Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogeler på makronivå

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi två protokoll för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogelmatriser på makroskala utan behov av en extern vätskefas.

Abstract

Syntetiska gennätverk ger en plattform för forskare och ingenjörer att designa och bygga nya system med funktionalitet kodad på genetisk nivå. Medan det dominerande paradigmet för utbyggnaden av gennätverk ligger inom ett cellulärt chassi, kan syntetiska gennätverk också användas i cellfria miljöer. Lovande tillämpningar av cellfria gennätverk inkluderar biosensorer, eftersom dessa enheter har demonstrerats mot biotiska (Ebola, Zika och SARS-CoV-2-virus) och abiotiska (tungmetaller, sulfider, bekämpningsmedel och andra organiska föroreningar) mål. Cellfria system används vanligtvis i flytande form i ett reaktionskärler. Att kunna bädda in sådana reaktioner i en fysisk matris kan dock underlätta deras bredare tillämpning i en bredare uppsättning miljöer. För detta ändamål har metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner (CFPS) i en mängd olika hydrogelmatriser utvecklats. En av de viktigaste egenskaperna hos hydrogeler som bidrar till detta arbete är hydrogelmaterialens höga vattenrekonstitutionskapacitet. Dessutom har hydrogeler fysikaliska och kemiska egenskaper som är funktionellt fördelaktiga. Hydrogeler kan frystorkas för lagring och återfuktas för användning senare. Två steg-för-steg-protokoll för inkludering och analys av CFPS-reaktioner i hydrogeler presenteras. För det första kan ett CFPS-system införlivas i en hydrogel via rehydrering med ett celllysat. Systemet i hydrogelen kan sedan induceras eller uttryckas konstitutivt för fullständigt proteinuttryck genom hydrogelen. För det andra kan celllysat introduceras till en hydrogel vid polymerisationspunkten, och hela systemet kan frystorkas och rehydreras vid ett senare tillfälle med en vattenlösning som innehåller induceraren för expressionssystemet som kodas i hydrogelen. Dessa metoder har potential att möjliggöra cellfria gennätverk som ger sensoriska förmågor till hydrogelmaterial, med potential för användning utanför laboratoriet.

Introduction

Syntetisk biologi integrerar olika tekniska discipliner för att designa och konstruera biologiskt baserade delar, enheter och system som kan utföra funktioner som inte finns i naturen. De flesta metoder för syntetisk biologi är fortfarande bundna till levande celler. Cellfria system för syntetisk biologi möjliggör däremot oöverträffade nivåer av kontroll och frihet i designen, vilket möjliggör ökad flexibilitet och en förkortad tid för att konstruera biologiska system samtidigt som många av begränsningarna för traditionella cellbaserade genuttrycksmetoder elimineras 1,2,3. CFPS används i ett ökande antal tillämpningar inom många discipliner, inklusive konstruktion av artificiella celler, prototyper av genetiska kretsar, utveckling av biosensorer och produktion av metaboliter 4,5,6. CFPS har också varit särskilt användbart för att producera rekombinanta proteiner som inte lätt kan uttryckas i levande celler, såsom aggregeringsbenägna proteiner, transmembranproteiner och toxiska proteiner 6,7,8.

