Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Las enfermedades hereditarias de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad conducen a la pérdida de células fotorreceptoras y a la ceguera final. El fotorreceptor de la retina es la capa del segmento externo de la retina compuesta por células especializadas responsables de la fototransducción (es decir, la conversión de la luz en señales neuronales). Los bastones y los conos fotorreceptores se encuentran adyacentes a la capa pigmentada de la retina (EPR)¹. La terapia de reemplazo de células fotorreceptoras para compensar la pérdida celular ha sido un enfoque terapéutico emergente y en desarrollo. Se utilizaron células madre embrionarias (ESC)^2,3,4, células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células madre y células progenitoras de la retina (RPC)4,5,6,7,8 para restaurar las células fotorreceptoras dañadas. El espacio sub-retiniano, un espacio confinado entre la retina y el EPR, es un lugar atractivo para depositar estas células para reemplazar las células fotorreceptoras dañadas, el EPR y las células de Mueller debido a su proximidad ^9,10,11.

Las terapias génicas y celulares han estado utilizando el espacio sub-retiniano para la medicina regenerativa para diversas enfermedades de la retina en estudios preclínicos. Esto incluye la administración de copias funcionales del gen o de las herramientas de edición génica en forma de terapia con oligonucleótidos antisentido^12,13 o CRISPR/Cas9 o la edición de bases a través de una estrategia basada en virus adenoasociados (AAV) 14,15,16, la implantación de materiales (p. ej., lámina de EPR, prótesis retinianas 17,18,19) y organoides retinianos diferenciados derivados de células madre ^20,21,22 para tratar enfermedades relacionadas con la retina y el EPR. Ensayos clínicos que utilizan hESC-RPE³¹ en el espacio subretiniano para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) asociada a RPE6523,24, la acromatopsia ligada a CNGA3²⁵, la retinosis pigmentaria asociada a MERTK²⁶, la coroideremia 27,28,29,30 han demostrado ser un enfoque eficaz. La inyección directa de células en las proximidades del área dañada mejora en gran medida la posibilidad de asentamiento celular en la región apropiada, la integración sináptica y la eventual mejoría visual.

A pesar de que se ha establecido la inyección sub-retiniana en modelos humanos y de ojos grandes (es decir, cerdo 32,33,34,35, conejo 36,37,38,39,40 y primates no humanos 41,42,43), dicha inyección en el modelo murino sigue siendo un desafío debido a la limitación del tamaño del globo ocular y al enorme tamaño del globo ocular. lente que ocupa el ojo del ratón 44,45,46. Sin embargo, los modelos modificados genéticamente solo están disponibles en animales pequeños y no en animales grandes (es decir, conejos y primates no humanos), por lo que la inyección subrretiniana en ratones llama la atención para investigar nuevos enfoques terapéuticos en trastornos genéticos de la retina. Se están utilizando tres enfoques principales para administrar células o AAV en el espacio subretiniano, a saber, la ruta transcorneal, la ruta transescleral y la ruta pars plana (ver Figura 2). Las vías transcorneales y transesclerales se asocian con la formación de cataratas, sinequias, hemorragia coroidea y reflujo desde el lugar de la inyección 11,44,45,47,48,49. Adoptamos el enfoque de pars plana como una visualización directa del proceso de inyección, y el sitio de inyección se puede lograr en tiempo real bajo el microscopio.

