Summary
Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.
Abstract
Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) zijn nanoblaasjes die zijn afgeleid van bacteriën die een actieve rol spelen in de communicatie tussen bacteriën en bacteriën, waarbij bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren worden overgedragen die zijn geërfd van de ouderbacteriën. BEV's afgeleid van de darmmicrobiota hebben effecten in het maagdarmkanaal en kunnen verre organen bereiken, wat resulteert in aanzienlijke implicaties voor fysiologie en pathologie. Theoretisch onderzoek naar de soorten, hoeveelheden en rollen van BEV's afkomstig van menselijke uitwerpselen is cruciaal voor het begrijpen van de afscheiding en functie van BEV's uit de darmmicrobiota. Deze onderzoeken vereisen ook een verbetering van de huidige strategie voor het isoleren en zuiveren van BEV's.
Deze studie optimaliseerde het isolatie- en zuiveringsproces van BEV's door twee dichtheidsgradiëntcentrifugatiemodi (DGC) vast te stellen: Top-down en Bottom-up. De verrijkte verdeling van BEV's werd bepaald in fracties 6 tot en met 8 (F6-F8). De effectiviteit van de aanpak werd geëvalueerd op basis van deeltjesmorfologie, grootte, concentratie en eiwitgehalte. De terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten werden berekend en de aanwezigheid van specifieke markers werd geanalyseerd om het herstel en de zuiverheid van de twee DGC-modi te vergelijken. De resultaten gaven aan dat de top-down centrifugatiemodus lagere verontreinigingsniveaus had en een terugwinningspercentage en zuiverheid bereikte die vergelijkbaar waren met die van de bottom-upmodus. Een centrifugatietijd van 7 uur was voldoende om een fecale BEV-concentratie van 108/mg te bereiken.
Afgezien van uitwerpselen, kan deze methode worden toegepast op andere soorten lichaamsvloeistoffen met de juiste modificatie volgens de verschillen in componenten en viscositeit. Concluderend kan worden gesteld dat dit gedetailleerde en betrouwbare protocol de gestandaardiseerde isolatie en zuivering van BEV's zou vergemakkelijken en zo een basis zou leggen voor latere multi-omics-analyse en functionele experimenten.
Introduction
De darm wordt algemeen erkend als het orgaan dat de meest voorkomende microbiële gemeenschappen in het menselijk lichaam herbergt, met meer dan 90% van de bacteriën die betrokken zijn bij kolonisatie en vermenigvuldiging 1,2. Uitgebreid bewijs heeft aangetoond dat de darmmicrobiota de darmmicro-omgeving moduleert en tegelijkertijd interageert met disfunctie in verre organen, voornamelijk via een verminderde darmbarrière 3,4. Toenemend bewijs wijst op een correlatie tussen de onbalans van de darmmicrobiota en de progressie van inflammatoire darmaandoeningen (IBD)5,6, evenals cognitieve stoornissen via de darm-hersenas 5,6,7,8. Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) geproduceerd door bacteriën spelen een belangrijke rol in deze pathologische processen.
BEV's zijn deeltjes op nanoschaal die bacteriële derivaten inkapselen, met diameters variërend van 20 tot 400 nm. Van hen is aangetoond dat ze interacties tussen bacteriën en hun gastheerorganismen vergemakkelijken 9,10. Ondanks hun onzichtbaarheid hebben deze deeltjes steeds meer aandacht gekregen van onderzoekers vanwege hun toekomstige brede toepassingen als diagnostische biomarkers, therapeutische doelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Menselijke uitwerpselen, vaak gebruikt als biospecimens voor het bestuderen van BEV's, voornamelijk afkomstig van darmbacteriën, bevatten een complex mengsel van onder andere water, bacteriën, lipiden, eiwitten, onverteerde voedselresten en geëxfolieerde epitheelcellen. De ingewikkelde fecale samenstelling vormt een uitdaging voor de isolatie en zuiverheid van BEV's, waardoor een uitgebreide, objectieve en realistische analyse van BEV's wordt belemmerd. Vandaar dat effectieve strategieën om interferentie door verontreinigende componenten te minimaliseren en de opbrengst van BEV's te verbeteren, naar voren zijn gekomen als kritieke problemen die onmiddellijke aandacht verdienen.
Bestaande isolatiestrategieën zijn grotendeels gebaseerd op technieken zoals ultrasnelle centrifugatie (UC), dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)12,13,14,15,16,17. Momenteel is DGC een van de meest toegepaste methoden op het gebied van BEV-scheiding, die twee sedimentatie-zwevende modi omvat, "Top-down" en "Bottom-up", die worden bepaald door de initiële laadpositie van het monster. Deze methodologieën onderscheiden extracellulaire vesikels (EV's) van andere componenten op basis van verschillen in grootte en dichtheid, wat variabele zuiverheid en terugwinningspercentages oplevert. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat enkelvoudige benaderingsstrategieën onvoldoende zijn om EV's adequaat te scheiden van oplosbare eiwitten in lichaamsvloeistofmonsters, zoals lipoproteïne in bloed18 en Tamm-Horsfall-eiwit in urine19. Bovendien overlapt de grootteverdeling van eukaryote extracellulaire vesikels (EEV's) vaak met die van BEV's, waardoor verdere methodologische verbeteringen nodig zijn om de BEV-opbrengst te optimaliseren. Bijgevolg hangt het bevorderen van de studie van BEV's af van de ontwikkeling van effectieve scheidings- en zuiveringsmethoden. Met name Tulkens et al 15 gebruikten een orthogonale biofysische strategie om fecale BEV's te scheiden van EEV's, waarbij de centrifugatietijd van een bottom-up DGC-modus maximaal18 uur was. Deze studie daarentegen heeft het teruggebracht tot 7 uur, waardoor de gradiënt-ultracentrifugatietijd aanzienlijk werd bespaard en het proces werd vereenvoudigd.
In de huidige studie hebben we fecale BEV's geïsoleerd en gezuiverd met behulp van twee DGC-modi onder geoptimaliseerde bufferomstandigheden, na BEV's te hebben verrijkt met een reeks differentiële centrifugatiesnelheden, van lage tot extreem hoge snelheid. Evaluaties op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie wezen op een lovenswaardige prestatie van deze verbeterde methode. Deze studie zou als basis kunnen dienen voor toekomstig onderzoek, waarbij de toepassingen ervan worden uitgebreid naar een breder domein en inzicht wordt geboden in de heterogeniteit van BEV's binnen het menselijk lichaam. Het draagt ook bij aan de standaardisatie van BEV-scheidings- en analysetechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ethische commissie van het Nanfang Hospital, Southern Medical University, keurde deze studie goed, die werd uitgevoerd met de geïnformeerde toestemming van de deelnemers. Alle methoden die hierin worden gebruikt, voldoen aan de standaard operationele richtlijnen van de International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle daaropvolgende procedures voor vloeistofbehandeling moesten verplicht worden uitgevoerd binnen een bioveiligheidskast of een ultraschone bank.