CFPS utförs vanligtvis i vätskereaktioner. Detta kan dock begränsa deras användning i vissa situationer, eftersom alla vätskecellsfria enheter måste finnas i ett reaktionskärler. Motivet för utvecklingen av de metoder som presenteras här var att tillhandahålla robusta protokoll för att bädda in cellfria syntetiska biologienheter i hydrogeler, inte som en proteinproduktionsplattform i sig utan istället för att möjliggöra användning av hydrogeler som ett fysiskt chassi för utplacering av cellfria enheter utanför laboratoriet. Användningen av hydrogeler som CFPS-chassi har flera fördelar. Hydrogeler är polymera material som trots en hög vattenhalt (ibland över 98%) har fasta egenskaper 9,10,11. De har användningsområden som pastor, smörjmedel och lim och finns i så olika produkter som kontaktlinser, sårförband, marina tejper, jordförbättringsmedel och barnblöjor 9,11,12,13,14. Hydrogeler är också under aktiv utredning som drug delivery vehicles 9,15,16,17. Hydrogeler kan också vara biokompatibla, biologiskt nedbrytbara och ha vissa egna stimulisvar 9,18,19,20. Därför är målet här att skapa en synergi mellan molekylärbiologisk funktionalitet och materialvetenskap. För detta ändamål har ansträngningar gjorts för att integrera cellfri syntetisk biologi med en rad material, inklusive kollagen, laponit, polyakrylamid, fibrin, PEG-peptid och agaros 11,21,22, samt för att belägga ytor av glas, papper och tyg 11,23,24 med CFPS-enheter. Protokollen som presenteras här demonstrerar två metoder för att bädda in CFPS-reaktioner i makroskala (dvs. >1 mm) hydrogelmatriser, med agaros som exempelmaterial. Agarose valdes på grund av dess höga vattenabsorptionsförmåga, kontrollerade självgelningsegenskaper och avstämbara mekaniska egenskaper 11,24,25,26. Agarose stöder också funktionell CFPS, är billigare än många andra hydrogelalternativ och är biologiskt nedbrytbart, vilket gör det till ett attraktivt val som ett experimentellt modellsystem. Dessa metoder har dock tidigare visat sig vara lämpliga för att bädda in CFPS i en rad alternativa hydrogeler11. Med tanke på det breda användningsområdet för hydrogeler och funktionaliteten hos CFPS kan de metoder som demonstreras här ge en grund från vilken forskare kan utveckla biologiskt förbättrade hydrogelmaterial som är anpassade till deras egna ändamål.

I tidigare studier har mikrogelsystem med ett storleksintervall på 1 μm till 400 μm använts för att utföra CFPS i hydrogeler nedsänkta i reaktionsbuffert 23,27,28,29,30,31. Kravet på att nedsänka hydrogeler i CFPS-reaktionsbuffertar begränsar dock möjligheterna för deras användning som material i sin egen rätt. Protokollen som presenteras här gör det möjligt för CFPS-reaktioner att inträffa i hydrogeler utan att gelerna behöver sänkas ner i reaktionsbuffertar. För det andra möjliggör användningen av geler i makroskala (mellan 2 mm och 10 mm i storlek) studier av den fysiska interaktionen mellan hydrogeler och cellfritt genuttryck. Till exempel är det med denna teknik möjligt att studera hur hydrogelmatrisen påverkar CFPS-reaktioner11 och hur CFPS-reaktioner kan påverka hydrogelmatrisen31. Större storlekar av hydrogeler möjliggör också utveckling av nya, bioprogrammerbara material32. Slutligen, genom att bädda in CFPS-reaktioner i hydrogeler, finns det också en potentiell minskning av behovet av plastreaktionskärler. För användningen av cellfria sensorer har detta tydliga fördelar jämfört med enheter som är beroende av plastvaror. Sammantaget ger inbäddning av CFPS-reaktioner i hydrogeler flera fördelar för användning av cellfria enheter utanför laboratoriet.

Det övergripande målet med de metoder som presenteras här är att möjliggöra drift av CFPS-reaktioner i hydrogelmatriser. Två olika metoder demonstreras för att bädda in cellfria proteinproduktionsreaktioner i hydrogelmaterial på makroskala (Figur 1). I metod A introduceras CFPS-komponenter till frystorkade agaroshydrogeler för att bilda ett aktivt system. I metod B blandas smält agaros med CFPS-reaktionskomponenter för att bilda ett komplett CFPS-hydrogelsystem, som sedan frystorkas och lagras tills det behövs. Dessa system kan rehydreras med en volym vatten eller buffert och analyt för att påbörja reaktionen.

Denna studie använder Escherichia coli-celllysatbaserade system. Dessa är några av de mest populära experimentella CFPS-systemen, eftersom E. coli-celllysatberedning är enkel, billig och uppnår höga proteinutbyten. Celllysatet kompletteras med de makromolekylära komponenter som behövs för att utföra transkription och translation, inklusive ribosomer, tRNA, aminoacyl-tRNA-syntetaser och initierings-, förlängnings- och termineringsfaktorer. Specifikt demonstrerar denna artikel produktionen av eGFP och mCherry i agaroshydrogeler med hjälp av E. coli-celllysat och övervakar utseendet på fluorescens med hjälp av en plattläsare och konfokalmikroskopi. Representativa resultat för mikrotiterplattläsaren kan ses i Whitfield et al.31, och underliggande data är offentligt tillgängliga 33. Vidare bekräftas uttrycket av fluorescerande proteiner i gelerna med hjälp av konfokalmikroskopi. De två protokollen som demonstreras i denna artikel möjliggör montering och lagring av CFPS-baserade genetiska enheter i materia med det slutliga målet att skapa en lämplig fysisk miljö för distribution av cellfria genkretsar på ett sätt som stöder fältutplacering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celllysatbuffert och medieberedning

