Summary
Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.
Abstract
Die Multiom-Sequenzierung, die gleichzellige/gepaarte Einzelzell-RNA und den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungsdaten (ATAC-Sequenzierung) liefert, stellt einen Durchbruch in unserer Fähigkeit dar, die Heterogenität von Tumorzellen zu erkennen - ein Hauptschwerpunkt der translationalen Krebsforschung zu dieser Zeit. Die Qualität der Sequenzierungsdaten, die mit dieser fortschrittlichen Modalität erfasst werden, hängt jedoch stark von der Qualität des Eingangsmaterials ab.
Die Verdauungsbedingungen müssen optimiert werden, um die Zellausbeute zu maximieren, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Dies ist eine besondere Herausforderung im Zusammenhang mit soliden Tumoren mit dichten desmoplastischen Matrizen, die für die Zellfreisetzung schonend abgebaut werden müssen. Frisch isolierte Zellen aus solidem Tumorgewebe sind zerbrechlicher als solche, die aus Zelllinien isoliert wurden. Da die isolierten Zelltypen heterogen sind, sollten außerdem Bedingungen ausgewählt werden, um die gesamte Zellpopulation zu unterstützen.
Schließlich müssen die Bedingungen für die nukleare Isolierung auf der Grundlage dieser Eigenschaften in Bezug auf Lysezeiten und Reagenzientypen/-verhältnisse optimiert werden. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Erfahrungen mit der Kernisolierung für die 10x Genomics Multiom-Sequenzierungsplattform aus soliden Tumorproben. Wir geben Empfehlungen für den Gewebeverdau, die Lagerung von Einzelzellsuspensionen (falls gewünscht) sowie die nukleare Isolierung und Bewertung.
Introduction
Mit dem wachsenden Wissen über die Tumorbiologie hat auch die Bedeutung der Analyse heterogener Zellen in der Tumormikroumgebung zugenommen 1,2. Die Möglichkeit, Einzelzell-RNA und den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungsdaten (ATAC-Sequenzierung) aus derselben Zelle in einer gepaarten Zellweise (Multiom-Sequenzierung) zu erfassen, stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Richtung dar 3,4. Diese Experimente sind jedoch teuer und zeitaufwändig, und die Qualität und Wirkung der gewonnenen Daten hängen stark von der Qualität der Versuchsbedingungen und Materialien ab. Standardisierte Protokolle für die Zellkernisolierung wurden veröffentlicht 5,6. Frische und heterogene Gewebe erfordern eine Optimierung des Protokolls, da frisch isolierte Zellen aus soliden Tumorproben zerbrechlicher sind als solche, die aus Zelllinien isoliert wurden.
Eine weitere Überlegung ist, dass bei soliden Tumoren chirurgische Proben oft erst spät am Tag aus dem Operationssaal zur Verfügung stehen. Daher ist es im Allgemeinen nicht möglich, ohne einen Kryokonservierungsschritt direkt von der Probenaufnahme zum Kerneinfang überzugehen. Unserer Erfahrung nach liefert das Einfrieren einer Einzelzellsuspension die hochwertigsten Zellkerne (im Gegensatz zu schockgefrorenem ganzem Gewebe oder anderen Konservierungsmodalitäten). Dies gilt insbesondere für enzymatische Gewebetypen mit hohem RNase-Gehalt wie die Bauchspeicheldrüse.
Auch die Bedingungen für die Gewebeverdauung müssen so gestaltet werden, dass die Zellausbeute maximiert wird, ohne die Qualität zu beeinträchtigen7. Im Zusammenhang mit soliden Tumortypen mit dichten desmoplastischen Matrizen8 muss die extrazelluläre Matrix für die Zellfreisetzung schonend aufgebrochen werden. Da die isolierten Zelltypen heterogen sind, sollten die Bedingungen angepasst werden, um die gesamte Zellpopulation zu unterstützen. In dem beschriebenen Protokoll werden Proben von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs (duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse) verwendet. Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ein stark desmoplastischer Tumortyp, der auf relativ klebriges Gewebe und Zellen hindeutet. Da auch die für die Forschung verfügbaren Proben von Bauchspeicheldrüsentumoren in der Regel relativ klein sind, wird versucht, die Menge der erfassten Zellen zu maximieren.