1. Verzamelen en veraliseren van ontlastingsmonsters
- Verdeel een ontlastingsmonsternemer, een verzegelde zak en een ijsdoos en geef de deelnemers uitgebreide instructies over het aanschaffen en bewaren van de monsters.
- Instrueer elke deelnemer om hun ontlastingsmonster te verzamelen met behulp van de meegeleverde monsternemer en om het binnen 24 uur bij een temperatuur van 4 °C naar het laboratorium te vervoeren.
- Gebruik na ontvangst in het laboratorium een steriele lepel om minder dan 3,5 g ontlasting in een vooraf gewogen centrifugebuis van 50 ml te doen. Noteer het gewicht van het fecale monster op de buis voor volgende voorbehandelingsprocedures.
PAUZEPUNT: Als onmiddellijke verwerking van de monsters niet haalbaar is, wijs het monster dan toe voor langdurige opslag bij -80 °C na de juiste notatie.
2. Voorbereiding van het uitwerpselenmonster
- Koel 500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °C. Filtreer de voorgekoelde PBS door een polyethersulfon (PES)-filter van 0,22 μm met behulp van een injectiespuit van 50 ml in tien centrifugatiebuisjes van 50 ml.
- Plaats twee buisjes van 50 ml op ijs, elk met 3,5 g fecale monsters. Voeg 35 ml PBS toe aan elke buis.
NOTITIE: Bereken de benodigde hoeveelheid PBS voor het oplossen van ontlasting en zorg voor een maximale monsterconcentratie van 10% (m/v). Als u extra monsters verwerkt, gebruik dan indien nodig meer buisjes. - Schud de monsters gedurende 2 uur bij 4 °C bij 300 tpm of plaats ze gedurende 8 uur ten minste 4 °C totdat de ontlasting zichtbaar volledig in suspensie is.
3. Centrifugeren met differentiële snelheid
- Koel de koelcentrifuge met hoge snelheid tot 4 °C.
- Pas het gewicht van de twee buisjes met de in stap 2.3 met PBS bereide monsters aan om een totaalgewicht van 0,1 g te bereiken.
- Centrifugeer de monsters bij 3.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Pipetteer het supernatans voorzichtig in twee schone centrifugebuisjes van 50 ml, waarbij u ongeveer 1 ml boven de pellet laat. Gebruik voor dit proces een plastic pasteurpipet voor eenmalig gebruik.
- Pas het gewicht van de twee buisjes aan met PBS om een totaalgewicht van minder dan ± 0.1 g te bereiken.
- Centrifugeer het overgebrachte supernatans bij 12.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatans op met een spuit van 20 ml, verwijder de naald van de spuit en filtreer het door filters van 0,22 μm in buisjes van 50 ml. Op dit punt moet het supernatansvolume ongeveer 30 ml zijn.
OPMERKING: Als er na het centrifugeren van 12.000 × g nog steeds een aanzienlijke hoeveelheid onzuiverheid zichtbaar is, moet de centrifugeerstap bij 12.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C worden herhaald. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot een aanzienlijk verlies van BEV's als gevolg van verstopping van de poriën tijdens filtratie.
4. Centrifugeren met ultrahoge snelheid
- Reinig de rotor en de emmer door ze af te vegen met 75% (v/v) alcohol om eventuele restverontreiniging te verwijderen.
- Plaats een ultracentrifugebuisje van 38,5 ml in de slanghouder.
NOTITIE: Selecteer de juiste ultracentrifugebuis op basis van het monstervolume. Vermijd ultraviolette straling en ongeschikte chemische reagentia voor het steriliseren van centrifugaalbuisjes, zoals aangegeven in de producthandleiding. - Breng ongeveer 30 ml van het gefilterde fecale supernatans van stap 3.7 over in de ultracentrifugebuis.
- Vul de ultracentrifugebuis met ongeveer 8 ml PBS en laat een opening van 3 mm over vanaf de opening van de buis.
- Plaats de twee ultracentrifugebuisjes met de monsters in tegenoverliggende ultracentrifugatie-emmers, bijvoorbeeld emmer 1 komt overeen met 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Pas het gewicht van de twee emmers aan met PBS om een totaalgewicht van minder dan ± 0.005 g te bereiken.
- Monteer alle bakken op de rotor, ongeacht of de buizen geladen zijn.
- Start het vacuüm en centrifugeer de monsters bij 160.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
- Laat het kamervacuüm los en open de deur zodra Ready wordt weergegeven op de startpagina van het instrument.
- Verwijder de rotor uit de ultracentrifuge.
- Verplaats de emmers van de rotor naar het rek en haal de buizen op met behulp van een tang.
- Gooi het supernatant weg, dat aan de onderkant zichtbare bruine korrels bevat.
- Resuspendeer de pellets door ze herhaaldelijk op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μl met 1 ml voorgekoelde (4 °C) PBS totdat ze volledig zijn gesuspendeerd. Vul de buis met ongeveer 37 ml PBS en laat een opening van 3 mm vanaf de opening.
- Voer nog een ultracentrifugatie uit volgens de stappen 4.5-4.11 bij 160.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C om gedeeltelijk aangehechte verontreinigende componenten van de buiswanden te verwijderen.
- Gooi het supernatant weg, keer de twee ultracentrifugebuisjes 5 minuten om en verwijder de resterende oplossing op de binnenwand met ruitenwissers.
NOTITIE: Door de binnenwand te reinigen, wordt interferentie door resterende verontreiniging die zich aan de wand van de ultracentrifugebuis hecht, tot een minimum beperkt. Kies ruitenwissers die geen invloed hebben op de BEV-analyse, met name wat betreft de deeltjesgrootte. - Resuspendeer de pellets in elke buis door ze op en neer te pipetteren met 1,2 ml voorgekoelde (4 °C) PBS met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Breng 1,2 ml van de PBS/BEV-oplossing over van een ultracentrifugebuisje naar een schoon microbuisje van 1,5 ml.
PAUZEPUNT: De PBS/BEV-oplossing die uit één ultracentrifugebuis wordt verzameld, kan doorgaan naar stap 6. Bewaar de oplossing uit de andere tube bij -80 °C.
5. Oplossingsvoorbereiding voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie
- Bereiding van 0,02 M HEPES-buffer
- Combineer 0,477 g HEPES-poeder en 0,8 g NaCl met 90 ml geautoclaveerd gedeïoniseerd water.