  1. Beredning av 2x YT+P-agar och medium
    1. Förbered 2x YT+P-agar genom att mäta upp 16 g/L trypton, 10 g/L jästextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22ml/L 1 M KH2PO4 och 15 g/L agar. För 2x YT+P-buljongen, följ den tidigare kompositionen men utelämna agar.
    2. Sterilisera genom autoklavering av 2x YT+P.
  2. Beredning av S30A-bufferten
    1. Bered S30A-bufferten med 5,88 g/L Mg-glutamat, 12,195 g/L K-glutamat och 25 ml/L 2 M Tris, justerad till pH 7,7 med ättiksyra.
    2. Förvara S30A-bufferten vid 4 °C i upp till 1 vecka.
  3. Beredning av S30B-bufferten
    1. Bered S30B-bufferten med 5,88 g/L Mg-glutamat och 12,195 g/L K-glutamat, justerad till pH 8,2 med 2 M Tris.
    2. Förvara S30B-bufferten vid 4 °C i upp till 1 vecka.

2. Beredning av celllysat (4-dagarsprotokoll)

  1. Dag 1
    1. Häll 2x YT+P i agarplattor kompletterade med 100 μg/ml ampicillin.
    2. Strö bort E. coli från −80 °C glycerollager och inkubera över natten vid 37 °C.
  2. Dag 2
    1. Inokulera en enda koloni från 2x YT+P-plattan till 400 ml 2x YT+P-buljong (tillsatt med ampicillin) i en 1 L förbryllad kolv.
    2. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C med 220 varv/min.
  3. Dag 3
    1. Mät och registrera OD600 för 24-timmarsodlingarna. tillväxten är tillräcklig vid en OD600 på 3-4.
      OBS: Ta en alikvot på 1 ml bakteriekultur och utför en seriespädning med medium (2x YT+P-buljong) innan du mäter OD600 nm. Ta hänsyn till utspädningseffekten vid beräkning av OD600.
    2. Överför kulturen jämnt mellan förkylda 500 ml centrifugflaskor.
    3. Centrifugera vid 4 500 x g i 15 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten.
    4. Under centrifugering, slutför S30A-buffertberedningen genom att tillsätta 2 ml/L 1 M DTT till den tidigare beredda S30A-bufferten, blanda och hålla bufferten på is.
    5. Återsuspendera cellpelletsen i 200 ml S30A-buffert.
    6. Virvla flaskorna kraftigt tills hela pelleten är helt löslig, håll cellerna på is så mycket som möjligt.
    7. Centrifugera vid 4 500 x g i 15 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten.
    8. Upprepa steg 2.3.5-2.3.7 (inklusive).
    9. Tillsätt 40 ml S30A-buffert till varje centrifugflaska, återsuspendera pelletsen och överför till förvägda 50 ml centrifugrör.
    10. Centrifugera vid 4 000 x g i 15 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten genom dekantering och ta bort den kvarvarande supernatanten med pipett, håll den på is så mycket som möjligt.
    11. Väg centrifugrören igen, registrera den nya massan och beräkna pelletsens massa.
    12. Snabbfrys pellets i flytande kväve och förvara dem vid −80 °C.
  4. Dag 4
    1. Tina pelletsen på is.
    2. Tillsätt följande per 1 g pellet: 1,2 ml S30A-buffert (DTT tillsatt före användning), 275 μL proteashämmare (8 mM stam) och 25 μL lysozym (10 mg/ml stam).
    3. Virvla kraftigt tills pelletsen är helt löslig utan några kvarvarande klumpar, håll dem på is så mycket som möjligt.
    4. I 50 ml centrifugrör, sonikera cellsuspensionerna vid 120 W, 20 kHz, 30% amplitud, och 20 s / 40 s på / av pulser för 5 min ultraljudsbehandling.
    5. Centrifugera vid 4 000 x g i 1 timme vid 4 °C för att pelletera cellresterna.
    6. Överför supernatanten till nya 50 ml centrifugrör.
    7. Inkubera rören vid 37 °C vid 220 varv/min i 80 min.
    8. Bered dialysmaterial genom att tillsätta 1 ml/l 1 M DTT till S30B-bufferten. Blanda och tillsätt 900 ml till en 1 L steril bägare. Tillsätt en magnetomrörare och håll den vid 4 °C.
    9. Efter avrinningsreaktionen överförs cellextraktet från steg 2.4.7 till 2 ml mikrocentrifugrör och centrifugeras vid 20 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
    10. Konsolidera den pelletsfria supernatanten på is i ett 50 ml centrifugrör.
    11. Bestäm den totala volymen cellextrakt som produceras och hydrera det nödvändiga antalet 10K MWCO-dialyskassetter genom att sänka dem i S30B i 2 minuter.
    12. Fyll på kassetterna med upp till 3 ml extrakt via en spruta. Dialysera upp till tre kassetter per 1 L bägare, rör om vid 4 °C i 3 timmar.
    13. När dialysen är klar, vilket klargör extraktet, överför extraktet till 2 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 20 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
    14. Konsolidera det klarade extraktet i ett nytt centrifugrör på is och virvla kort för att blanda.
    15. Bestäm proteinkoncentrationen i extraktet med hjälp av en fluorometer.
    16. Späd extraktet till en koncentration av 44,5 mg/ml med förkyld ddH2O.
    17. Luftfrys i 200 μl alikvoter och snabbfrys i flytande kväve och förvara vid −80 °C.