Die Isolierung von Zellkernen erfordert die größte Optimierung in Bezug auf die Zelllysebedingungen und das Timing sowie die Reagenzientypen und -verhältnisse. Auch der Umgang mit den Zellkernen im Verlauf der Isolation erfordert große Sorgfalt. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Erfahrungen mit der Optimierung der Kernisolierung für die 10x Genomics Multiom-Sequenzierungsplattform aus solidem Tumorgewebe (Abbildung 1). Wir geben Empfehlungen für die Gewebeverdauung, die Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen (falls gewünscht) und die Kernisolierung.
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Protocol
Die Proben des menschlichen Bauchspeicheldrüsenkarzinoms (duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse) wurden nach einem vom IRB zugelassenen Protokoll in unserem Labor entnommen. Für die Gewebeentnahme wurde eine Einverständniserklärung der Patienten eingeholt. Das Gewebe wurde aus dem Operationssaal ins Labor transportiert und anschließend wie folgt aufbereitet.
1. Gewebedissoziation (Verdauung)
- Bereiten Sie den Aufschlusspuffer vor (siehe Materialtabelle).
- Entnehmen Sie das interessierende Gewebe so schnell wie möglich nach der Tumorexzision und transportieren Sie die Probe in Quenchpuffer (DMEM F-12 mit ~5% fötalem Kälberserum) oder 1x PBS auf Eis.
- Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sauberen Pinzette und Schere in 3-5 ml Digest Buffer in einer 90-mm-Petrischale (Abbildung 2A).
- Das zerkleinerte Gewebe wird in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und in ~10 mL Digest Buffer für 30 min bei 37 °C in einem Wasserbad mit Schüttelfunktion oder einem Trockenrührer dissoziiert.
- Aus dem Rührwerk nehmen und mit ~20 ml Abschreckmedium abschrecken. Filtrieren Sie die Lösung durch ein 100-μm-Zellsieb in ein sauberes konisches Röhrchen.
- Sammeln Sie das verbleibende feste Gewebe aus dem Sieb (zerkleinern Sie die verbleibenden Gewebestücke bei Bedarf erneut) und geben Sie es für weitere 30 Minuten bei 37 °C unter Rühren in ~10 ml frischen Digest Buffer. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte Tumorgewebe dissoziiert ist.
- Die Poolzellsuspension aliquotiert und filtriert durch ein 70 μm-Zellsieb, gefolgt von einem 40-μm-Zellsieb in ein sauberes, konisches Röhrchen auf Eis.
- Zu Pelletzellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand dekantieren.
2. Kryokonservierung
- Spülen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1 ml 1x PBS resuspendieren.
- Die Zellsuspension (~1-10 Millionen Zellen/Röhrchen für optimales Einfrieren) in ein 1,5-ml-Kryoröhrchen auf Eis überführen.
- Zu Pelletzellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand dekantieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Bambanker-Lösung, überführen Sie sie in ein 1,5- oder 2-ml-Kryoröhrchen (Abbildung 2B) und frieren Sie sie in einem Gefrierbehälter mit einer Kühlrate von -1 °C/min (mit 100 % Isopropylalkohol) bei -80 °C ein oder überführen Sie sie in flüssigen Stickstoff, wenn eine längerfristige Lagerung der Probe zu erwarten ist.
3. Isolierung von Zellkernen
- Tauen Sie das Kryoröhrchen der Zellsuspension schnell auf und legen Sie es auf nasses Eis.
- Die aufgetaute Zellsuspension in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und das Fläschchen mit 1x PBS auf 2-ml-Lösung auffüllen, um die Zellen zu spülen.
- Führen Sie eine manuelle Zellzählung mit einem Hämozytometer durch, um sowohl die Quantität als auch die Qualität der Zellen zu beurteilen (Abbildung 2C).
