-réfrigérées.
    3. Centrifuger à 4 500 x g pendant 15 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
    4. Pendant la centrifugation, complétez la préparation du tampon S30A en ajoutant 2 mL/L de DTT 1 M au tampon S30A préalablement préparé, en mélangeant et en maintenant le tampon sur de la glace.
    5. Remettre les pastilles cellulaires en suspension dans 200 mL de tampon S30A.
    6. Faites tourner vigoureusement les bouteilles jusqu’à ce que toute la pastille soit complètement solubilisée, en gardant les cellules sur la glace autant que possible.
    7. Centrifuger à 4 500 x g pendant 15 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
    8. Répétez les étapes 2.3.5 à 2.3.7 (incluses).
    9. Ajouter 40 mL de tampon S30A dans chaque bouteille de centrifugeuse, remettre les pastilles en suspension et les transférer dans des tubes de centrifugation pré-pesés de 50 mL.
    10. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jeter le surnageant en le décantant et retirer le surnageant résiduel à l’aide d’une pipette, en le gardant sur la glace autant que possible.
    11. Pesez à nouveau les tubes à centrifuger, enregistrez la nouvelle masse et calculez la masse des granulés.
    12. Congelez les granulés dans de l’azote liquide et stockez-les à −80 °C.
  4. Jour 4
    1. Décongelez les granulés sur de la glace.
    2. Pour 1 g de pastille, ajouter ce qui suit : 1,2 mL de tampon S30A (DTT ajouté avant utilisation), 275 μL d’inhibiteur de protéase (8 mM de bouillon) et 25 μL de lysozyme (10 mg/mL de bouillon).
    3. Tourbillonnez vigoureusement jusqu’à ce que les granulés soient complètement solubilisés sans qu’il ne reste de grumeaux, en les gardant sur la glace autant que possible.
    4. Dans des tubes à centrifuger de 50 mL, soniser les suspensions cellulaires à 120 W, 20 kHz, 30 % d’amplitude et 20 s/40 s d’impulsions marche/arrêt pendant 5 min de sonication.
    5. Centrifuger à 4 000 x g pendant 1 h à 4 °C pour granuler les débris cellulaires.
    6. Transférer le surnageant dans des tubes à centrifuger frais de 50 mL.
    7. Incuber les tubes à 37 °C à 220 tr/min pendant 80 min.
    8. Préparer le matériel de dialyse en ajoutant 1 mL/L de 1 M de DTT au tampon S30B. Mélanger et ajouter 900 mL dans un bécher stérile de 1 L. Ajoutez un agitateur magnétique et maintenez-le à 4 °C.
    9. Après la réaction de ruissellement, transférer l’extrait cellulaire de l’étape 2.4.7 dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL et centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    10. Consolider le surnageant sans granulés sur de la glace dans un tube à centrifuger de 50 ml.
    11. Déterminer le volume total d’extrait cellulaire produit, et hydrater le nombre nécessaire de cassettes de dialyse MWCO 10K en les immergeant dans S30B pendant 2 min.
    12. Chargez les cassettes à l’aide d’une seringue avec jusqu’à 3 mL d’extrait. Dialyser jusqu’à trois cassettes par bécher de 1 L en remuant à 4 °C pendant 3 h.
    13. Une fois la dialyse terminée, qui clarifie l’extrait, transférez l’extrait dans des tubes de micro-centrifugation de 2 ml. Centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    14. Consolidez l’extrait clarifié dans un tube à centrifuger frais sur de la glace et tourbillonnez brièvement pour mélanger.
    15. Déterminer la concentration en protéines de l’extrait à l’aide d’un fluorimètre.
    16. Diluer l’extrait à une concentration de 44,5 mg/mL en utilisant du ddH2O pré-réfrigéré.
    17. Aliquote dans des aliquotes de 200 μL, congélation éclair dans de l’azote liquide et conservation à −80 °C.