3. Beredning av frystorkade hydrogeler (metod A)

  1. Väg upp 0,75 g agaros, tillsätt ddH2O till en volym av 100 ml och mikrovågsugn i 30 s skurar vid höga temperaturer för att skapa smält agarosbuljong.
  2. Använd en pipett och överför 50 μL smält agaros till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och låt gelen polymeriseras i 20-30 minuter (polymerisation sker snabbare om gelerna överförs till ett kylskåp).
  3. Snabbfrys mikrocentrifugrören, som innehåller de polymeriserade gelerna, i flytande kväve.
  4. Ta bort locket på centrifugrören, täck centrifugrörets öppningar med vaxfilm och genomborra filmen flera gånger med en nål eller pipettspets.
  5. Överför mikrocentrifugrören som innehåller de polymeriserade gelerna till −80 °C förvaring i 1-2 timmar.
  6. Återvinn centrifugrören från −80 °C lagring och placera i en frystork och se till att rören är helt torra.
  7. Koppla in frystorken med följande inställningar: temperatur: −20 °C, tryck: 0.1 mbar.
  8. Låt gelen frystorka över natten.
  9. Ta ut gelerna från frystorken och förvara dem i −80 °C tills de behövs.
    OBS: Geler kan förvaras frystorkade i upp till 1 år.

4. Beredning av 14x energilösningslager

  1. Kombinera alla reaktionskomponenter (tabell 1) i ett 15 ml centrifugrör på is för att producera en 14x energilösning.
  2. Fördela 14x energilösningen i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid −80 °C (mindre alikvoter kan användas).
    OBS: 14x energilösningen kan lagras i flera månader vid −80 °C om upprepad frysupptining av rören undviks.

5. Beredning av buljongen av 4-gradiga aminosyror

  1. Tina alla 20 aminosyrakomponenter i ett RTS Amino Acid Sampler-kit på is. Vratta aminosyrorna för att säkerställa att de är helt upplösta.
  2. Kombinera alla 20 aminosyror i ett 50 ml centrifugrör och tillsätt 12 ml steril ddH2O. Vortex tills lösningen blir klar, med endast en lätt dis av vit färg.
  3. Fördela de 4 aminosyrorna i 1,5 ml mikrocentrifugrör (500 μL alikvoter ).
  4. Snabbfrys de 4x aminosyralösningsalikvoter i flytande kväve och flytta alikvoter till −80 °C lagring.

6. Cellfri buffertkalibrering

OBS: CFPS-bufferten som användes för hydrogelreaktionerna kalibrerades för optimala DTT-, Mg-glutamat- och K-glutamatkoncentrationer enligt protokollet i Banks et al.34 modifierat från Sun et al.35. Kalibreringsreaktionskompositionerna valdes med hjälp av DOE-metoden (Design of Experiments), där sju faktornivåer valdes för K-glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1 000 mM, 1 200 mM, 1 400 mM), Mg-glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) och DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) lager. JMP Pro 15 användes för att generera en anpassad DOE-design (tabell 2) och genomföra analysen för att bestämma de optimala faktorkoncentrationerna.