- Pas de pH aan tot 7,2 door 1 M natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen. Breng het volume op 100 ml met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing door PES-membranen van 0,22 μm.
LET OP: Natriumhydroxide is een sterke bijtende alkali. Operators moeten het zorgvuldig hanteren en bereiden in een zuurkast.
- Voorbereiding van de dichtheidsgradiëntbuffer
- Bereken het vereiste volume van elke dichtheidsgradiëntbuffer op basis van het aantal ultracentrifugebuisjes voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie (stap 6) (In dit protocol waren de volumes voor 60%, 50%, 40%, 20% en 10% gradiëntoplossingen respectievelijk 2.5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml en 6 ml).
- Voor de bereiding van een 50% (m/v) jodixanol-werkoplossing, meng de 0,02 M HEPES-buffer en 60% (m/v) jodixanol-bouillonoplossing in een volumeverhouding van 1:5 (0,5 ml:2,5 ml).
OPMERKING: Gebruik een wegwerpspuit van 20 ml om de jodixanol-bouillonoplossing op te zuigen en vermijd het inbrengen van lucht. - Om jodixanolbuffers met verschillende concentraties te bereiden, combineert u de 50% jodixanol-werkoplossing uit stap 5.2.2 met de HEPES-buffer verkregen in stap 5.1 met behulp van een pipet van 1.000 μl volgens de verhoudingen in tabel 1.
NOTITIE: Voer stap 5 uit op een ultraschone werkbank met de lichten uit. Bewaar de geopende jodixanol bouillonoplossing in de koelkast bij 4 °C om bacteriegroei te voorkomen. Houd de jodixanoloplossing en de HEPES-buffer beschermd tegen licht.
6. Opzetten van een dichtheidsgradiëntcentrifugatiesysteem
- DGC-modus van bovenaf
- Combineer 500 μL PBS/BEV-oplossing geïsoleerd uit stap 4 met 3 ml PBS. Meng de oplossingen voorzichtig met een pipet van 1.000 μl om 3,5 ml PBS/BEV-oplossing te verkrijgen.
- Plaats een ultracentrifugebuisje van 31 ml op een schuimplaat met gaten en label het als "↓".
- Voeg verticaal 3 ml van de 50% iodixanoloplossing toe aan de bodem van de buis met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Kantel de buis in een hoek van 70° en plaats een buishouder of andere steun iets boven het niveau van de schuimplaat, onder de opening van de buis.
- Voeg 3 ml 40% jodixanoloplossing toe aan de 50% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Voeg 3 ml 20% jodixanoloplossing toe aan de 40% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Voeg 3 ml 10% jodixanoloplossing toe aan de 20% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Voeg 3,5 ml PBS/BEV-oplossing uit stap 6.1.1 toe aan de 10% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Zet de buizen voorzichtig weer rechtop.
OPMERKING: Na het pipetteren moet de gelaagdheid zichtbaar zijn.
- Bottom-up DGC-modus
- Plaats een ultracentrifugebuis van 31 ml op een schuimplaat met gaten en label deze als "↑".
- Voeg verticaal 2,5 ml van de 60% iodixanol-voorraadoplossing toe aan de bodem van de buis. Meng het voorzichtig met 500 μL PBS/BEV-oplossing geïsoleerd uit stap 4 met behulp van een pipet van 1.000 μl om 3 ml 50% jodixanol/BEV-oplossing te verkrijgen.
- Kantel de buis in een hoek van 70° en plaats een buishouder of andere steun iets boven het niveau van de schuimplaat, onder de opening van de buis.
- Voeg 3 ml van de 40% jodixanoloplossing toe aan de 50% jodixanol/BEV-oplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Voeg 3 ml van de 20% jodixanoloplossing toe aan de 40% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1000 μl.
- Voeg 3 ml van de 10% jodixanoloplossing toe aan de 20% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1000 μl.
- Voeg 3,5 ml PBS toe aan de 10% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
- Zet de buizen voorzichtig weer rechtop.
- Op dit punt bleef 200 μL van de in stap 4.17 verkregen suspensie over, die vervolgens kan worden geanalyseerd als een groep met de naam "UC".
OPMERKING: Houd bij het overbrengen van oplossingen in stap 6 de pipetpunt altijd tegen de wand van de ultracentrifugebuis loodrecht op de as van de buis.
7. Centrifugatie van de dichtheidsgradiënt en fractieverzameling
- Pas het gewicht van de twee buizen aan met PBS om een totaal gewicht binnen ± 0.005 g te bereiken.
- Plaats de buisjes in de emmers volgens stap 4.5 en dompel ze gedurende 7 uur bij 4 °C onder druk van 160.000 × g .
- Verzamel de fracties met behulp van een pipet (1000 μL) van boven naar beneden tegen de zijwand in de volgende volgorde: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml en 3 ml in een ultracentrifugebuis van 38,5 ml.
NOTITIE: Houd de zichtlijn op hetzelfde niveau als het vloeistofoppervlak. - Voer ultracentrifugatie uit voor elke fractie die is verkregen in stap 7.3 volgens stap 4 bij 160.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatans en keer de ultracentrifugebuisjes gedurende 5 minuten om.
- Resuspendeer de pellets in 200 μl voorgekoelde (4 °C) PBS met behulp van een pipet van 200 μl.
- Breng de PBS/BEV-oplossing over in een schone microbuis van 1,5 ml.
- Label de breuken van F1 tot F10 en analyseer ze op basis van stap 8.
PAUZEPUNT: Als de in stap 7.8 verkregen monsters niet onmiddellijk kunnen worden verwerkt, bewaar ze dan bij -80 °C.
8. Karakterisering en kwantitatieve analyse van de verzamelde fracties
- Bepaal de extinctiewaarden (OD 340 nm) van elke fractie met behulp van een microplaatdetector met een blanco regeling om de overeenkomstige dichtheid te berekenen.
OPMERKING: Vervang de PBS/BEV-oplossing (stap 6.1.1 en stap 6.2.2) door PBS om een blanco regeling tot stand te brengen.- Bereid 100 μl van elk 0%, 5%, 10%, 12,5% en 20% jodixanoloplossing verdund met 0,02 M HEPES op basis van 50% stockoplossing (stap 5.2.2) als standaarden, overeenkomend met dichtheden van respectievelijk 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml en 1,111 g/ml.
- Voeg 50 μl van elke fractie van de blancocontrole (bereid in stap 7.3) en 50 μl van elke standaardoplossing (bereid in stap 8.1.1) toe om putjes van een plaat met 96 putjes te dupliceren.