Recientemente describimos un método que puede diferenciar células madre embrionarias humanas (hESCs) en progenitores de fotorreceptores bajo condiciones químicamente definidas y libres de xenos utilizando la isoforma de laminina recombinante específica de retina humana LN523. Dado que se encontró que LN523 estaba presente en la retina, planteamos la hipótesis de que el nicho de la matriz extracelular de la retina humana podría recapitularse in vitro y, por lo tanto, apoyar la diferenciación de los fotorreceptores de las hESC³⁶. El análisis transcriptómico de una sola célula mostró que los progenitores fotorreceptores que coexpresan la homeobox de conos y la recoverina se generaron después de 32 días. Se utilizó un modelo de ratón mutante de degeneración retiniana 10 (rd10) que imita la retinosis pigmentaria humana autosómica para evaluar la eficacia de los progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 in vivo. Las células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC se inyectaron en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 en P20, donde la disfunción y degeneración de los fotoceptores están en curso³⁶. Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC post-criopreservados y la administración en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 . Este método también se puede utilizar para administrar AAV, suspensiones celulares, péptidos o productos químicos en el espacio subretiniano en ratones.

Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas y el protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth (IACUC) y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Las crías fueron inmunosuprimidas desde P17 (pre-trasplante) hasta P30 (post-trasplante) alimentándolas con agua potable que contenía ciclosporina (260 g/L).

1. Preparación de progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 después de la criopreservación

1. Medio de diferenciación fotorreceptor precalentado (PRDM) en un baño de agua a 37 °C.
2. Recuperar un criovial que contiene células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC de día 32 a partir de nitrógeno líquido. Manténgalo en hielo seco.
3. Descongelar la criovial a 37 °C al baño maría durante 3-5 min. Resuspender las 32 células del día en 1 mL de PRDM y centrifugar a 130 x g durante 4 min.
4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de PRDM.
5. Retire 10 μL de la mezcla para el recuento de células. Mezcle las células con azul de tripano al 0,2% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetee la mezcla de células en el portaobjetos de la cámara de recuento de células. Determine el número de celdas y la viabilidad mediante un contador de celdas automatizado.
6. Continúe con el siguiente paso cuando la viabilidad de la célula sea superior al 70%. Centrifugar la suspensión celular restante a 130 x g durante 4 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en PRDM a la concentración de 3 x 10⁵ células/μL para trasplante.
7. Observe si hay grupos celulares visibles. Vuelva a suspender los grupos celulares repetidamente utilizando una punta de pipeta de 10 μL en el tubo de microfuga hasta que no se observe ningún grupo celular visible. Cargue en la jeringa de inyección 33G para observar la extrusión de la solución celular a través de la aguja.