  1. Återvinn det cellfria extraktet från −80 °C lagring och tina på is.
  2. Tina 4x aminosyror, 14x energilösning, 40% PEG-8000, plasmid-DNA, 3 M K-glutamat, 100 mM Mg-glutamat och 100 mM DTT-lager på is.
  3. Skapa en kalibreringsmastermix genom att kombinera 12,5 μL av 4x aminosyrorna, 3,57 μL av 14x energilösningen, 2,5 μL 40 % PEG-8000, 3 μg plasmid-DNA och 10 μL cellfritt extrakt (44,5 mg/ml), och späd till 35 μL per reaktion med ddH2O.
  4. Fördela 35 μL masterblandningen i brunnarna på en svart 384-håls mikrotiterplatta.
  5. Efter DOE-designen, tillsätt lämplig volym av Mg-glutamat, K-glutamat och DTT till varje reaktion, tillsammans med ddH2O för att göra varje reaktion upp till 50 μL.
  6. Överför mikrotiterplattan till en plattläsare för fluorescensdetektion och analys med hjälp av de beskrivna plattläsarinställningarna (för mCherry): excitation: 587 nm, emission: 610 nm, våglängdsbandbredd: 12 nm, optik: topp, temperatur: 37 °C, med fluorescensavläsningar som samlas in var 5:e minut under 4 timmars total lästid. Inkubera plattorna genom att skaka på en pulsad inställning vid 60 rpm.
  7. Ladda upp resultaten till JMP DOE-designen och generera en prediktionsprofil för att bestämma de optimala koncentrationsnivåerna för K-glutamat, Mg-glutamat och DTT baserat på önskade svarsvariabler; I detta fall var den maximala fluorescensen och reaktionshastigheten responsvariablerna.
  8. Kombinera reagenserna som visas i tabell 3 för att skapa 2X CFPS-bufferten
  9. Alikvot och förvaras vid −80 °C

7. Glasfiberramar i frystorkade hydrogeler (metod A)

OBS: Plasmiderna som användes i CFPS-reaktionerna skapades med hjälp av komponenter från EcoFlex modulära verktygslåda för E. coli36 och beskrivs i Whitfield et al.11 mCherry och eGFP kontrollerades av den konstitutiva JM23100 promotorn. Dessa komponenter är tillgängliga från Addgene.

  1. Återvinn det cellfria extraktet från −80 °C lagring och tina på is i cirka 20 minuter.
  2. Samla in 2x CFPS-bufferten och plasmid-DNA:t och tina på is.
  3. Samla upp de frystorkade hydrogelerna och låt dem nå rumstemperatur i 15 minuter genom att låta gelerna stå på bänken.
  4. Överför gelerna till 1,5 ml mikrocentrifugrör, trimma gelerna med en skalpell om det behövs för att få dem att passa i brunnarna.
  5. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, kombinera 10 μL cellfritt extrakt med 25 μL 2x CFPS-buffert och 4 μg plasmid-DNA; Fyll till en total volym på 50 μL med ddH2O för att skapa CFPS-lösningen.
  6. Pipettera CFPS-lösningen på de frystorkade hydrogelerna.
  7. Låt gelerna ligga i blöt i CFPS-systemet i 5-10 minuter i rumstemperatur.
  8. Överför gelerna till en svart 384-brunns mikrotiterplatta med hjälp av en spatel.
  9. Överför mikrotiterplattan till en plattläsare för fluorescensdetektion och analys med hjälp av plattläsarinställningarna som beskrivs i steg 6.6. Representativa resultat finns tillgängliga i tidigare studier31,33.