- Stel de golflengte in op 340 nm, meet de optische dichtheid van het eindpunt en bereken de dichtheid van elke fractie.
- Identificeer F4-F9 als het bereik van BEV-fracties op basis van hun dichtheid.
- Bepaal de eiwitconcentratie van de BEV-fracties met behulp van de bicinchoninezuurtest (BCA).
- Verdun de stof in het door de fabrikant verstrekte PBS om een standaardeiwitoplossing van 0,5 μg/μl te bereiden.
- Voeg de standaardeiwitoplossing (bereid in stap 8.2.1) toe met verschillende volumes volgens de instructies van het reagens, en vul elk putje van een plaat met 96 putjes aan met PBS tot een totaal volume van 20 μl.
- Voeg 20 μl van de in stap 7.8 bereide monsters en de monsters die overblijven na de in stap 6.2.9 gedefinieerde CU aan elk putje toe.
- Meng de reagentia A en B in een verhouding van 50:1 en breng 200 μL over naar elk putje.
- Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
- Meet de extinctiewaarde met behulp van een microplaatlezer, bereken de eiwitconcentratie (μg/μL) en bepaal het eiwitgehalte (μg) van de monsters op basis van de standaardcurve (x: optische dichtheid; y: eiwitconcentratie) die wordt gegenereerd op basis van de waarden van de standaardoplossingen die in stap 8.2.2 zijn verdund.
- Karakteriseer de BEV-fracties die zijn gedefinieerd in stap 8.1.4 met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om de aanwezigheid van BEV's te verifiëren. Alle onderstaande procedures moeten op ijs worden uitgevoerd.
- Breng 10 μl van elke geïsoleerde F4-F9-fractie uit stap 7.8 en de monsters die overblijven na UC gedefinieerd in stap 6.2.9 gedurende 20 minuten aan op Formvar/Carbon-ondersteunde koperroosters en dep af met filtreerpapier.
- Spoel de monsters driemaal gedurende 1 minuut met 100 μL PBS en dep ze af met filtreerpapier.
- Fixeer de monsters met 100 μL 1% (g/v) glutaaraldehyde gedurende 5 minuten en dep ze af met filtreerpapier.
- Was de roosters met 100 μL PBS tien keer gedurende 2 minuten en dep ze af met filtreerpapier.
- Kleur de roosters gedurende 10 minuten met 50 μl 1,5% (m/v) uranylacetaat en dep ze af met filtreerpapier.
LET OP: Uranylacetaat is radioactief en uiterst giftig bij contact met de huid of bij inademing. Hanteer oplossingen met uranylacetaat in een zuurkast en volg de juiste veiligheidsmaatregelen. - Leg de roosters gedurende 5 minuten op een druppel methylcellulose van 1% (m/v) en dep ze af met filtreerpapier.
- Bewaar de aan de lucht gedroogde roosters tot observatie in een donkere, stofvrije omgeving.
- Leg beelden vast en analyseer ze met behulp van een TEM.
- Karakteriseer de BEV-fracties die in stap 8.1.4 zijn gedefinieerd met behulp van nanodeeltjesvolganalyse (NTA) om het aantal deeltjes te tellen.
- Kalibreer het systeem met polystyreendeeltjes van 110 nm.
- Was het monsterbad met PBS.
- Verdun de monsters van verschillende fracties die in stap 7.8 zijn verkregen en de monsters die overblijven na de in stap 6.2.9 gedefinieerde CU tot een concentratie in het bereik van 105-10 9 deeltjes/ml, met een geoptimaliseerde concentratie van 107 deeltjes/ml.
- Registreer en analyseer op 11 posities met drie replicaties, waarbij de temperatuur rond de 23-30 °C wordt gehouden.
- Analyseer het eiwitgehalte van de monsters door middel van coomassie briljante blauwe kleuring (CBBS) en western blotting (WB).
- Verdun de BEV-monsters van verschillende fracties die in stap 7.8 zijn verkregen en de monsters die overblijven na de in stap 6.2.9 gedefinieerde CU met behulp van PBS en 5 × laadbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 of 1 μg/μl, indien kwantificering nodig is, en zorg ervoor dat de monsterbelasting in stap 8.5.2 voldoende 20 μl (10 μg of 20 μg) van elk putje bedraagt. Kook de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C.
- Monteer de geprefabriceerde polyacrylamidegel in de elektroforesetank en breng de monsters over naar de putten.
- Voer verticale elektroforese uit met de volgende parameters: 160 V gedurende 50 min.
- Kleur de gel gedurende 1 uur in Coomassie briljantblauwe oplossing, spoel af in gedeïoniseerd water totdat de blauwe achtergrond lichter wordt en leg foto's vast met een camera.
- Voer eiwitblotting-procedures uit voor andere gels met de volgende parameters: 400 mA gedurende 20 min.
- Blokkeer de deblottingmembranen met een 5% (w/v) BSA-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de membranen in TBST-buffer drie keer gedurende 5 minuten.
- Incubeer de membranen met primaire antilichamen (BEV-markers: LPS, OmpA, LTA; EEV-markers: CD63, CD9, TSG-101, Syntenine, Integrine β1; Andere contaminatiemarkers: flagelline, calnexine) gedurende 8-12 uur bij 4 °C.
- Was de membranen in TBST-buffer drie keer gedurende 10 minuten.
- Incubeer de membranen met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voer stap 8.5.9 uit.
- Ontwikkel het blotting met behulp van een chemiluminescentieapparaat.
- Vervang PBS/BEV-oplossing (stap 6.1.1 en stap 6.2.2) door BEV's van Escherichia coli om een positieve controle tot stand te brengen (zie de materiaaltabel voor de procedure voor het isoleren van ruwe E. coli-BEV's) en voer alle bovengenoemde experimenten uit voor de karakterisering van BEV's.
PAUZEPUNT: Bepaal F6-F8 als de verdeling van BEV-verrijkte fracties op basis van de resultaten van de hierboven beschreven karakterisering voor fecale BEV's, en gebruik dit vernauwde bereik voor latere analyse.
- Bereken de terugwinningspercentages in termen van deeltjes en eiwitten om de efficiëntie van de twee DGC-modi te beoordelen. Onderstaande resultaten worden weergegeven in percentages.
- Bereken de terugwinningspercentages van deeltjes in de top-downmodus: totaal aantal deeltjes in F6-F8/deeltjes na UC gedefinieerd in stap 6.2.9.
- Bereken de terugwinningspercentages van deeltjes in de bottom-upmodus: totale hoeveelheid deeltjes in F6-F8/deeltjes na UC gedefinieerd in stap 6.2.9.