2. Liberación sub-retiniana de las hESCs en ratones rd10

1. Preparación de los animales
   1. Anestesiar al ratón (P20, macho/hembra, 3-6 g) utilizando una combinación de ketamina (20 mg/kg de peso corporal) y xilacina (2 mg/kg de peso corporal) en una jeringa de tuberculina de 1 ml unida a una aguja de 27G por vía intraperitoneal. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) al ratón como analgésico preventivo.
   2. Después de administrar la anestesia, instilar una gota de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% para la dilatación de la pupila. Aplique un gel oftálmico en la córnea para evitar que el ojo se seque y las cataratas relacionadas con la anestesia.
   3. Coloque al ratón en una jaula vacía hasta que esté completamente anestesiado. Evalúe el nivel adecuado de anestesia pellizcando la almohadilla de la pata y confirme si el animal no reacciona al pellizco fuerte.
   4. Cuando el ratón esté completamente anestesiado, coloque al animal sobre una almohadilla tibia colocada a 38 °C.
2. Liberación sub-retiniana de las células
   1. Para utilizar un abordaje de pars plana transvítrea de 1 puerto, como se hace aquí, realice la inyección subretiniana en un entorno estéril. Utilice un microscopio de operación vertical con una trayectoria de luz directa para realizar la inyección.
   2. Prepare la jeringa de vidrio de 10 μL retirando el cubo de la aguja. Monte la aguja roma 33G en la jeringa de vidrio. Tome la cubierta metálica del cubo y asegure con cuidado la aguja en la jeringa.
   3. Enjuague con agua destilada para verificar si hay signos de fugas y permeabilidad de la aguja. Vacíe la jeringa y colóquela a un lado con cuidado.
   4. Coloque el ratón anestesiado sobre una almohada, con el ojo de tratamiento mirando hacia arriba directamente hacia el objetivo del microscopio. Aplicar el clorhidrato de proparacaína al 0,5% y esperar 30 s. Aplicar 150 μL de gel oftálmico sobre el ojo y colocar sobre él un cubreobjetos redondo.
   5. Realice un examen aproximado del ojo observando la córnea, el iris, la pupila, el cristalino y la conjuntiva. A través de la pupila, visualiza el fondo del ojo del ratón ajustando el plano focal. Ajuste la cabeza hasta que la cabeza óptica se coloque en el centro de la pupila y minimice el movimiento de la cabeza colocándola correctamente sobre la almohada.
   6. Golpee suavemente la base del tubo con las hESC varias veces para obtener una suspensión celular uniforme. Utilizando la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL con una aguja roma de 33G, extraiga 2 μL de células/medios. Extraiga las células justo antes de la inyección para evitar que las células se asienten o se aglutinen en la jeringa.
   7. Con una aguja desechable de 30 G, haga una herida de esclerectomía a 2 mm detrás del limbo. Mantenga el ángulo de la aguja a ~45° para evitar tocar la lente. Una vez que se visualice la punta de la aguja en el ojo, retire suavemente la aguja. Deseche la aguja en el recipiente afilado después de usarla para evitar lesiones por pinchazos con la aguja.
   8. Tome la jeringa de vidrio e inserte la aguja roma en la herida de la esclerectomía. Sin tocar el cristalino, avance la aguja roma hasta que llegue a la retina opuesta de la herida de entrada. Asegúrese de que el área de la inyección esté libre de los principales vasos sanguíneos de la retina para evitar sangrado.
   9. Penetre suavemente en la retina hasta que se vea una rama de presión en la esclerótica. Mantenga el extremo romo de la aguja paralelo a la esclerótica para evitar la fuga de las células hacia el espacio vítreo.
   10. Inyecte lentamente 2 μL de suspensión celular o medio PRDM (control) en el espacio subretiniano mientras se mantiene una presión suave sobre la jeringa. Con una inyección exitosa, se debe formar una ampolla visible (es decir, una retina elevada con la suspensión/medio celular en ella) en el lugar de la inyección.
       NOTA: Solo se debe usar una presión suave durante la inyección para evitar el desgarro de la retina y el bloqueo de las células en la punta de la aguja.
   11. Después de confirmar la ampolla, espere 10 segundos para que las células se asienten. Retraiga suavemente la aguja del ojo.
3. Tomografía de coherencia óptica (OCT) intraoperatoria de la ampolla (opcional)
   1. Coloque el ojo del ratón para visualizar la ampolla bajo el microscopio moviendo lentamente la cabeza. Asegure la posición sujetando suavemente la cabeza. No es necesaria una dilatación adicional de la pupila. No retire el cubreobjetos y el gel del ojo. Proporciona un medio óptico claro para visualizar la ampolla.
   2. Realice la OCT intraoperatoria utilizando la función iOCT incorporada del microscopio quirúrgico.
   3. Presione la opción Cubo en la pantalla OCT y coloque el área de escaneo en la ampolla presionando los botones de flecha . Ajuste la OCT deslizando el centrado y el enfoque para obtener la mejor calidad de OCT. Presione Capturar/Escanear para adquirir el escaneo OCT del área de la ampolla. Revise las imágenes para comprobar la calidad de los escaneos.
4. Recuperación
   1. Retire el cubreobjetos y limpie el gel del ojo con una gasa. Aplique ungüento antibiótico una vez después de la inyección para prevenir infecciones.
   2. Permita que el animal se recupere de la anestesia bajo una luz cálida hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y regresar a la jaula de origen. Vigile al animal durante al menos 3 días después de la inyección para detectar signos de inflamación, infección y angustia.
      NOTA: La luz cálida de 150 W debe estar al menos a 30 cm de distancia de la jaula del animal, y se debe tener precaución para evitar una lesión por quemadura.
   3. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 horas durante 1 día o según recomendación del veterinario. Si se observa inflamación o infección del ojo, consulte a un profesional veterinario para el tratamiento adecuado.
5. Limpieza y esterilización del instrumental
   1. Enjuague la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL y la aguja roma de 33G con etanol al 100% 10x. Lave el etanol flasheando la jeringa con agua destilada.
   2. Desmonte la jeringa de vidrio y la aguja. Seque la jeringa para guardarla.