8. Cellfri proteinsyntes i utfällbara hydrogeler (metod B)

  1. Återvinn cellfritt extrakt från −80 °C lagring och tina på is i cirka 20 minuter.
  2. Samla plasmid-DNA och tina på is.
  3. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på is, kombinera 10 μL cellfritt extrakt med 3 μg plasmid-DNA och 25 μL 2x CFPS-buffert, vilket ger en total volym på 37,5 μL.
  4. Mät upp 3 g agaros och tillsätt till 100 ml ddH2O buffert för att skapa 3 % agaros.
  5. Mikrovågsugn 3% agaros på 30 s brister vid hög effekt.
  6. Pipettera 12,5 μL smält agaros i 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller CFPS-blandning till en total volym av 50 μL.
  7. Låt den smälta agarosen svalna, men polymerisera inte, utan låt agarosen ligga i ett värmeblock inställt på 50 °C.
  8. Kombinera den smälta agarosen med CFPS-lösningen; blanda via pipettering och omrörning med spetsen, och se till att röra dig snabbt för att undvika gelpolymerisation innan CFPS-lösningen kan blandas i.
  9. Låt gelerna svalna i rumstemperatur och polymerisera i cirka 2 minuter.
  10. Överför den polymeriserade agarosen till 1,5 ml mikrocentrifugrör med en spatel och snabbfrys i flytande kväve.
  11. Placera de snabbfrysta hydrogelerna i −80 °C i 1 timme.
  12. Återvinn gelerna från lagring; Ta bort mikrocentrifugrörets lock, täck rören med vaxfilm och stick hål på filmen så att fukten kan torkas bort.
  13. Aktivera frystorken med följande inställningar: temperatur: −20 °C, tryck: 0.1 mbar, frystorkning i 18 timmar (över natten).
  14. Förvara de frystorkade CFPS-enheterna i −80 °C förvaring fram till användning.
  15. De frystorkade CFPS-enheterna, med en ungefärlig våtvolym på 50 μL, kan rehydreras med 50 μL ddH2O utan överskott av vätska. Återfuktning tar cirka 30 min.
  16. Överför gelerna till en svart 384-brunns mikrotiterplatta med hjälp av en spatel.
  17. Överför mikrotiterplattan till en plattläsare för fluorescensdetektion och analys med hjälp av plattläsarinställningarna som beskrivs i steg 6.6. Representativa resultat finns tillgängliga i tidigare publikationer31,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver två metoder för att bädda in CFPS-reaktioner i hydrogelmatriser, där figur 1 visar en schematisk översikt över de två tillvägagångssätten. Båda metoderna är mottagliga för frystorkning och långtidsförvaring. Metod A är den mest använda metoden av två skäl. För det första har det visat sig vara den mest tillämpliga metoden för att arbeta med en rad hydrogelmaterial11. För det andra möjliggör metod A parallell testning av genetiska konstruktioner. Metod B är lämpligare för tillverkning av ett optimerat system och fältdistribution. Båda protokollen gör det möjligt att förbereda många prover på en gång för att hjälpa till med experimentell reproducerbarhet. Denna funktion är också användbar för den långsiktiga utvecklingen av tekniken, eftersom frystorkade enheter kan levereras i torrt tillstånd och rekonstitueras på plats vid behov.

Det tillvägagångssätt som beskrivs i protokollet och figur 1 kan användas för uttryck av enskilda genkonstruktioner eller för samuttryck av flera gener. De data som presenteras i figur 2 visar uttrycket av både eGFP och mCherry i en 0,75 % agarosgel. Konfokalmikroskopi användes för att bekräfta att proteinuttrycket var homogent i hela hydrogelen, inklusive inom de inre planen. Specifikt var proteinsyntesen inte begränsad till hydrogelens ytterkanter, och inre fluorescens var inte resultatet av proteindiffusion. För att bekräfta detta, genom att placera en eGFP-uttryckande hydrogel i fysisk kontakt med en mCherry-uttryckande hydrogel, var det möjligt att se proteindiffusion från en hydrogel till en annan. Diffusionshastigheten mellan de två var otillräcklig för att förklara den omfattande lokaliseringen av antingen röd eller grön fluorescens inuti materialet. Detta experiment illustrerar också en viktig fördel med att använda cellfria enheter i hydrogeler - enhetens funktionalitet kan organiseras rumsligt på ett sätt som inte är möjligt i vätskecellsfria reaktioner. För att skapa gennätverk krävs dessutom samtidig syntes av mer än en enda genprodukt. Resultaten som visas i figur 2 (nedersta raden) bekräftade samuttrycket av både mCherry och eGFP i agaros. I detta arbete uttrycktes båda proteinerna, och det fanns ingen rumslig konkurrens mellan proteinerna. Återigen visar en överlagring av det röda och gröna våglängdsområdet den jämna rumsliga fördelningen av båda proteinerna i hydrogelen.