- Bereken de terugwinningspercentages van eiwitten in de top-downmodus: totaal eiwitgehalte in F6-F8 (μg)/eiwitgehalte na CU gedefinieerd in stap 6.2.9 (μg).
- Bereken de terugwinningspercentages van eiwitten in de bottom-upmodus: totaal eiwitgehalte in F6-F8 (μg)/eiwitgehalte na CU gedefinieerd in stap 6.2.9 (μg).
- Bereken de verhouding tussen deeltjes en eiwitten om de zuiverheid te beoordelen die traditioneel wordt gedefinieerd van UC en de twee DGC-modi, en de onderstaande resultaten werden allemaal gepresenteerd als percentages.
- Verhouding deeltje/eiwit na CU gedefinieerd in stap 6.2.9: deeltjes na CU/eiwitgehalte na CU (μg).
- Deeltjes/eiwitverhouding in de Top-down-modus: totaal aantal deeltjes in F6-F8/eiwitgehalte in F6-F8 (μg).
- Deeltje/eiwitverhouding in de bottom-upmodus: totaal aantal deeltjes in F6-F8/eiwitgehalte in F6-F8 (μg).
- Selecteer de meest geschikte centrifugatiemodus (Top-down modus werd geselecteerd in het protocol) voor fecale BEV-zuivering en toekomstige analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bepaal de verdeling van BEV-verrijkte fracties
Om de verdeling van met bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkte fracties te bepalen, werd een blancocontrole ingesteld om de absorptiewaarden bij OD 340 nm te meten, en de dichtheid van elke fractie werd berekend op basis van de metingen en jodixanolrichtlijnen (stap 8.1). Tabel 2 geeft de dichtheidsresultaten weer, waaruit blijkt dat de fracties F4 tot en met F9 dichtheden vertoonden binnen het bereik dat doorgaans wordt geassocieerd met extracellulaire blaasjes. Deze bevinding suggereerde dat de meerderheid van de BEV's in deze fracties werd geïsoleerd, wat leidde tot de definitie van F4-F9 als het ruwe bereik voor BEV's. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd gebruikt om de morfologische kenmerken van fecale BEV's te karakteriseren, geïsoleerd zoals weergegeven in figuur 1 in fracties F4-F9. De TEM-beelden (Figuur 2) toonden de aanwezigheid van klassieke komvormige structuren, die kenmerkend zijn voor BEV's. Nanoparticle tracking analysis (NTA) en bicinchoninezuurtest (BCA) werden uitgevoerd om respectievelijk het aantal deeltjes en de eiwitconcentratie te bepalen, waardoor verdere evaluatie van de herstelpercentages en zuiverheid mogelijk werd. Figuur 3 toont de eiwit- en deeltjesconcentraties voor elke fractie, wat aangeeft dat F6 en F7 de hoogste concentraties vertoonden, gevolgd door F5 en F8. Vervolgens werden Coomassie briljante blauwe kleuring (CBBS) en western blotting (WB) uitgevoerd om een algehele eiwitanalyse te geven. De resultaten van CBBS waren consistent met de bevindingen van de eiwitconcentratie, waarbij F6 en F7 de meest intense banden vertoonden (Figuur 4). Om de verdeling van BEV's te bevestigen, werden extracellulaire blaasjes afgeleid van Escherichia coli gebruikt als positieve controle (gedefinieerd in stap 8.5.13). De isolatie- en zuiveringsprocedures volgden de stappen die zijn beschreven in de materiaaltabel en de bovengenoemde protocolsecties (stappen 3, 4). WB-analyse bevestigde verder de aanwezigheid van buitenmembraaneiwit A (OmpA), een belangrijk bestanddeel van het buitenmembraan van bacteriën en een specifieke marker voor BEV's, in fracties F6-F8. Op basis van deze resultaten werden de fracties F6-F8 gedefinieerd als BEV-verrijkte fracties die geschikt zijn voor latere experimenten en analyses.
Verificatie van het presentatiebereik van de interferentiecomponenten
Eukaryote extracellulaire vesikels (EEV's), die een vergelijkbare grootte en dichtheid hebben als BEV's, werden geïdentificeerd als een belangrijke interferentie in de analyse van BEV's. Om dit aan te pakken, werden drie EEV-eiwitten onderzocht in fracties 5-8 van zowel de Top-down als de Bottom-up modus, met centrifugatietijden van 7 uur en 15 uur. CD63, een EEV-geassocieerd transmembraaneiwit, werd voornamelijk gedetecteerd in F5, terwijl de BEV-marker LPS werd verrijkt in fracties 6-7. Dit patroon werd waargenomen in beide modi, hoewel de Bottom-up modus een lichte banding van CD63-EEV's in F7 vertoonde. Andere EEV-markers, CD9 en TSG-101, vertoonden echter geen zichtbare signalen in deze fracties, ongeacht de modi of centrifugatietijden. In een onafhankelijke experimentele onderneming werden antilichamen gericht op Syntenine en Integrine β1 gebruikt om de verrijking van verschillende eiwitmarkers die inherent zijn aan EEV's in fracties 5-8 vast te stellen. Syntenine werd prominent gedetecteerd in F5, met name in het kader van de Top-downbenadering, terwijl de aanwezigheid van integrine β1 werd waargenomen in F6 (Figuur 5). Om de aanwezigheid van storende deeltjes verder te beoordelen, werd Dil-gelabeld lipoproteïne met lage dichtheid (Dil-LDL) in het dichtheidsgradiëntsysteem geïntroduceerd en werd de fluorescentie-intensiteit gemeten over alle fracties. In de Top-down modus vertoonden fracties 1-4 relatief hogere fluorescentiewaarden, terwijl in de Bottom-up modus het F1-F6 was die hogere intensiteiten vertoonde (Figuur 6).
Beoordeel de terugwinningspercentages en zuiverheid van twee DGC-modi op basis van concentratie, deeltjesgrootte en markers van BEV's
Na het identificeren van F6-F8-fracties als BEV-verrijkte fracties, werden de terugwinningspercentages en zuiverheid van de twee dichtheidsgradiëntcentrifugatiemodi (DGC) geëvalueerd. De deeltjesgroottes van BEV-verrijkte fracties verkregen uit de Top-down-modus, Bottom-up-modus en ultracentrifugatie (UC) alleen werden vergeleken. De waargenomen deeltjesgroottes in beide centrifugatiemodi varieerden van 90 tot 300 nm, in lijn met de gedefinieerde diameter van BEV's (figuur 7). Vervolgens werden de deeltjes- en eiwitterugwinningspercentages van de twee modi berekend op basis van de deeltjes- en eiwitconcentraties voor en na DGC (tabel 3 en figuur 8). Met name de Bottom-up-modus vertoonde hogere herstelpercentages in vergelijking met de andere modus. In een aparte experimentele groep werd eiwitherstel in de twee modi geëvalueerd bij verschillende centrifugatietijden van 7 uur en 15 uur. Belangrijk is dat er geen statistisch significant verschil was in eiwitgehalte binnen F6-F8-fracties na DGC tussen de twee centrifugatietijden, ongeacht de gebruikte gradiëntmodus (figuur 9). De verhouding tussen deeltjes en eiwitten werd berekend om een ruwe beoordeling te geven van de zuiverheid in de twee modi. De gegevens wezen op geen significant verschil in zuiverheid tussen de modi. Daarnaast werden Coomassie briljante blauwe kleuring (CBBS) en western blotting (WB) uitgevoerd om de zuiverheid verder te vergelijken, waarbij de nadruk lag op drie BEV-markers (LPS, OmpA en LTA), één EEV-marker (CD63) en twee verontreinigende markers (Calnexin, Flagellin). De resultaten toonden een gedeeltelijke vermindering van storende stoffen na DGC, waarbij LPS en OmpA een prominentere aanwezigheid vertoonden in beide DGC-modi in vergelijking met CU alleen (Figuur 10).
Figuur 1: Schematische workflow van de isolatie en zuivering van BEV's. Afkortingen: BEV's = bacteriële extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve TEM-beelden van BEV-fracties. (A) TEM-beelden van BEV's geïsoleerd na CU. (B) TEM-beelden van BEV's die na DGC zijn geïsoleerd met behulp van de Top-down-modus. (C) TEM-beelden van BEV's die na DGC zijn geïsoleerd met behulp van de bottom-upmodus. Alle beelden werden gepresenteerd op een consistente schaal van 200 nm. Afkortingen: TEM = transmissie-elektronenmicroscoop; BEV's = bacteriële extracellulaire blaasjes; UC = ultracentrifugeren; DGC = dichtheidsgradiënt centrifugatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Eiwit- en deeltjesconcentratie van BEV-fracties na top-down en bottom-up DGC-modi. De eiwitconcentratie van BEV-fracties werd bepaald met behulp van BCA en wordt weergegeven door de grijze balken. De deeltjesconcentratie is gemeten met behulp van NTA en wordt weergegeven door de blauwe balken. Afkortingen: BEV = bacterieel extracellulair blaasje; DGC = dichtheidsgradiënt centrifugeren; BCA = bicinchoninezuurtest; NTA = analyse van het volgen van nanodeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bepaling van BEV-verrijkte fracties. (A) CBBS werd uitgevoerd om de fracties te bepalen die zijn verrijkt met fecale BEV's in zowel top-down als bottom-up modi. (B) EV's afgeleid van Escherichia coli werden geïsoleerd, gezuiverd en gebruikt als positieve controle in WB om de aanwezigheid en verspreiding van BEV's te bevestigen. OmpA: Buitenste membraaneiwit A, een BEV-marker. Afkortingen: BEV = bacterieel extracellulair blaasje; CBBS = coomassie briljante blauwe kleuring; EV's = extracellulaire blaasjes; WB = western blotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bevestiging van EEV-verdeling. Western blot-analyse van fracties 5-8 verkregen uit de top-down en bottom-up DGC-modi met verschillende ultracentrifugatieduur met dichtheidsgradiënt, 7 uur (A) en 15 uur (B). Er werd een onafhankelijke proef uitgevoerd die gericht was op F5 tot en met F8 als gevolg van een centrifugatieperiode van 7 uur, zoals aangetoond in (C) en (D). Geselecteerde markers waren onder meer markers geassocieerd met BEV's (LPS) en EEV's (CD63, CD9, TSG-101, Syntenine, Integrine β1). Afkortingen: DGC = dichtheidsgradiënt centrifugatie; BEV = bacterieel extracellulair blaasje; EEV = eukaryotisch extracellulair blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Verdeling van lipoproteïne met lage dichtheid. Dil-gelabeld lipoproteïne met lage dichtheid (Dil-LDL), beschouwd als een contaminatiemarker, werd in een concentratie van 10 μg toegevoegd aan het gradiëntsysteem in zowel de Top-down- als de Bottom-up-modus. Dil-LDL verving de PBS/BEV-oplossing (stap 6.1.1 en stap 6.2.2) om een detectiemodel op te stellen. De fluorescentie-intensiteit van elke fractie werd gemeten met behulp van een microplaatdetector met een excitatie-/emissiegolflengte van 549/565 nm. Afkorting: BEV = bacterieel extracellulair blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Deeltjesgroottes van met BEV's verrijkte fracties. (A) Deeltjesgrootteverdeling van ruwe BEV's verkregen na CU. (B) Deeltjesgrootteverdeling van met BEV verrijkte fracties (F6-F8) verkregen met behulp van de top-down dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC)-modus. (C) De deeltjesgrootteverdeling van met BEV verrijkte fracties (F6-F8) werd verkregen met behulp van de bottom-up DGC-modus. NTA werd ondernomen om de afmetingen van de deeltjes te kwantificeren. De verdunningsfactoren die werden gebruikt voor panels (AC) waren 10.000, 2.000 en 5.000, dienovereenkomstig, met de daaruit voortvloeiende resultaten gekalibreerd. Afkortingen: BEV = bacterieel extracellulair blaasje; UC = ultracentrifugeren; DGC = dichtheidsgradiënt centrifugeren; NTA = analyse van het volgen van nanodeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Terugwinningspercentages van eiwitten en deeltjes van top-down en bottom-up DGC-modi. (A) Eiwitterugwinningspercentages van de twee modi berekend als de verhouding van de eiwitconcentratie na en vóór DGC (UC). (B) De deeltjesterugwinningspercentages van de twee modi worden berekend door de verhouding van de deeltjesconcentratie na en vóór DGC (UC). (C) Deeltjes/eiwitverhoudingen van UC, Top-down en Bottom-up modi. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een tweezijdige, ongepaarde t-toets voor panels A en B, en eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) met Tukey post hoc-test voor panel C. Er werden geen significante verschillen waargenomen. Afkortingen: DGC = dichtheidsgradiënt centrifugatie; UC = ultracentrifugeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Vergelijking van eiwitterugwinning op basis van top-down en bottom-up DGC-modi met behulp van verschillende dichtheidsgeassocieerde ultracentrifugatietijden. Eiwitterugwinningspercentages in fracties F6-F8 verkregen uit gradiënt-ultracentrifugatie gedurende 7 uur en 15 uur werden geëvalueerd in onafhankelijke experimenten met behulp van zowel top-down- als bottom-up-modi. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) met Fisher's minst significante verschiltest. Er werden geen significante verschillen waargenomen. Afkortingen: DGC = dichtheidsgradiënt centrifugatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Zuiverheidsbeoordeling van top-down- en bottom-upmodi DGC. (A) CBBS werd uitgevoerd om de eiwitverdeling van UC-, top-down- en bottom-up-modi te vergelijken. (B) WB werd uitgevoerd om de zuiverheid van UC-, Top-down- en Bottom-up-modi te beoordelen. Calnexine: endoplasmatisch reticulum-geassocieerde eiwitmarker; Flagelline, contaminerende eiwitmarker van bacteriën. CD63: transmembraan eiwitmarker voor eukaryote extracellulaire blaasjes; LTA: BEV's-marker van grampositieve bacteriën; LPS, OmpA: BEV's markeren van gramnegatieve bacteriën. Afkortingen: DGC = dichtheidsgradiënt centrifugatie; UC = ultracentrifugeren; CBBS = Coomassie Brilliant Blue kleuring; WB = western blotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Concentratie van de Iodixanol-oplossing (%) | 0,02 M HEPES-buffer | 50% Iodixanol werkoplossing |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabel 1: Verhoudingen voor het voorbereiden van iodixanol dichtheidsgradiëntbuffers. De tabel gaf de verhouding van 0,02 M HEPES-buffer en 50% jodixanol-werkoplossing om een bepaalde concentratie jodixanoloplossing te verkrijgen.
| F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Dichtheid (g/ml) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabel 2: De dichtheid van het op jodixanol gebaseerde dichtheidsgradiëntcentrifugatiesysteem. De tabel toonde de dichtheid van elke fractie in een op jodixanol gebaseerd dichtheidsgradiëntcentrifugatiesysteem. Blanco besturing: PBS-gebaseerd gradiëntsysteem.
| Top-down modus | Bottom-up modus | |
| Terugwinningspercentage deeltjes (%) | 24.08 | 35.69 |
| Eiwitterugwinningspercentage (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabel 3: De terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten van twee modi. De tabel toonde de terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten van de Top-down en Bottom-up modi (Figuur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) zijn lipide-dubbellaagse nanodeeltjes die door bacteriën worden uitgescheiden en een schat aan eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere bioactieve moleculen bevatten, die bijdragen aan het mediëren van de functionele effecten van bacteriën20. Van BEV's afkomstig van de darm is geverifieerd dat ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, zoals inflammatoire darmaandoeningen, de ziekte van Crohn en colorectale kanker, en ook het algemene metabolisme beïnvloeden en een verminderde cognitieve functie mediëren 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . Momenteel wordt het verkrijgen van volledige en objectieve biologische informatie over BEV's van darmbacteriën afkomstig van menselijke monsters-uitwerpselen nog steeds beperkt door een reeks factoren, waaronder de eerste en belangrijkste vraag is hoe BEV's kunnen worden geïsoleerd uit de complexe gastheeromgeving.
De belangrijkste methoden voor het isoleren van BEV's, zoals ultracentrifugatie (UC), dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)13,14,15,16,17, hebben zowel voor- als nadelen. De moeilijkheid om bepaalde storende stoffen te verwijderen en het ontbreken van consistente werkprocedures, die een meer realistische en alomvattende analyse van BEV's ernstig in de weg staan, blijven uitdagingen voor het scheidingsproces. Om de ongewenste effecten van interferenties te verminderen, hebben veel onderzoeken 15,27,28 twee of meer van de bovenstaande methoden gecombineerd om de scheiding van BEV's te bereiken, met name van lichaamsvloeistoffen, maar complexe procedures hebben de neiging om de stabiliteit van de resultaten te beïnvloeden. Voor BEV's kan het verschil in dichtheid met andere verontreinigingen (bijv. eiwitaggregaten, lipidecomponenten, eukaryote extracellulaire blaasjes (EEV's)15) tegenwoordig een specifiek isolatiemiddel worden.
Momenteel is jodixanol naar voren gekomen als het voorkeursmedium voor dichtheidsgradiëntscheiding van EV's, ter vervanging van sucrose vanwege zijn isotone eigenschappen. Deze eigenschappen dragen bij aan het behoud van de EV-morfologie en vergemakkelijken de schatting van de dichtheid voor elke fractie29. In overeenstemming met Tulkens et al 15 nam onze studie een identieke concentratie aan voor het DGC-systeem, waarbij gebruik werd gemaakt van jodixanol bij 50% (w/v), 40% (w/v), 20% (w/v),10% (w/v) en 0% concentratiegradiëntlagen. De eerste stap betrof het gebruik van HEPES-buffer om verschillende concentraties jodixanoloplossingen te bereiden. In vergelijking met Tris (-EDTA)-sucrosebuffer zorgt een geschikte concentratie HEPES-buffer voor langdurige pH-stabiliteit binnen het centrifugatiesysteem, dankzij de intrinsieke eigenschappen ervan. Tegelijkertijd werd steriele PBS-buffer gebruikt op de bovenste laag van het centrifugatiesysteem, niet alleen om te beschermen tegen mogelijke besmetting door bacteriën en hun metabolieten tijdens de bereiding van de oplossing, maar ook om de consistentie van de monsterbuffer voor en na DGC te behouden. Dit omvatte het resuspenderen van de pellet met PBS-buffer na CU en het vervangen van iodixanol door PBS na DGC, waardoor een vergelijkende analyse van de resultaten mogelijk werd. Bovendien werd het volume van elke gradiëntlaag binnen het DGC-systeem gekalibreerd op respectievelijk 3 ml, 3 ml, 3 ml, 3 ml en 3,5 ml voor respectievelijk 50%, 40%, 20%, 10% en 0% (PBS-laag) jodixanoloplossingen. Deze strategie helpt bij het vaststellen van een relatief breder dichtheidsbereik (1,02-1,30 g/ml), waardoor de scheiding van BEV's van andere storende elementen mogelijk wordt verbeterd, waardoor de gradiënten toepasbaar worden op andere lichaamsvloeistoffen met complexe verontreiniging.
Het is belangrijk om te benadrukken dat sommige fasen van het protocol cruciaal zijn. Met name de verdunningsfactor beschreven in stap 2.2, waarbij 1 g fecale monsters wordt gemengd met minimaal 10 ml PBS, is van cruciaal belang voor het voorkomen van oververzadiging en het behoud van experimentele middelen. Onder deze omstandigheden neemt de deeltjes- en eiwitconcentratie over het algemeen evenredig toe met de fecale massa in een monster, ervan uitgaande dat andere fecale kenmerken constant zijn. Indien nodig kan verdere analyse worden uitgevoerd, rekening houdend met factoren zoals consistentie, lipoproteïne of bloedgehalte. Tijdens stap 3.4 moet voorzichtigheid worden betracht om te voorkomen dat de oplossing rechtstreeks wordt gegoten, omdat dit de pellet kan verstoren, waardoor grotere korrels het membraan van het 0.22 μm-filter kunnen verstoppen. Als het filter snel verzadigd raakt (bijvoorbeeld als er minder dan 10 ml door een filter gaat), wordt een extra centrifugatiestap bij 12.000 × g geadviseerd. In het kader van dichtheidsgradiëntcentrifugatie is een nauwkeurige bereiding van gradiëntoplossingen een voorwaarde voor betrouwbare resultaten. Bovendien is zorgvuldige manipulatie van de buis bij het aanbrengen van de bovenste oplossingen met lage dichtheid essentieel om verstoring van de gelaagdheid te voorkomen, en eventuele luchtbellen moeten worden geëlimineerd door aandachtig pipetteren. Ten slotte is het bij het opzuigen van de fracties belangrijk om ze nauwgezet langs de buiswand af te trekken, waarbij over- of onderaanzuiging wordt vermeden die zou kunnen leiden tot een onnauwkeurige BEV-verdeling. Regelmatige observatie van het vloeistofniveau en consequente praktijk kunnen dit probleem helpen verminderen.
Deze studie bepaalde de met BEV's verrijkte fracties (F6-F8) met behulp van meerdere karakteriseringsmethoden en onderzocht twee verschillende gradiënt ultracentrifugatiemodi: Top-down en Bottom-up. Door de meting van de eiwit- en deeltjesconcentratie in F4-F8 (figuur 3) en het vergelijken van herstelpercentages en zuiverheid (figuur 8 en figuur 10), werd waargenomen dat de bottom-up centrifugatiemodus hogere gedetecteerde waarden opleverde op zowel eiwit- als deeltjesniveau dan de alternatieve methode voor het isoleren en zuiveren van BEV's uit fecale monsters. Deze constatering impliceert verschillende dynamische processen. Er werd een hypothese geopperd dat niet-vesiculaire extracellulaire nanodeeltjes (NVEP's)29, zoals lipoproteïnen, met een lagere dichtheid dan BEV's, hun opwaartse dichtheid mogelijk niet bereiken als monsters op de bodem worden geladen (Figuur 6), wat mogelijk een opgeblazen herstelpercentage veroorzaakt, zelfs na 15 uur DGC (Figuur 9). Deze constatering maakt het noodzakelijk om na te gaan of de traditionele zuiverheidsdefinitie, gebaseerd op de verhouding tussen deeltjes en eiwitten, van toepassing is. Verder is het vermeldenswaard dat EEV's overwicht vertoonden in F5, terwijl BEV's prominent werden gedetecteerd in F6-F7 (Figuur 4 en Figuur 5). Met name deze differentiatie leek te worden geaccentueerd bij het gebruik van de Top-down-modus. Daarom is deze modus mogelijk geschikter voor dit protocol. Het is echter essentieel om de aanwezigheid van integrine β1 in F6 te benadrukken, wat mogelijk wijst op de intrinsieke heterogeniteit tussen EEV's. Bij het toepassen van deze methode op andere lichaamsvloeistoffen zoals bloed en urine, moeten onderzoekers rekening houden met de unieke kenmerken van de monsters. De centrifugatietijd die in dit protocol is gedefinieerd, is 7 uur, aanzienlijk korter dan de duur die in andere onderzoeken wordt genoemd, die kan oplopen tot 18 uur. In vergelijking met eiwitterugwinning met een duur van 15 uur uitgevoerd in hetzelfde patroon in deze studie (Figuur 9), lijkt deze tijd voldoende om de vereiste scheidingszuiverheid te bereiken. Onder deze bedrijfsomstandigheden bereikte de deeltjesterugwinning in de Top-down-modus tot 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) per milligram ontlasting, in lijn met eerdere rapporten (1011 BEV's per gram natte ontlasting)15,29,30. Ten slotte bevestigden dichtheidsmetingen van elke fractie van de blancocontrole dat de dichtheid van BEV's varieerde van 1,09-1,19 g/ml, wat consistent is met eerder onderzoek.
Deze methode, hoewel effectief, heeft een beperking vanwege de impact van diëten, darmfunctie en andere factoren op de fecale samenstelling. Deze variabelen kunnen de fecale consistentie veranderen, wat mogelijk van invloed is op de bacteriële overvloed en het herstel van BEV's. Daarom is het van cruciaal belang om de isolatie en zuivering van BEV's31,32 te standaardiseren, met aanpassingen op basis van de beoordeling van fecale kenmerken. Toekomstig onderzoek zou zich moeten richten op het identificeren van een standaard voor het normaliseren van de BEV-opbrengst, vergelijkbaar met urinecreatinine of urinestroomsnelheid. Een dergelijke benchmark zou de methodologische beoordeling kunnen verbeteren en het verband tussen fecale BEV's en de fysiologische en pathologische toestand van het lichaam kunnen verduidelijken. Bovendien onderstreept de sterke associatie tussen fecale BEV's en verschillende ziekten hun aanzienlijke klinische potentieel. De centrifugatietijd die in dit protocol is vastgelegd, voldoet echter niet aan de vraag naar handiger en sneller testen, zoals vereist door clinici. Daarom is verder onderzoek nodig om te bepalen of kortere centrifugatietijden, misschien minder dan 3 uur, gelijkwaardige resultaten kunnen opleveren. Verder onderzoek is ook nodig om de gebeurtenissen in beide centrifugatiemodi te begrijpen. Hoewel wordt verondersteld dat niet-vesiculaire componenten meer verrijkt zijn in F6-F8 in de bottom-upmodus, kunnen het verfijnen van gradiëntconcentraties nuttig zijn bij het identificeren van aanvullende subtypes met specifieke functies.
Deze studie toonde met succes de isolatie en zuivering van BEV's uit menselijke uitwerpselen aan met behulp van DGC. De strategie is veelbelovend voor toepassing op andere biologische monsters, zoals bloed, urine en speeksel, en biedt onderzoekers een effectieve aanpak om de verborgen informatie van BEV's bloot te leggen, waardoor klinische toepassingen mogelijk worden bevorderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); het Key-project van de National Natural Science Foundation of China (82230080); het National Key R&D-programma van China (2021YFA1300604); de National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 en 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2021A1515011639); het Major State Basic Research Development Program van de Natural Science Foundation van de provincie Shandong in China (ZR2020ZD11); de Stichting Postdoctorale Wetenschappen (2022M720059); het Outstanding Youths Development Scheme van het Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