- Zu Pelletzellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand vorsichtig mit immer kleineren Pipettenspitzen dekantieren, um ein trockenes Pellet zu hinterlassen und auf Eis zu halten.
- Verwenden Sie einen Schwenkrotor für alle Zentrifugationsschritte. Um eine maximale Zellausbeute zu erzielen, legen Sie die Röhrchen mit dem Scharnier nach außen in die Zentrifuge und dekantieren Sie sie dann mit der Pipettenspitze auf die gegenüberliegende Seite des Röhrchens (Abbildung 2D).
HINWEIS: Verwenden Sie zum Umfüllen des Überstandes immer kleinere Pipettenspitzen, um Flüssigkeit zu entfernen, um die Unterbrechung des Pellets zu begrenzen und gleichzeitig das Volumen der dekantierten Flüssigkeit zu maximieren. Diese Strategie ist besonders hilfreich im späteren Verlauf des Protokolls nach der Kernextraktion, da das Kernpellet im Allgemeinen nicht sichtbar ist.
- Verwenden Sie einen Schwenkrotor für alle Zentrifugationsschritte. Um eine maximale Zellausbeute zu erzielen, legen Sie die Röhrchen mit dem Scharnier nach außen in die Zentrifuge und dekantieren Sie sie dann mit der Pipettenspitze auf die gegenüberliegende Seite des Röhrchens (Abbildung 2D).
- Bereiten Sie 1x Zelllysepuffer, Zelllyseverdünnungspuffer und Waschpuffer (Abbildung 3A) gemäß dem veröffentlichten Protokoll mit den folgenden Modifikationen vor (siehe Tabelle 1, Materialtabelle):
HINWEIS: Legen Sie das Digitonin vor der Verwendung auf einen Heizblock bei 65 °C, um den Niederschlag aufzulösen (Abbildung 3B). Dies dauert in der Regel etwa 10 Minuten. - Bereiten Sie den 0,1-fachen Zelllysepuffer vor, indem Sie 100 μl 1-fachen Zelllysepuffer und 900 μl Zelllyse-Verdünnungspuffer mischen, vorsichtig zum Mischen pipettieren und auf Eis legen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl gekühltem 0,1-fachem Zelllysepuffer und pipettieren Sie vorsichtig zum 5-fachen Mischen.
- 3 Minuten auf Eis inkubieren (Abbildung 3C).
- Fügen Sie 1 ml gekühlten Waschpuffer hinzu und pipettieren Sie ihn auf und ab, um ihn vorsichtig 5x zu mischen.
- Zentrifugieren, um die Kerne bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C zu pelletieren, den Überstand vorsichtig zu einem trockenen Pellet umfüllen und auf Eis belassen.
HINWEIS: Wenn die Anzahl der Ausgangszellen niedrig ist (100.000-200.000 Zellen), führen Sie die Zelllyse- und Waschschritte in einem 200-μl-PCR-Röhrchen anstelle eines 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens durch, um die Röhrchenoberfläche zu verringern und Verluste zu minimieren. Stellen Sie in diesem Fall das Volumen des Waschpuffers nach unten ein, um das kleinere Volumen der Röhre aufzunehmen. - Wiederholen Sie die Schritte 3.9-3.10 2x für insgesamt drei Wäschen.
- Zählen Sie die Zellkerne manuell mit einem Hämozytometer-Objektträger unter dem Mikroskop. Verwenden Sie auf Wunsch Trypanblau, um einen Kontrast für die Betrachtung der Zellkerne zu schaffen und Kerne von nicht lysierten Zellen zu unterscheiden.
- Bereiten Sie den 1x Nuclei Buffer gemäß dem veröffentlichten Protokoll vor: 20x Nuclei Buffer Stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor in nukleasefreiem Wasser und bewahren Sie ihn auf Eis auf (siehe Materialtabelle).
- Resuspendieren Sie das Kernpellet in 1x Nuclei Buffer basierend auf der zielgerichteten Kernrückgewinnung.
