Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .
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Artículo de método
Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10
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Resumen
Resumen
La regeneración de células fotorreceptoras utilizando células madre pluripotentes humanas es una terapia prometedora para el tratamiento de enfermedades de la retina hereditarias y de envejecimiento en etapas avanzadas. Hemos demostrado que la matriz de isoformas de laminina específica de retina recombinante humana es capaz de apoyar la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) a progenitores de fotorreceptores. Además, la inyección sub-retiniana de estas células también ha mostrado una restauración parcial en los modelos de roedores y conejos rd10 . Se sabe que la inyección subretiniana es un método establecido que se ha utilizado para administrar compuestos farmacéuticos a las células fotorreceptoras y a la capa epitelial pigmentada de la retina (EPR) del ojo debido a su proximidad al espacio objetivo. También se ha utilizado para administrar vectores virales adenoasociados en el espacio subretiniano para tratar enfermedades de la retina. La administración sub-retiniana de compuestos farmacéuticos y células en el modelo murino es un desafío debido a la restricción en el tamaño del globo ocular murino. Este protocolo describe el procedimiento detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para inyección y la técnica de administración sub-retiniana de estas células en ratones con mutación de retinosis pigmentaria genética, rd10 . Este enfoque permite la terapia celular en el área objetivo, en particular la capa nuclear externa de la retina, donde se producen las enfermedades que conducen a la degeneración de los fotorreceptores.
Introducción
Las enfermedades hereditarias de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad conducen a la pérdida de células fotorreceptoras y a la ceguera final. El fotorreceptor de la retina es la capa del segmento externo de la retina compuesta por células especializadas responsables de la fototransducción (es decir, la conversión de la luz en señales neuronales). Los bastones y los conos fotorreceptores se encuentran adyacentes a la capa pigmentada de la retina (EPR)1. La terapia de reemplazo de células fotorreceptoras para compensar la pérdida celular ha sido un enfoque terapéutico emergente y en desarrollo. Se utilizaron células madre em....
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Protocolo
Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas y el protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth (IACUC) y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Las crías fueron inmunosuprimidas desde P17 (pre-trasplante) hasta P30 (post-trasplante) alimentándolas con agua potable que contenía ciclosporina (260 g/L).
1. Preparación de progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 después de la criopreservación
- Medio de diferenciaci....
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Resultados
La jeringa de vidrio de 10 μL se ensambló de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1), y la aguja roma utilizada para administrar la suspensión/medio celular se muestra en la Figura 1B. En la Figura 2 se ilustran diferentes enfoques para la inyección subretiniana. Describimos el enfoque de pars plana en este protocolo (Figura 2C). La aguja roma montada en una jeringa de vidrio se insertó .......
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Discusión
La inyección subretiniana se ha utilizado para el trasplante en suspensión celular para tratar el EPR y las enfermedades de la retina 23,25,26,27,28,31,40. Este enfoque es muy esencial en los estudios con roedores, no solo para el trasplante de células y los enfoques de terapia génica, sino .......
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Divulgaciones
Hwee Goon Tay es cofundador de Alder Therapeutics AB. Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee y Yingying Chung por brindar asistencia técnica para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC del día 32 después de la criopreservación. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Premio de Beca de Investigación para Jóvenes Investigadores del Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC/OFYIRG/0042/2017) y la24ª Subvención del Programa de Investigación Competitiva de la Fundación Nacional de Investigación (CRP24-2020-0083) a H.G.T.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.3% Tobramicina | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3,5 g) |
| 0,3% Tobramicina y 0,1% Dexametasona | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3,5 g) |
| 0,5% Clorhidrato de proparacaína | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0,5% Alcaína (15 mL) |
| 1 mL Jeringa de tuberculina | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamida | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Madriacil (15 mL) |
| 2,5% Clorhidrato de fenilefrina | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2,5% Mydfrin (5 mL) |
| Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Costar | 3526 | |
| 30 G Aguja desechable | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm de longitud agujas romas | Hamilton | 7803-05 | |
| Contador de células automatizado | NanoEnTek | Modelo: Eve | |
| B27 sin vitamina A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorfina | Ceva | Vetergesic vet (0,3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µ M36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L en agua potable | |
| Día 32 hCélulas progenitoras fotorreceptoras derivadas de ESC | Facultad de Medicina DUKE-NUS Las | células madre embrionarias humanas se diferencian durante 32 días. Ver protocolo en Ref 36. | |
| Gasa Winner Industries Co., Ltd. | 1SNW475-4 | ||
| Glasgow Medio Esencial Mínimo | Gibco | 11710– 035 | |
| hESC línea celular H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Factor neurotrófico derivado del cerebro humano (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Factor neurotrófico ciliar humano (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Clorhidrato de ketamina (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µ g36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Jeringa de vidrio de microlitros (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µ M36 |
| N-2 suplemento | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA) | Gibco | 11140– 050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Microscopio de operación | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | Con función iOCT incorporada |
| PRDM (Medio de diferenciación de fotorreceptores, 50 ml) | Facultad | Ver composición de medios36. Medio basal, 10 y micro; M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 y micro; M Ácido retinoico, 2% B27 y 1% N2. Medio basal: 1x GMEM, 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de B-mercaptoetanol, 1x Aminoácidos no esenciales (NEAA). | |
| Piruvato | Gibco | 11360– 070 | 1 mM36 |
| Rd10 ratones | Laboratorio Jackson | B6. Ratones CXB1-Pde6brd10/J | Sexo: macho/hembra, Edad: P20 (inyección), Peso: 3-6 g |
| Ácido retinoico | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µ M36 |
| Cubreobjetos redondos (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µ M36 |
| Gel Vidísico (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Clorhidrato de xilacina (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985– 023 | 0,1 mM36 |
Referencias
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
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Reimpresiones y permisos