La jeringa de vidrio de 10 μL se ensambló de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1), y la aguja roma utilizada para administrar la suspensión/medio celular se muestra en la Figura 1B. En la Figura 2 se ilustran diferentes enfoques para la inyección subretiniana. Describimos el enfoque de pars plana en este protocolo (Figura 2C). La aguja roma montada en una jeringa de vidrio se insertó a través de una herida de esclerotomía y accedió al espacio subretiniano en todo el mundo. Como se muestra en la Figura 3A, la trayectoria de la aguja, la penetración a través de la retina y la liberación de las células se monitorearon directamente bajo el microscopio al realizar la inyección. La administración exitosa de las células/medios se confirmó mediante la observación de una ampolla en el lugar de la inyección (Figura 3B). Una ampolla exitosa se puede identificar como un color blanquecino claro que se asemeja a un globo de agua. Un parto fallido se observa por la fuga de las células/medios en el espacio vítreo en el lugar de la inyección y la falta de formación de una ampolla. La OCT se realizó en el área inyectada, y la exploración mostró hESC individualizadas flotantes en el ojo tratado con células (Figura 4A), mientras que el ojo tratado con medios mostró líquido transparente sin células en el espacio subretiniano (Figura 4B). Las hESCs individualizadas se identifican como materiales hiperreflectantes distribuidos en el espacio sub-retiniano (Figura 4A). La tasa de éxito de la inyección se calculó observando el número de ojos con formación exitosa de la ampolla. Incluimos las aplicaciones que adoptaron este enfoque en nuestro laboratorio y la tasa de éxito de las inyecciones (Tabla 1).

Figura 1: Instrumentos utilizados durante la inyección. (A) La jeringa de vidrio de 10 μL está montada con una aguja roma de 33G. (B) Imagen ampliada de la aguja roma 33G. (C) Almohada para que descanse la cabeza del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diferentes vías de inyección subretiniana. (A) Vía transcorneal: La aguja de inyección pasa a través de la córnea y la pupila para entrar en el espacio subretiniano. (B) Vía transescleral: Se accede directamente al espacio subretiniano a través de la esclerótica. (C) Vía pars plana: La aguja de inyección se inserta en el espacio vítreo a través de una incisión en el limbo. La aguja llega al espacio subretiniano penetrando en la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes del fondo de ojo durante la inyección subretiniana. (A) Antes de que se realizara la inyección subretiniana, se podía ver la punta de la aguja en el espacio vítreo que toca la retina, evitando los principales vasos sanguíneos de la retina. (B) Después de la inyección subretiniana, se formó una ampolla visible en el lugar de la inyección (línea punteada amarilla). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: OCT intraoperatoria de los ojos inyectados. Las exploraciones se realizaron inmediatamente después de la inyección. (A) ojo tratado con hESCs: el panel superior mostraba la ubicación de la OCT (líneas transversales cian y rosa) en el ojo; Se observaron hESC en el ojo tratado en el espacio subretiniano (línea punteada amarilla, paneles medio e inferior). (B) Ojo tratado con medios: el panel superior mostraba la ubicación de la OCT (líneas transversales cian y rosa) en el ojo; Se observó líquido transparente sin células en el espacio sub-retiniano en el ojo inyectado por el medio (línea punteada amarilla, paneles medio e inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tasa de éxito de la inyección subretiniana en diferentes aplicaciones.

Hwee Goon Tay es cofundador de Alder Therapeutics AB. Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.