HINWEIS: Wenn die Konzentration hoch genug ist, streben Sie bei der Bestimmung des anfänglichen Resuspensionsvolumens eine angestrebte Ausbeute von 10.000 oder etwas mehr bei diesem Schritt an (3.230-8.060 Kerne/μl), angesichts des erwarteten Volumenverlusts von 25 μl und der Abnahme der Konzentration um 20 % bei der Filterung (Schritt 3.15). - Führen Sie das resuspendierte Zellvolumen vorsichtig durch ein 40-μm-Pipettenspitzen-Zellsieb und legen Sie die Kerne auf Eis (Abbildung 3D).
- Zählen Sie die Kerne nach (Abbildung 4A-C). Verdünnen Sie die endgültige Lösung bei Bedarf weiter mit Nuclei Buffer.
- Transportieren Sie die Kerne auf Eis und fahren Sie sofort mit dem Einfangen der Kerne gemäß den veröffentlichten Protokollen fort.
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Representative Results
Um qualitativ hochwertige Zellkerne aus soliden Tumorproben von Patienten für die Multiom-Sequenzierung zu isolieren (Abbildung 1), wurde das Tumorgewebe dissoziiert und eine Einzelzellsuspension kryokonserviert (Abbildung 2A-D). Die Zellsuspension wurde dann zum Zeitpunkt des geplanten Multiom-Einfangs aufgetaut. Der Zellkerneinfang wurde mit optimierten Lysepufferreagenzien und optimiertem Timing durchgeführt, um sowohl die Qualität als auch die Ausbeute zu maximieren (Abbildung 3A-D). Repräsentative Kernbilder zeigen eine angemessene Größe und Form (Abbildung 4A-C). Die blassgrau eingekreisten Kerne zeigen eine leichte Tupfung der Hülle.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs bei der Isolierung von Kernen. Schematische Darstellung des grundlegenden Arbeitsablaufs von einer ganzen Tumorgewebeprobe bis zu einer Einzelkernsuspension, die für die Kernerfassung, die Vorbereitung von Multiombibliotheken und schließlich für die scRNA- und ATAC-Sequenzierung eingereicht werden kann. Abkürzungen: scRNA = Einzelzell-RNA; ATAC-seq = Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gewebeaufschluss, Kryokonservierung, Zellbewertung und Zentrifugationsschritte. (A) Einrichtung von Geräten zum Zerkleinern von Tumorgewebeproben; (B) Kryokonservierung von Zellsuspensionen; c) mikroskopische Beurteilung der Zellsuspension; (D) Ansatz für die Zentrifugation für dieses Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Herstellung von Reagenzien, Kernextraktion und Filterung. (A) Herstellung von Reagenzien für die Kernextraktion; (B) Auflösung von Digitonin bei 65 °C vor der Verwendung; c) Inkubation von Proben für die Zelllyse auf Eis; (D) Filterung der extrahierten Kerne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von Zellkernen, die aus komplexen Tumorgewebeproben gewonnen wurden. (A-C) Repräsentative Bilder von Zellkernen, die mit und ohne Trypanblau-Färbung gewonnen wurden. (B,C) Die blassgrau eingekreisten Kerne zeigen eine leichte Tupfung der Kernhülle. 10x- und 40x-Objektive verwendet. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name der Lösung | Komponenten | ||
| Digest-Puffer | 0,5-1 mg/ml Kollagenase Typ IV | ||
| 100 U/mL DNase I | |||
| 0,1% Poloxamer 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% fötales Kälberserum (FBS) in Medium 199 | |||
| 1X Zelllyse-Puffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2 % BSA (statt 1 %) | |||
| 0.10% Tween-20 | |||
| 0.1% Nonident P40 Ersatz | |||
| 0,01% Digitonin | |||
| 1 mM DVB-T | |||
| 1 U/μL RNAse-Inhibitor in Nuklease-freiem Wasser | |||
| Verdünnungspuffer für die Zelllyse | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 1 mM DVB-T | |||
| 1 U/μL RNAse-Inhibitor in Nuklease-freiem Wasser | |||
| Wasch-Puffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0.10% Tween-20 | |||
| 1 mM DVB-T | |||
| 1 U/μL RNAse-Inhibitor in Nuklease-freiem Wasser | |||
Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Lösungen.