3. Préparation d’hydrogels lyophilisés (Méthode A)

  1. Peser 0,75 g d’agarose, ajouter ddH2O à un volume de 100 mL et cuire au micro-ondes en rafales de 30 s à haute température pour créer un bouillon d’agarose fondu.
  2. À l’aide d’une pipette, transférez 50 μL d’agarose fondue dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et laissez le gel polymériser pendant 20 à 30 minutes (la polymérisation se produit plus rapidement si les gels sont transférés dans un réfrigérateur).
  3. Congeler les tubes de la microcentrifugeuse, contenant les gels polymérisés, dans de l’azote liquide.
  4. Retirez le couvercle des tubes à centrifuger, couvrez les ouvertures des tubes à centrifuger avec un film de cire et percez le film plusieurs fois avec une aiguille ou une pointe de pipette.
  5. Transférer les tubes de microcentrifugation contenant les gels polymérisés dans un stockage à −80 °C pendant 1 à 2 h.
  6. Récupérez les tubes à centrifuger d’un stockage à −80 °C et placez-les dans un lyophilisateur, en vous assurant que les tubes sont complètement secs.
  7. Enclenchez le lyophilisateur avec les réglages suivants : température : −20 °C, pression : 0,1 mbar.
  8. Laissez le gel se lyophiliser pendant la nuit.
  9. Récupérez les gels du lyophilisateur et placez-les dans un stockage à −80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    REMARQUE : Les gels peuvent être conservés lyophilisés jusqu’à 1 an.

4. Préparation du stock de solution énergétique 14x

  1. Combiner tous les composants de la réaction (tableau 1) dans un tube à centrifuger de 15 mL sur de la glace pour produire une solution énergétique 14x.
  2. Aliquotez la solution énergétique 14x dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et conservez-la à −80 °C (des aliquotes de plus petit volume peuvent être utilisées).
    REMARQUE : La solution énergétique 14x peut être stockée pendant plusieurs mois à −80 °C si l’on évite le gel-décongélation répété des tubes.

5. Préparation du bouillon d’acides aminés 4x

  1. Décongeler, sur de la glace, les 20 composants d’acides aminés d’un kit d’échantillonnage d’acides aminés RTS. Vortex les acides aminés pour s’assurer qu’ils sont complètement dissous.
  2. Dans un tube à centrifuger de 50 ml, mélanger les 20 acides aminés et ajouter 12 mL de ddH2O. Vortex stérile jusqu’à ce que la solution devienne claire, avec seulement un léger voile de coloration blanche.
  3. Aliquote les 4 acides aminés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (aliquotes de 500 μL).
  4. Congelez les aliquotes de la solution d’acides aminés 4x dans de l’azote liquide et déplacez-les dans un stockage à −80 °C.

6. Calibrage du tampon sans cellule

NOTA : Le tampon CFPS utilisé pour les réactions d’hydrogel a été calibré pour des concentrations optimales de DTT, de Mg-glutamate et de K-glutamate selon le protocole de Banks et al.34 modifié à partir de Sun et al.35. Les compositions de la réaction d’étalonnage ont été sélectionnées à l’aide de la méthode du plan d’expériences (DOE), avec sept niveaux de facteurs sélectionnés pour le K-glutamate (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1 000 mM, 1 200 mM, 1 400 mM), le Mg-glutamate (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) et le DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). JMP Pro 15 a été utilisé pour générer un plan d’expériences personnalisé (Tableau 2) et effectuer l’analyse afin de déterminer les concentrations de facteurs optimales.

  1. Récupérez l’extrait acellulaire d’un stockage à −80 °C et décongelez-le sur de la glace.
  2. Décongelez les 4 acides aminés, la solution énergétique 14 fois, le PEG-8000 à 40 %, l’ADN plasmidique, le K-glutamate à 3 M, le glutamate à 100 mM de Mg-glutamate et les stocks de DTT à 100 mM sur glace.
  3. Créez un mélange maître d’étalonnage en combinant 12,5 μL des 4 acides aminés, 3,57 μL de la solution énergétique 14x, 2,5 μL de PEG-8000 à 40 %, 3 μg d’ADN plasmidique et 10 μL d’extrait acellulaire (44,5 mg/mL), et préparez jusqu’à 35 μL par réaction avec du ddH2O.
  4. Répartir les 35 μL de mélange maître dans les puits d’une plaque de microtitration noire à 384 puits.
  5. En suivant le plan d’expérience, ajoutez le volume approprié de Mg-glutamate, de K-glutamate et de DTT à chaque réaction, ainsi que du ddH2O pour que chaque réaction atteigne 50 μL.
  6. Transférez la plaque de microtitration vers un lecteur de plaques pour la détection et l’analyse de la fluorescence à l’aide des paramètres du lecteur de plaques décrits (pour mCherry) : excitation : 587 nm, émission : 610 nm, largeur de bande de longueur d’onde : 12 nm, optique : haut, température : 37 °C, les lectures de fluorescence étant collectées toutes les 5 min pendant 4 h de temps de lecture total. Incuber les plaques en agitant sur un réglage pulsé à 60 tr/min.
  7. Chargez les résultats dans le plan d’expériences JMP et générez un profil de prédiction pour déterminer les niveaux de concentration optimaux de K-glutamate, de Mg-glutamate et de DTT en fonction des variables de réponse souhaitées. Dans ce cas, la fluorescence maximale et la vitesse de réaction étaient les variables de réponse.
  8. Combinez les réactifs comme indiqué dans le tableau 3 pour créer le tampon CFPS 2X
  9. Aliquote et conserver à −80 °C