Tabell 1: 14x energilösningsaktier. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Design av en experimentell matris för optimering av DTT, Mg-glutamat och K-glutamat inom de cellfria proteinsyntesreaktionerna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: De 2x CFPS-buffertkomponenterna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av de två protokollen. I den första metoden (metod A, demonstrerad i denna artikel) bereds hydrogelmaterial först och frystorkas sedan (steg 1) utan cellfria komponenter. Dessa torkade hydrogeler kan lagras och rekonstitueras vid behov (steg 2) med rätt volym cellfri reaktion före inkubation för proteinproduktion (steg 3) Variantmetoden, metod B, innehåller alla eller några av de cellfria reaktionskomponenterna i den initiala hydrogeltillverkningen. Efter frystorkning (steg 1) kan hydrogelerna sedan rekonstitueras i enbart vatten eller i en buffert som innehåller en analyt av intresse (steg 2). Proteinproduktionen (steg 3) fortsätter som tidigare. En tredje metod, där frystorkade cellfria komponenter rekonstitueras med hydrogelpolymerer, beskrivs i Whitfield et al.11 men har hittills endast använts med ett begränsat antal hydrogeler. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Cellfri proteinsyntes av eGFP och mCherry i en hydrogel med hjälp av E. coli-celllysat. Agarosgeler (0,75 %) framställdes utan DNA-mall (överst) med 4 μg av antingen eGFP- eller mCherry-mall (mitten) eller med 4 μg av både eGFP- och mCherry-mall (nederst). Hydrogelerna inkuberades i 4 timmar innan konfokalmikroskopi i de röda och gröna kanalerna. En överlagring av de två kanalerna visas också, och överlägget inkluderar DIC-bilden (Differential Interference Contrast). Hydrogeler innehållande antingen eGFP- eller mCherry-mall bereddes separat men inkuberades i fysisk kontakt med varandra. Geldiametern är 6 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskrivs två protokoll för inkorporering av E. coli-celllysatbaserade CFPS-reaktioner i agaroshydrogeler . Dessa metoder möjliggör samtidig genuttryck i hela materialet. Protokollet kan anpassas för andra CFPS-system och har framgångsrikt genomförts med kommersiellt tillgängliga CFPS-kit utöver de laboratorieframställda celllysaten som beskrivs här. Viktigt är att protokollet tillåter genuttryck i frånvaro av en extern vätskefas. Detta innebär att systemet är fristående och inte kräver ett cellfritt reaktionsbad. Till skillnad från tidigare metoder där CFPS-reaktioner inträffade i hydrogeler, tas kravet på externa buffertar och reaktionskärl bort med denna metod. Det förväntas att dessa metoder kommer att göra det möjligt för forskare att utforska användningen av hydrogelmaterial som chassi för cellfria enheter med syntetisk biologi, vilket i slutändan ger en väg för att flytta sådana enheter från laboratoriet.

Avgörande för framgången för båda tillvägagångssätten är användningen av celllysat av hög kvalitet. Ett celllysat av hög kvalitet bör ha en hög proteinkoncentration (>40 mg/ml), bör förvaras kallt under beredningen och bör inte ha genomgått upprepade frys-upptiningscykler. Dessutom är det viktigt att DNA-mallarna är av hög renhet. För att uppnå detta bör plasmider extraheras från celler med hjälp av ett plasmidförberedelsekit med hög renhet och hög avkastning för transkriptionsreaktioner för att fortsätta inom CFPS-miljön. Dessa kritiska steg är gemensamma för alla CFPS-tillämpningar och är inte unika för denna metod. Icke desto mindre är det utarbetandet av GFPS-komponenter som har störst inverkan på protokollens effektivitet. När det gäller materialen måste en effektiv och snabb frystorkning av hydrogelerna uppnås. Om frystorken inte når en tillräckligt kall temperatur (under −45 °C) kommer gelen att torkas i stället för att frystorkas, vilket kan äventyra hydrogelmatrisens inre struktur och kan orsaka nedbrytning av de inbyggda CFPS-systemen. Metod B har också ett unikt problem; När CFPS-blandningen tillsätts till den smälta agarosen för att bilda gelén måste den smälta agarosen svalna tillräckligt innan CFPS-blandningen tillsätts för att förhindra termisk nedbrytning till CFPS-reaktionerna. Att låta agarosen svalna för mycket kommer dock att resultera i polymerisation av gelen och förhindra tillsats av CFPS-systemet. Slutligen har hydrogeler en viss grad av autofluorescens, vilket kan komma i konflikt med de fluorescenssignaler som genereras under CFPS-reaktionerna. Det är därför viktigt att inkludera lämpliga negativa kontroller och genetiska rapportörer som inte har samma fluorescensegenskaper som materialet.