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Discussion
Die Entwirrung der heterogenen Zellpopulationen, die in der Mikroumgebung des Tumors vorhanden sind, ist ein aktives Schwerpunktgebiet der Krebsbiologie. In ähnlicher Weise existieren komplexe Gewebe bei gutartigen Pathologien wie Wundheilung und Fibrose. Die Multiom-Sequenzierung hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das die Erfassung von gleichzelligen gepaarten scRNA- und ATAC-seq-Daten ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Zellkernen, die bei der Verarbeitung frischer, zerbrechlicher, kleiner Tumorproben optimiert werden muss. Hier stellen wir ein Protokoll zur Zellkernisolierung aus desmoplastischen soliden Tumorgewebeproben zur Verfügung. Wir haben festgestellt, dass dieser Ansatz zuverlässige und qualitativ hochwertige Daten liefert, selbst wenn Zellsuspensionen vor der Isolierung und dem Einfangen von Zellkernen eingefroren werden.
Die Erhöhung der Albuminkonzentration während des gesamten Assays ist hilfreich, um die Verklumpung von Zellen und nachgeschalteten Kernen zu begrenzen, was bei der Arbeit mit Tumorproben ein Problem darstellen kann. In Bezug auf den Gewebeaufschluss können auf Wunsch auch Reagenzien des Aufschlusskits mit diesem Protokoll verwendet werden (siehe Materialtabelle). Wenn es verwendet wird, empfehlen wir dennoch, alle 30 Minuten einen Digest/Quench- und Pufferaustausch durchzuführen, um die Ausbeute an lebensfähigen Zellen zu maximieren. Nach der Gewebedissoziation kann die Lyse der roten Blutkörperchen gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt werden. Ein Gradientenzellseparationsprotokoll kann auch nach Ermessen des Forschers durchgeführt werden (siehe Materialtabelle). Wir führen diese Protokolle nicht routinemäßig durch, aber wir haben solche Protokolle auf ähnliche Proben angewendet, ohne nennenswerte Unterschiede in den Ergebnissen. Wenn nach der Kernfilterung signifikante, kleine Ablagerungen festgestellt werden, kann eine fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) für eine weitere Reinigung in Betracht gezogen werden. Eine detaillierte Erörterung von FANS, einschließlich Protokollempfehlungen, ist verfügbar, würde aber den Rahmen dieses Protokolls sprengen. Bemerkenswert ist, dass es in der Literatur Protokolle gibt, die einen Fixierungsschritt vor der Zelllyse berücksichtigen. Wir ziehen es jedoch vor, mit nicht fixiertem Gewebe und Zellkernen fortzufahren, da scATAC-seq am besten bei nicht fixiertem Gewebe funktioniert9.
Da der RNase-Inhibitor für die Zelllyse recht kostspielig ist, ist es sinnvoll, das vorbereitete Volumen des Zelllysepuffers (und des Zelllyse-Verdünnungspuffers) im Vergleich zu den im veröffentlichten Protokoll angegebenen Volumina zu verkleinern, sofern die Verhältnisse der Reagenzien proportional bleiben. Bei der Beurteilung und Zählung der geernteten Kerne kann nach Ermessen des Forschers ein LEBENDES/TOTES Viabilitäts-/Zytotoxizitäts-Kit angewendet werden. Der Farbstoff Trypanblau kann auch verwendet werden, um einen Kontrast für die Betrachtung der Zellkerne zu schaffen und bei Bedarf Kerne von nicht lysierten Zellen zu unterscheiden. Abschließend ist anzumerken, dass wir die gleichen Zelllysebedingungen mit angepassten Reagenzien pro Protokoll für Einzelzell-ATAC-seq mit hervorragenden Ergebnissen angewendet haben10.
Kritische Schritte im Protokoll sind das präzise Timing der Lyse und die schonende, aber zweckmäßige Handhabung der Zellkerne. Eine Untermischung führt zu einer unvollständigen oder inkonsistenten Zelllyse; Durch Übermischung wird das Chromatin jedoch geschert. Wie in anderen Protokollen zur Isolierung von Kernen erwähnt, sollte die Vermischung der Kerne durch Pipettieren und nicht durch Wirbeln der Probe erfolgen, da die Scherkräfte die zerbrechlichen Kerne beschädigen können11. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass der Zelllysepuffer jeweils kurz vor der Anwendung frisch zubereitet wird. Das Abseihen (Filtrieren) der Pipettenspitze nach dem letzten Zentrifugationsschritt ist unserer Erfahrung nach der Schlüssel, um das Verklumpen der Kerne vor dem Einfangen zu verhindern. Diese Filterung kann vor dem Laden wiederholt werden, wenn bei der Endzählung noch Klumpen festgestellt werden oder sich während des Transports der Probe vor dem Laden entwickeln, wobei der zusätzliche Volumen- und Konzentrationsverlust mit jedem hinzugefügten Filterschritt zu berücksichtigen ist. Bemerkenswert ist, dass es keine signifikante Zeitpause zwischen der Isolierung und dem Einfangen der Kerne geben sollte.
Die Einschränkungen dieses Protokolls bestehen darin, dass die Gewebedissoziation und insbesondere der Zeitpunkt und die Bedingungen der Zelllyseinkubation für verschiedene solide Tumortypen optimiert werden müssen12. Dieses Protokoll wurde für desmoplastische solide Tumoren wie das Brustkarzinom und das Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse optimiert und auch erfolgreich auf desmoplastisches Gewebe angewendet, das keine Tumoren sind, wie z. B. Parenchymfibrose, aber andere Tumorarten erfordern möglicherweise zusätzliche Anpassungen. Es ist sowohl für Frischzellsuspensionen als auch für gefrorene Zellsuspensionen mit hervorragender Kernausbeute aus beiden optimiert. Wir empfehlen, eine solche Optimierung sequentiell zu verfolgen, beginnend mit der Gewebedissoziation, und sobald eine optimale Einzelzellsuspension erreicht wurde, zur Optimierung der Zelllysebedingungen überzugehen, um eine optimale Einzelkernsuspension zu erhalten.
Die Einzelzell-ATAC-Sequenzierung und in jüngster Zeit auch die Multiom-Sequenzierung stellen ein enormes bahnbrechendes Werkzeug zur Entwirrung der zellulären Heterogenität solider Tumore dar. Zellsubtypen können sowohl anhand ihrer Chromatinzugänglichkeit als auch ihrer Genexpressionseigenschaften abgegrenzt werden, und der Einfluss der Zugänglichkeit und Expression von Transkriptionsfaktoren auf das Tumorverhalten kann direkt untersucht werden. Diese methodischen Fortschritte werden aufgrund ihres enormen Potenzials zur Aufdeckung neuartiger therapeutischer Ziele breit gefächert. Daher ist die Entwicklung optimierter Protokolle zur Gewinnung dieser Daten von größter Bedeutung. Hier stellen wir dieses Protokoll für die Zellkernisolierung im Zusammenhang mit Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe vor - einer Krebsart, für die es nur wenige Therapien gibt und die bisher nur begrenzt wirksam sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir möchten uns bei der Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), insbesondere bei Dhananjay Wagh und John Coller, und bei 10x Genomics für ihre Unterstützung bei der Optimierung unserer Experimente bedanken. Wir möchten uns auch bei Dr. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser und Byrne Lee für ihre Unterstützung bei der Beschaffung von Patientenproben bedanken. Wir möchten uns bei Art und Elaine Taylor, der Rantz Foundation sowie Warren und Judy Kaplan für ihre großzügige Unterstützung unserer Forschungsbemühungen bedanken. Zu den Finanzierungsquellen gehören die NIH-Zuschüsse 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), die Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), der Gunn/Olivier Fund, das California Institute for Regenerative Medicine, die Stinehart/Reed Foundation und das Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Die Sequenzierung wurde mit Maschinen durchgeführt, die mit NIH-Mitteln gekauft wurden (S10OD025212, S10OD018220 und 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
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