7. CFPS dans des hydrogels lyophilisés réhydratés (méthode A)

NOTE : Les plasmides utilisés dans les réactions CFPS ont été créés à l’aide de composants de la boîte à outils modulaire EcoFlex pour E. coli36 et décrits dans Whitfield et al.11 Le mCherry et l’eGFP étaient sous le contrôle du promoteur de JM23100 constitutif. Ces composants sont disponibles auprès d’Addgene.

  1. Récupérez l’extrait acellulaire d’un stockage à −80 °C et décongelez-le sur de la glace pendant environ 20 minutes.
  2. Récupérez le tampon CFPS 2x et l’ADN plasmidique, et décongelez-les sur de la glace.
  3. Récupérez les hydrogels lyophilisés et laissez-les atteindre la température ambiante pendant 15 min en laissant les gels reposer sur le banc.
  4. Transférer les gels dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL, en coupant les gels avec un scalpel si nécessaire pour les faire entrer dans les puits.
  5. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger 10 μL d’extrait acellulaire avec 25 μL de tampon 2x CFPS et 4 μg d’ADN plasmidique ; jusqu’à un volume total de 50 μL avec ddH2O pour créer la solution CFPS.
  6. Pipeter la solution CFPS sur les hydrogels lyophilisés.
  7. Laissez les gels tremper dans le système CFPS pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
  8. Transférez les gels sur une plaque de microtitration noire à 384 puits à l’aide d’une spatule.
  9. Transférez la plaque de microtitration vers un lecteur de plaques pour la détection et l’analyse de la fluorescence à l’aide des paramètres du lecteur de plaques décrits à l’étape 6.6. Des résultats représentatifs sont disponibles dans des études antérieures31,33.

8. Synthèse de protéines acellulaires dans des hydrogels déployables (Méthode B)

  1. Récupérer l’extrait acellulaire d’un stockage à −80 °C et le décongeler sur de la glace pendant environ 20 minutes.
  2. Collectez l’ADN plasmidique et décongelez-le sur de la glace.
  3. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur glace, mélanger 10 μL d’extrait acellulaire avec 3 μg d’ADN plasmidique et 25 μL de tampon 2x CFPS, soit un volume total de 37,5 μL.
  4. Mesurez 3 g d’agarose et ajoutez-la à 100 mL de tampon ddH2O pour obtenir 3 % d’agarose.
  5. Cuire l’agarose à 3 % au micro-ondes en 30 s rafales à haute puissance.
  6. Pipeter 12,5 μL d’agarose fondue dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant un mélange de CFPS jusqu’à un volume total de 50 μL.
  7. Laissez l’agarose fondue refroidir, mais pas polymériser, en laissant l’agarose dans un bloc thermique réglé à 50 °C.
  8. Combiner l’agarose fondue avec la solution CFPS ; mélanger par pipetage et agitation avec l’embout, et s’assurer de se déplacer rapidement pour éviter la polymérisation du gel avant que la solution CFPS ne puisse être mélangée.
  9. Laissez les gels refroidir à température ambiante et polymérisez pendant environ 2 min.
  10. Transférer l’agarose polymérisée dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une spatule et congeler rapidement dans de l’azote liquide.
  11. Placez les hydrogels surgelés dans un stockage à −80 °C pendant 1 h.
  12. Récupérez les gels de l’entreposage ; Retirez les couvercles des tubes de la microcentrifugeuse, couvrez les tubes d’un film de cire et percez le film pour permettre à l’humidité d’être séchée.
  13. Enclencher la lyophilisateur avec les réglages suivants : température : −20 °C, pression : 0,1 mbar, lyophilisation pendant 18 h (toute la nuit).
  14. Conservez les dispositifs CFPS lyophilisés dans un stockage à −80 °C jusqu’à leur utilisation.
  15. Les appareils CFPS lyophilisés, d’un volume humide d’environ 50 μL, peuvent être réhydratés avec 50 μL de ddH2O sans excès de liquide. La réhydratation dure environ 30 min.
  16. Transférez les gels sur une plaque de microtitration noire à 384 puits à l’aide d’une spatule.
  17. Transférez la plaque de microtitration vers un lecteur de plaques pour la détection et l’analyse de la fluorescence à l’aide des paramètres du lecteur de plaques décrits à l’étape 6.6. Des résultats représentatifs sont disponibles dans des publications antérieures31,33.

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Representative Results

Ce protocole détaille deux méthodes d’intégration des réactions CFPS dans des matrices d’hydrogel, la figure 1 présentant une vue d’ensemble schématique des deux approches. Les deux méthodes se prêtent à la lyophilisation et au stockage à long terme. La méthode A est la méthode la plus utilisée pour deux raisons. Tout d’abord, il a été démontré qu’il s’agit de la méthode la plus applicable pour travailler avec une gamme de matériaux hydrogel11. Deuxièmement, la méthode A permet de tester en parallèle des constructions génétiques. La méthode B est plus appropriée pour la fabrication d’un système optimisé et le déploiement sur le terrain. Les deux protocoles permettent de préparer de nombreux échantillons en une seule fois pour faciliter la reproductibilité expérimentale. Cette caractéristique est également utile pour le développement à long terme de la technologie, car les dispositifs lyophilisés peuvent être expédiés à l’état sec et reconstitués sur place en cas de besoin.

L’approche décrite dans le protocole et dans la figure 1 peut être utilisée pour l’expression de constructions monogéniques ou pour la co-expression de plusieurs gènes. Les données présentées à la figure 2 montrent l’expression de l’eGFP et du mCherry dans un gel d’agarose à 0,75 %. La microscopie confocale a été utilisée pour confirmer que l’expression des protéines était homogène dans tout l’hydrogel, y compris dans les plans internes. Plus précisément, la synthèse des protéines n’était pas confinée aux bords extérieurs de l’hydrogel, et la fluorescence interne n’était pas le résultat de la diffusion des protéines. Pour le confirmer, en plaçant un hydrogel exprimant l’eGFP en contact physique avec un hydrogel exprimant mCherry, il a été possible de voir la diffusion des protéines d’un hydrogel à l’autre. La vitesse de diffusion entre les deux était insuffisante pour expliquer la localisation étendue de la fluorescence rouge ou verte à l’intérieur du matériau. Cette expérience illustre également un avantage clé du déploiement de dispositifs acellulaires dans les hydrogels : la fonctionnalité du dispositif peut être organisée spatialement d’une manière qui n’est pas possible dans les réactions liquides sans cellules. De plus, pour la création de réseaux de gènes, la synthèse simultanée de plus d’un produit génique est nécessaire. Les résultats présentés à la figure 2 (rangée du bas) ont confirmé la co-expression de mCherry et d’eGFP dans l’agarose. Dans ce travail, les deux protéines ont été exprimées et il n’y a pas eu de compétition spatiale entre les protéines. Encore une fois, une superposition de la gamme de longueurs d’onde rouge et verte démontre la distribution spatiale uniforme des deux protéines dans l’hydrogel.

Tableau 1 : Les 14 actions de solutions énergétiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Conception d’un réseau expérimental pour l’optimisation du DTT, du Mg-glutamate et du K-glutamate dans les réactions de synthèse de protéines acellulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Les 2 composants de la mémoire tampon CFPS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des deux protocoles. Dans la première méthode (méthode A, démontrée dans cet article), les matériaux hydrogel sont d’abord préparés, puis lyophilisés (étape 1) sans composants acellulaires. Ces hydrogels séchés peuvent être stockés et reconstitués si nécessaire (étape 2) avec le volume correct de réaction acellulaire avant l’incubation pour la production de protéines (étape 3) La méthode variante, la méthode B, incorpore tous ou certains des composants de la réaction acellulaire dans la fabrication initiale de l’hydrogel. Après lyophilisation (étape 1), les hydrogels peuvent ensuite être reconstitués dans de l’eau seule ou dans un tampon contenant un analyte d’intérêt (étape 2). La production de protéines (étape 3) se poursuit comme avant. Une troisième méthode, dans laquelle des composants acellulaires lyophilisés sont reconstitués avec des polymères hydrogels, est décrite dans Whitfield et al.11 mais n’a été utilisée qu’avec un nombre limité d’hydrogels à ce jour. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Synthèse protéique acellulaire de l’eGFP et de mCherry dans un hydrogel à l’aide de lysats cellulaires d’E. coli. Des gels d’agarose (0,75 %) ont été préparés sans matrice d’ADN (en haut) avec 4 μg de matrice eGFP ou mCherry (au milieu) ou avec 4 μg de matrice eGFP et mCherry (en bas). Les hydrogels ont été incubés pendant 4 h avant la microscopie confocale dans les canaux rouge et vert. Une superposition des deux canaux est également affichée, et la superposition inclut l’image de contraste interférentiel différentiel (DIC). Des hydrogels contenant soit du gabarit eGFP, soit du modèle mCherry ont été préparés séparément mais incubés en contact physique les uns avec les autres. Le diamètre du gel est de 6 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Voici deux protocoles pour l’incorporation de réactions CFPS à base de lysat de cellules d’E. coli dans les hydrogels d’agarose. Ces méthodes permettent l’expression simultanée des gènes dans l’ensemble du matériel. Le protocole peut être adapté à d’autres systèmes CFPS et a été mis en œuvre avec succès avec des kits CFPS disponibles dans le commerce en plus des lysats cellulaires préparés en laboratoire détaillés ici. Il est important de noter que le protocole permet l’expression des gènes en l’absence d’une phase liquide externe. Cela signifie que le système est autonome et ne nécessite pas de bain de réaction sans cellules. Contrairement aux méthodes précédentes dans lesquelles les réactions CFPS se produisaient dans les hydrogels, la nécessité d’avoir des tampons externes et des récipients de réaction est supprimée avec cette méthode. On s’attend à ce que ces méthodes permettent aux chercheurs d’explorer l’utilisation de matériaux hydrogel comme châssis pour des dispositifs de biologie synthétique sans cellules, offrant ainsi une voie pour déplacer ces dispositifs hors du laboratoire.

L’utilisation de lysats cellulaires de haute qualité est essentielle au succès des deux approches. Un lysat cellulaire de haute qualité doit avoir une concentration élevée en protéines (>40 mg/mL), doit être conservé au froid pendant toute la durée de la préparation et ne doit pas avoir subi de cycles répétés de gel-dégel. De plus, il est essentiel que les modèles d’ADN soient d’une grande pureté. Pour ce faire, les plasmides doivent être extraits des cellules à l’aide d’un kit de préparation de plasmides de haute pureté et à haut rendement pour que les réactions transcriptionnelles se déroulent dans l’environnement CFPS. Ces étapes critiques sont communes à toutes les applications du SPFC et ne sont pas propres à cette méthode. Néanmoins, c’est la préparation des composantes du SPFC qui a le plus d’impact sur l’efficacité des protocoles. En ce qui concerne les matériaux, il est nécessaire de parvenir à une lyophilisation efficace et rapide des hydrogels. Si le lyophilisateur n’atteint pas une température suffisamment froide (inférieure à −45 °C), le gel sera séché plutôt que lyophilisé, ce qui peut compromettre la structure interne de la matrice d’hydrogel et provoquer la dégradation des systèmes CFPS intégrés. La méthode B a également une préoccupation unique ; plus précisément, lors de l’ajout du mélange CFPS à l’agarose fondue pour former le gel, l’agarose fondue doit être laissée refroidir suffisamment avant que le mélange CFPS ne soit ajouté pour éviter la dégradation thermique des réactions CFPS. Cependant, laisser l’agarose trop refroidir entraînera la polymérisation du gel et empêchera l’ajout du système CFPS. Enfin, les hydrogels possèdent un degré d’autofluorescence, qui peut entrer en conflit avec les signaux de fluorescence générés lors des réactions CFPS. Il est donc important d’inclure des témoins négatifs appropriés et des rapporteurs génétiques qui n’ont pas les mêmes caractéristiques de fluorescence que le matériau.

Les protocoles présentés ici sont centrés sur l’utilisation de l’agarose comme hydrogel modèle. L’agarose est un excellent système modèle pour ce travail car il est largement disponible, peu coûteux et démontre d’excellentes capacités de production de protéines. Des recherches antérieures ont également démontré que l’agarose peut être un substitut de l’agent d’encombrement PEG dans les réactions CFPS, ce qui indique que les interactions entre le châssis polymère et les réactions CFPS peuvent améliorer la production de protéines11. Cependant, ces méthodes peuvent également être modifiées à l’aide d’une large gamme de matrices d’hydrogel alternatives aux propriétés physiques et chimiques variables. La méthode a été appliquée à la gomme xanthane, à l’alginate, à la gomme gellane acyle, au polyacrylamide, aux hydrogels d’acide hyaluronique et aux gels de poloxamère F-108 et F-1279. Dans certains scénarios, une réduction de la production de protéines est observée par rapport aux témoins liquides ou à d’autres hydrogels. Néanmoins, dans ces scénarios, un compromis peut être trouvé, où la fonctionnalité du matériau lui-même (par exemple, ses propriétés adhésives ou sa biocompatibilité) présente un avantage significatif de sorte qu’une réduction de la production de protéines peut être acceptée. Des modifications des concentrations des hydrogels peuvent également être apportées. Pour l’agarose, les méthodes se prêtent à des concentrations de polymères comprises entre 0,5 % et 1,5 % p/v, par exemple. Une concentration de gel plus élevée se traduit généralement, dans un sens matériel, par un dispositif plus robuste, plus résistant à la manipulation et préservant mieux la réaction CFPS à l’intérieur. Le compromis avec une concentration accrue de gel, cependant, est que la réaction peut avoir un taux de production réduit ou un rendement en protéines11,37. La relation entre la concentration en polymère et la production de protéines n’est cependant pas linéaire et varie en fonction de l’hydrogel utilisé11. En tant que tel, pour tout nouveau polymère hydrogel, un certain degré d’expérimentation est nécessaire pour équilibrer la fonctionnalité du matériau par rapport à la fonctionnalité sans cellule.

L’intégration de réactions CFPS dans des matériaux hydrogel sans avoir besoin de tampons externes représente une voie intéressante pour le déploiement de dispositifs acellulaires. Les dispositifs acellulaires présentent l’avantage d’éliminer la nécessité de disséminer des organismes génétiquement modifiés en dehors d’un environnement de laboratoire contrôlé. De plus, l’enrobage des réactions dans les hydrogels élimine le besoin de récipients de réaction (généralement des articles en plastique) après la reconstitution. Étant donné que de nombreux hydrogels sont biodégradables, cela offre une voie potentielle pour réduire les déchets plastiques. De même, le protocole détaillé ici démontre également que l’hydrogel et le CFPS se prêtent à la lyophilisation. Bien que des cycles répétés de lyophilisation ne soient pas recommandés et qu’ils endommagent probablement la fonction CFPS et hydrogel, pour les dispositifs à usage unique. La possibilité de lyophiliser et de reconstituer les composants réduit le poids de l’appareil et élimine la nécessité d’une chaîne du froid pendant le transport. En fin de compte, ces propriétés simplifient la logistique et réduisent les coûts de transport des appareils. De plus, les hydrogels ont de nombreuses propriétés fonctionnelles utiles qui leur sont propres ; Par exemple, ils peuvent agir comme des pâtes, des lubrifiants et des adhésifs. Les hydrogels peuvent également être biocompatibles, biodégradables et posséder des stimuli-réponses à part entière. Ensemble, une synergie peut être réalisée entre la fonctionnalité biologique et la science des matériaux pour créer une nouvelle classe de matériaux bioprogrammables.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Les auteurs remercient chaleureusement le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques pour l’appui qu’ils ont accordé aux bourses BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) et BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ainsi qu’à la bourse EP/N026683/1 du Conseil de recherches en sciences et sciences physiques du Canada (Laboratoires des sciences et technologies de la défense) (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Les données à l’appui de cette publication sont disponibles gratuitement à l’adresse suivante : 10.25405/data.ncl.22232452. Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version manuscrite acceptée par l’auteur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

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References

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Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

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