Protokollen som demonstreras här fokuserar på användningen av agaros som modellhydrogel. Agaros är ett utmärkt modellsystem för detta arbete eftersom det är allmänt tillgängligt, billigt och visar utmärkta proteinproduktionsmöjligheter. Tidigare undersökningar har också visat att agaros kan vara ett substitut för trängselmedlet PEG i CFPS-reaktioner, vilket indikerar att interaktionerna mellan polymerchassit och CFPS-reaktionerna kan öka proteinproduktionen11. Dessa metoder är dock också mottagliga för modifieringar med hjälp av ett brett spektrum av alternativa hydrogelmatriser med varierande fysikaliska och kemiska egenskaper. Metoden har tillämpats på xantangummi, alginat, acylgellangummi, polyakrylamid, hyaluronsyrahydrogeler och poloxamergelerna F-108 och F-1279. I vissa scenarier observeras minskad proteinproduktion jämfört med vätskekontroller eller andra hydrogeler. I dessa scenarier kan dock en kompromiss uppfyllas, där själva materialets funktionalitet (t.ex. dess vidhäftningsegenskaper eller biokompatibilitet) är av betydande fördel så att en minskning av proteinproduktionen kan accepteras. Modifieringar av koncentrationerna av hydrogelerna kan också göras. För agaros är metoderna känsliga för polymerkoncentrationer i intervallet 0,5%-1,5% w/v, till exempel. En högre gelkoncentration resulterar vanligtvis, i materialmening, i en mer robust anordning som är mer motståndskraftig mot hantering och bättre bevarar CFPS-reaktionen inuti. Avvägningen med ökad gelkoncentration är dock att reaktionen kan ha en minskad produktionshastighet eller proteinutbyte11,37. Förhållandet mellan polymerkoncentrationen och proteinproduktionen är dock inte linjärt och varierar beroende på vilken hydrogel som används11. Som sådan, för alla nya hydrogelpolymerer, krävs en viss grad av experiment för att balansera materialfunktionalitet mot cellfri funktionalitet.

Att bädda in CFPS-reaktioner i hydrogelmaterial utan behov av externa buffertar är en intressant väg för användning av cellfria enheter. Cellfria enheter har fördelen att de eliminerar behovet av att släppa ut genetiskt modifierade organismer utanför en kontrollerad laboratoriemiljö. Dessutom tar inbäddning av reaktioner i hydrogeler bort behovet av reaktionskärl (vanligtvis plastartiklar) efter beredning. Med tanke på att många hydrogeler är biologiskt nedbrytbara erbjuder detta en potentiell väg för att minska plastavfallet. På samma sätt visar det protokoll som beskrivs här också att både hydrogel och CFPS är mottagliga för frystorkning. Även om upprepade cykler av frystorkning inte rekommenderas och sannolikt kommer att skada CFPS- och hydrogelfunktionen, för engångsprodukter. Möjligheten att frystorka och rekonstituera komponenterna minskar enhetens vikt och tar bort kravet på en kylkedja under transport. Dessa egenskaper förenklar i slutändan logistiken och minskar transportkostnaderna för enheterna. Vidare har hydrogeler många användbara funktionella egenskaper i sig; De kan till exempel fungera som pastor, smörjmedel och lim. Hydrogeler kan också vara biokompatibla, biologiskt nedbrytbara och ha stimuli-svar i sin egen rätt. Sammantaget kan en synergi uppnås mellan biologisk funktionalitet och materialvetenskap för att skapa en ny klass av bioprogrammerbara material.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Författarna är mycket tacksamma för stödet från Biotechnology and Biological Sciences Research Council Awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) och BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), och Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data som stöder denna publikation är öppet tillgängliga på: 10.25405/data.ncl.22232452. För open access-ändamål har författaren tillämpat en Creative Commons Attribution (CC BY)-licens på alla Author Accepted Manuscript-versioner som uppstår.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Tags

Biologi utgåva 196 Cellfri proteinsyntes CFPS syntetisk biologi syntetiska gennätverk hydrogeler biosensorer genuttryck proteinuttryck
Metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogeler på makronivå
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield,… More

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter