Summary
Hier introduceren we een protocol voor het converteren van transcriptomische gegevens naar een mqTrans-weergave, waardoor de identificatie van donkere biomarkers mogelijk wordt. Hoewel deze biomarkers niet differentieel tot expressie worden gebracht in conventionele transcriptomische analyses, vertonen ze differentiële expressie in de mqTrans-weergave. De aanpak dient als een aanvullende techniek op traditionele methoden en onthult eerder over het hoofd geziene biomarkers.
Abstract
Transcriptoom vertegenwoordigt de expressieniveaus van veel genen in een monster en wordt veel gebruikt in biologisch onderzoek en de klinische praktijk. Onderzoekers concentreerden zich meestal op transcriptomische biomarkers met differentiële representaties tussen een fenotypegroep en een controlegroep van monsters. Deze studie presenteerde een multitask graph-attention network (GAT) leerkader om de complexe intergene interacties van de referentiemonsters te leren. Een demonstratief referentiemodel werd vooraf getraind op de gezonde monsters (HealthModel), dat direct kon worden gebruikt om de modelgebaseerde kwantitatieve transcriptionele regulatie (mqTrans)-weergave van de onafhankelijke testtranscriptomen te genereren. De gegenereerde mqTrans-weergave van transcriptomen werd gedemonstreerd door voorspellingstaken en detectie van donkere biomarkers. De bedachte term "donkere biomarker" kwam voort uit de definitie dat een donkere biomarker differentiële representatie vertoonde in de mqTrans-weergave, maar geen differentiële expressie in het oorspronkelijke expressieniveau. Een donkere biomarker werd altijd over het hoofd gezien in traditionele biomarkerdetectiestudies vanwege de afwezigheid van differentiële expressie. De broncode en de handleiding van de pipeline HealthModelPipe zijn te downloaden van http://www.healthinformaticslab.org/supp/resources.php.
Introduction
Transcriptoom bestaat uit de expressies van alle genen in een monster en kan worden geprofileerd door high-throughput technologieën zoals microarray en RNA-seq1. De expressieniveaus van één gen in een dataset worden een transcriptomisch kenmerk genoemd, en de differentiële representatie van een transcriptomisch kenmerk tussen het fenotype en de controlegroep definieert dit gen als een biomarker van dit fenotype 2,3. Transcriptomische biomarkers zijn op grote schaal gebruikt bij het onderzoeken van ziektediagnose4, biologisch mechanisme5 en overlevingsanalyse 6,7, enz.
Genactiviteitspatronen in de gezonde weefsels bevatten cruciale informatie over het leven 8,9. Deze patronen bieden inzichten van onschatbare waarde en fungeren als ideale referenties voor het begrijpen van de complexe ontwikkelingstrajecten van goedaardige aandoeningen10,11 en dodelijke ziekten12. Genen interageren met elkaar en transcriptomen vertegenwoordigen de uiteindelijke expressieniveaus na hun gecompliceerde interacties. Dergelijke patronen worden geformuleerd als transcriptioneel regulatienetwerk13 en metabolismenetwerk14, enz. De expressies van boodschapper-RNA's (mRNA's) kunnen transcriptioneel worden gereguleerd door transcriptiefactoren (TF's) en lange intergene niet-coderende RNA's (lincRNA's)15,16,17. Conventionele differentiële expressieanalyse negeerde dergelijke complexe geninteracties met de aanname van onafhankelijkheid tussen kenmerken 18,19.
Recente ontwikkelingen op het gebied van grafische neurale netwerken (GNN's) tonen een buitengewoon potentieel aan bij het extraheren van belangrijke informatie uit OMIC-gebaseerde gegevens voor kankerstudies20, bijvoorbeeld het identificeren van co-expressiemodules21. De aangeboren capaciteit van GNN's maakt ze ideaal voor het modelleren van de ingewikkelde relaties en afhankelijkheden tussen genen22,23.
Biomedische studies richten zich vaak op het nauwkeurig voorspellen van een fenotype ten opzichte van de controlegroep. Dergelijke taken worden gewoonlijk geformuleerd als binaire classificaties 24,25,26. Hier worden de twee klasselabels meestal gecodeerd als 1 en 0, waar en onwaar, of zelfs positief en negatief27.
Deze studie had tot doel een gebruiksvriendelijk protocol te bieden voor het genereren van de transcriptionele regulatie (mqTrans)-weergave van een transcriptoomdataset op basis van het vooraf getrainde graph-attention network (GAT)-referentiemodel. Het multitask GAT-framework van een eerder gepubliceerd werk26 werd gebruikt om transcriptomische functies te transformeren naar de mqTrans-functies. Een grote dataset van gezonde transcriptomen van het Xena-platform28 van de University of California, Santa Cruz (UCSC) werd gebruikt om het referentiemodel (HealthModel) vooraf te trainen, dat kwantitatief de transcriptievoorschriften van de regulerende factoren (TF's en lincRNA's) tot de doel-mRNA's heeft gemeten. De gegenereerde mqTrans-weergave kan worden gebruikt om voorspellingsmodellen te bouwen en donkere biomarkers te detecteren. Dit protocol maakt gebruik van de patiëntdataset colonadenocarcinoom (COAD) uit de database van The Cancer Genome Atlas (TCGA)29 als illustratief voorbeeld. In deze context worden patiënten in stadium I of II gecategoriseerd als negatieve monsters, terwijl patiënten in stadium III of IV als positieve monsters worden beschouwd. De verdelingen van donkere en traditionele biomarkers over de 26 TCGA-kankertypes worden ook vergeleken.
Beschrijving van de HealthModel-pijplijn
De methodologie die in dit protocol wordt gebruikt, is gebaseerd op het eerder gepubliceerde raamwerk26, zoals geschetst in figuur 1. Om te beginnen moeten gebruikers de invoergegevensset voorbereiden, deze invoeren in de voorgestelde HealthModel-pijplijn en mqTrans-functies verkrijgen. Gedetailleerde instructies voor het opstellen van gegevens zijn te vinden in hoofdstuk 2 van het protocolgedeelte. Vervolgens hebben gebruikers de mogelijkheid om mqTrans-functies te combineren met de originele transcriptomische functies of alleen door te gaan met de gegenereerde mqTrans-functies. De geproduceerde dataset wordt vervolgens onderworpen aan een functieselectieproces, waarbij gebruikers de flexibiliteit hebben om hun voorkeurswaarde voor k te kiezen in k-voudige kruisvalidatie voor classificatie. De primaire evaluatiemaatstaf die in dit protocol wordt gebruikt, is nauwkeurigheid.
HealthModel26 categoriseert de transcriptomische kenmerken in drie verschillende groepen: TF (transcriptiefactor), lincRNA (lang intergeen niet-coderend RNA) en mRNA (boodschapper-RNA). De TF-kenmerken worden gedefinieerd op basis van de annotaties die beschikbaar zijn in de Human Protein Atlas30,31. Dit werk maakt gebruik van de annotaties van lincRNA's uit de GTEx-dataset32. Genen die behoren tot de routes op het derde niveau in de KEGG-database33 worden beschouwd als mRNA-kenmerken. Het is vermeldenswaard dat als een mRNA-kenmerk regulerende rollen vertoont voor een doelgen, zoals gedocumenteerd in de TRRUST-database34, het opnieuw wordt geclassificeerd in de TF-klasse.
Dit protocol genereert ook handmatig de twee voorbeeldbestanden voor de gen-ID's van regulerende factoren (regulatory_geneIDs.csv) en doel-mRNA (target_geneIDs.csv). De paarsgewijze afstandsmatrix tussen de regulerende kenmerken (TF's en lincRNA's) wordt berekend door de Pearson-correlatiecoëfficiënten en geclusterd door de populaire tool weighted gene co-expression network analysis (WGCNA)36 (adjacent_matrix.csv). Gebruikers kunnen de HealthModel-pijplijn rechtstreeks gebruiken in combinatie met deze voorbeeldconfiguratiebestanden om de mqTrans-weergave van een transcriptomische gegevensset te genereren.
Technische details van HealthModel
HealthModel geeft de ingewikkelde relaties tussen TF's en lincRNA's weer als een grafiek, waarbij de invoerfuncties dienen als de hoekpunten die worden aangeduid met V en een intervertex-randmatrix die wordt aangeduid als E. Elk monster wordt gekenmerkt door K-regulerende kenmerken, gesymboliseerd als VK×1. In het bijzonder omvatte de dataset 425 TF's en 375 lincRNA's, wat resulteerde in een monsterdimensionaliteit van K = 425 + 375 = 800. Om de randmatrix E vast te stellen, werd voor dit werk gebruik gemaakt van de populaire tool WGCNA35. Het paarsgewijze gewicht dat twee hoekpunten met elkaar verbindt, weergegeven als 
en 
, wordt bepaald door de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Het genregulerende netwerk vertoont een schaalvrije topologie36, gekenmerkt door de aanwezigheid van hub-genen met een cruciale functionele rol. We berekenen de correlatie tussen twee objecten of hoekpunten, en , met behulp van de topologische overlapmaat (TOM) als volgt:
(1)
(2)
De zachte drempel β wordt berekend met behulp van de functie 'pickSoft Threshold' uit het WGCNA-pakket. De machtexponentiële functie aij wordt toegepast, waarbij 
een gen exclusief i en j wordt weergegeven, en 
de hoekpuntconnectiviteit wordt weergegeven. WGCNA clustert de expressieprofielen van de transcriptomische kenmerken in meerdere modules met behulp van een veelgebruikte ongelijkheidsmaat (
37.
Het HealthModel-raamwerk is oorspronkelijk ontworpen als een multitask-leerarchitectuur26. Dit protocol maakt alleen gebruik van de pre-trainingstaak van het model voor de constructie van de transcriptomische mqTrans-weergave. De gebruiker kan ervoor kiezen om het vooraf getrainde HealthModel verder te verfijnen onder het multitask graph attention network met aanvullende taakspecifieke transcriptomische voorbeelden.
Technische details van de selectie en classificatie van functies
De functieselectiepool implementeert elf algoritmen voor functieselectie (FS). Onder hen zijn er drie op filters gebaseerde FS-algoritmen: het selecteren van de beste kenmerken van K met behulp van de maximale informatiecoëfficiënt (SK_mic), het selecteren van K-kenmerken op basis van de FPR van MIC (SK_fpr) en het selecteren van K-kenmerken met het hoogste percentage valse detectie van MIC (SK_fdr). Daarnaast beoordelen drie op bomen gebaseerde FS-algoritmen individuele kenmerken met behulp van een beslissingsboom met de Gini-index (DT_gini), adaptieve versterkte beslissingsbomen (AdaBoost) en willekeurig bos (RF_fs). De pool bevat ook twee wrapper-methoden: recursieve functie-eliminatie met de lineaire ondersteuningsvectorclassificatie (RFE_SVC) en recursieve functie-eliminatie met de logistische regressieclassificatie (RFE_LR). Ten slotte zijn er twee inbeddingsalgoritmen opgenomen: lineaire SVC-classificatie met de hoogst gerangschikte L1-functiebelangrijkheidswaarden (lSVC_L1) en logistische regressieclassificatie met de hoogst gerangschikte L1-functiebelangrijkheidswaarden (LR_L1).
De classificatiepool maakt gebruik van zeven verschillende classificaties om classificatiemodellen te bouwen. Deze classificaties bestaan uit lineaire ondersteuningsvectormachine (SVC), Gaussiaanse naïeve Bayes (GNB), logistische regressieclassificatie (LR), k-dichtstbijzijnde buur, waarbij k standaard is ingesteld op 5 (KNN), XGBoost, willekeurig bos (RF) en beslissingsboom (DT).
De willekeurige splitsing van de dataset in de trein: testsubsets kunnen worden ingesteld in de opdrachtregel. In het gedemonstreerde voorbeeld wordt de verhouding trein: test = 8: 2 gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft de details van de informatica-analyseprocedure en Python-commando's van de belangrijkste modules. Figuur 2 illustreert de drie belangrijkste stappen met voorbeeldcommando's die in dit protocol worden gebruikt en verwijst naar eerder gepubliceerde werken26,38 voor meer technische details. Voer het volgende protocol uit onder een normaal gebruikersaccount in een computersysteem en vermijd het gebruik van het beheerders- of rootaccount. Dit is een computationeel protocol en heeft geen biomedische gevaarlijke factoren.
1. Bereid de Python-omgeving voor
- Creëer een virtuele omgeving.
- In dit onderzoek is gebruik gemaakt van de programmeertaal Python en een virtuele Python-omgeving (VE) met Python 3.7. Volg deze stappen (Figuur 3A):
conda create -n healthmodel python=3.7
conda create is het commando om een nieuwe VE aan te maken. De parameter -n specificeert de naam van de nieuwe omgeving, in dit geval healthmodel. En python=3.7 specificeert de Python-versie die moet worden geïnstalleerd. Kies een voorkeursnaam en Python-versie die de bovenstaande opdracht ondersteunt. - Na het uitvoeren van de opdracht is de uitvoer vergelijkbaar met Figuur 3B. Voer y in en wacht tot het proces is voltooid.
- In dit onderzoek is gebruik gemaakt van de programmeertaal Python en een virtuele Python-omgeving (VE) met Python 3.7. Volg deze stappen (Figuur 3A):
- Activeer de virtuele omgeving
- Activeer in de meeste gevallen de aangemaakte VE met het volgende commando (Figuur 3C):
Conda activeer HealthModel - Volg de platformspecifieke instructies voor de VE-activering, als sommige platforms vereisen dat de gebruiker de platformspecifieke configuratiebestanden uploadt voor activering.
- Activeer in de meeste gevallen de aangemaakte VE met het volgende commando (Figuur 3C):
- Installeer PyTorch 1.13.1
- PyTorch is een populair Python-pakket voor kunstmatige intelligentie (AI)-algoritmen. Gebruik PyTorch 1.13.1, gebaseerd op het CUDA 11.7 GPU-programmeerplatform, als voorbeeld. Andere versies vindt u op https://pytorch.org/get-started/previous-versions/. Gebruik het volgende commando (Figuur 3D):
pip3 Installeer zaklamp Torchvision TorchAudio
OPMERKING: Het gebruik van PyTorch versie 1.12 of nieuwer wordt sterk aanbevolen. Anders kan het installeren van de vereiste pakket torch_geometric een uitdaging zijn, zoals vermeld op de officiële torch_geometric website: https://pytorch-geometric.readthedocs.io/en/latest/install/installation.html.
- PyTorch is een populair Python-pakket voor kunstmatige intelligentie (AI)-algoritmen. Gebruik PyTorch 1.13.1, gebaseerd op het CUDA 11.7 GPU-programmeerplatform, als voorbeeld. Andere versies vindt u op https://pytorch.org/get-started/previous-versions/. Gebruik het volgende commando (Figuur 3D):
- Installeer extra pakketten voor toorts-geometrische
- Volg de richtlijnen op https://pytorch-geometric.readthedocs.io/en/latest/install/installation.html en installeer de volgende pakketten: torch_scatter, torch_sparse, torch_cluster en torch_spline_conv met behulp van de opdracht (Afbeelding 3E):
pip installeren pyg_lib torch_scatter torch_sparse torch_cluster torch_spline_conv -f https://data.pyg.org/whl/torch-1.13.0+cu117.html
- Volg de richtlijnen op https://pytorch-geometric.readthedocs.io/en/latest/install/installation.html en installeer de volgende pakketten: torch_scatter, torch_sparse, torch_cluster en torch_spline_conv met behulp van de opdracht (Afbeelding 3E):
- Installeer het toorts-geometrische pakket.
- Voor dit onderzoek is een specifieke versie, 2.2.0, van het toorts-geometrische pakket nodig. Voer de opdracht uit (Figuur 3F):
pip installeren torch_geometric==2.2.0
- Voor dit onderzoek is een specifieke versie, 2.2.0, van het toorts-geometrische pakket nodig. Voer de opdracht uit (Figuur 3F):
- Installeer andere pakketten.
- Pakketten zoals panda's zijn meestal standaard beschikbaar. Als dit niet het geval is, installeert u ze met behulp van het pip-commando. Als u bijvoorbeeld panda's en xgboost wilt installeren, voert u het volgende uit:
pip installeren panda's
pip installeren xgboost
- Pakketten zoals panda's zijn meestal standaard beschikbaar. Als dit niet het geval is, installeert u ze met behulp van het pip-commando. Als u bijvoorbeeld panda's en xgboost wilt installeren, voert u het volgende uit:
2. Het vooraf getrainde HealthModel gebruiken om de mqTrans-functies te genereren
- Download de code en het vooraf getrainde model.
- Download de code en het vooraf getrainde HealthModel van de website: http://www.healthinformaticslab.org/supp/resources.php, met de naam HealthModel-mqTrans-v1-00.tar.gz (Figuur 4A). Het gedownloade bestand kan worden gedecomprimeerd naar een door de gebruiker opgegeven pad. De gedetailleerde formulering en de ondersteunende gegevens van het geïmplementeerde protocol zijn te vinden in26.
- Introduceer de parameters om HealthModel uit te voeren.
- Wijzig eerst de werkmap in de map HealthModel-mqTrans op de opdrachtregel. Gebruik de volgende syntaxis voor het uitvoeren van de code:
Python main.py
De details met betrekking tot elke parameter en de gegevens-, model- en uitvoermappen zijn als volgt:
gegevensmap: Dit is de map met brongegevens en elk gegevensbestand heeft de csv-indeling. Deze gegevensmap bevat twee bestanden (zie gedetailleerde beschrijvingen in stap 2.3 en 2.4). Deze bestanden moeten worden vervangen door persoonsgegevens.
data.csv: Het transcriptomische matrixbestand. De eerste rij bevat de kenmerk-ID's (of gen-ID's) en de eerste kolom geeft de voorbeeld-ID's. De lijst met genen omvat de regulerende factoren (TF's en lincRNA's) en de gereguleerde mRNA-genen.
label.csv: Het voorbeeldlabelbestand. In de eerste kolom worden de voorbeeld-id's weergegeven en in de kolom met de naam 'label' wordt het voorbeeldlabel weergegeven.
modelmap: De map om informatie over het model op te slaan:
HealthModel.pth: Het vooraf getrainde HealthModel.
regulatory_geneIDs.csv: De regulerende gen-ID's die in deze studie zijn gebruikt.
target_geneIDs.csv: De doelgenen die in deze studie zijn gebruikt.
adjacent_matrix.csv: De aangrenzende matrix van regulerende genen.
uitvoermap: De uitvoerbestanden worden naar deze map geschreven, gemaakt door de code.
test_target.csv: De genexpressiewaarde van doelgenen na Z-normalisatie en imputatie.
pred_target.csv: De voorspelde genexpressiewaarde van doelgenen.
mq_target.csv: De voorspelde genexpressiewaarde van doelgenen.
- Wijzig eerst de werkmap in de map HealthModel-mqTrans op de opdrachtregel. Gebruik de volgende syntaxis voor het uitvoeren van de code:
- Bereid het transcriptomische matrixbestand voor in het csv-formaat.
- Elke rij vertegenwoordigt een monster en elke kolom vertegenwoordigt een gen (Figuur 4B). Geef het transcriptomische gegevensmatrixbestand een naam als data.csv in de gegevensmap .
OPMERKING: Dit bestand kan worden gegenereerd door handmatig een gegevensmatrix op te slaan in de .csv-indeling van software zoals Microsoft Excel. De transcriptomische matrix kan ook worden gegenereerd door computerprogrammering.
- Elke rij vertegenwoordigt een monster en elke kolom vertegenwoordigt een gen (Figuur 4B). Geef het transcriptomische gegevensmatrixbestand een naam als data.csv in de gegevensmap .
- Bereid het labelbestand voor in het csv-formaat.
- Net als bij het transcriptomische matrixbestand, geeft u het labelbestand een naam als label.csv in de gegevensmap (Afbeelding 4C).
OPMERKING: De eerste kolom geeft de namen van de monsters en het klasselabel van elk monster wordt gegeven in de kolom met de titel label. De 0-waarde in de labelkolom betekent dat dit monster negatief is, 1 betekent een positief monster.
- Net als bij het transcriptomische matrixbestand, geeft u het labelbestand een naam als label.csv in de gegevensmap (Afbeelding 4C).
- Genereer de mqTrans-functies.
- Voer de volgende opdracht uit om de mqTrans-functies te genereren en de uitvoer op te halen die wordt weergegeven in afbeelding 4D. De mqTrans-functies worden gegenereerd als het bestand ./output/mq_targets.csv en het labelbestand wordt opnieuw opgeslagen als het bestand ./output/label.csv. Voor het gemak van verdere analyse worden de oorspronkelijke expressiewaarden van de mRNA-genen ook geëxtraheerd als het bestand ./output/ test_target.csv.
python ./Get_mqTrans/code/main.py ./data ./Get_mqTrans/model ./output
- Voer de volgende opdracht uit om de mqTrans-functies te genereren en de uitvoer op te halen die wordt weergegeven in afbeelding 4D. De mqTrans-functies worden gegenereerd als het bestand ./output/mq_targets.csv en het labelbestand wordt opnieuw opgeslagen als het bestand ./output/label.csv. Voor het gemak van verdere analyse worden de oorspronkelijke expressiewaarden van de mRNA-genen ook geëxtraheerd als het bestand ./output/ test_target.csv.
3. Selecteer mqTrans-functies
- Syntaxis van de functieselectiecode
- Wijzig eerst de werkmap in de map HealthModel-mqTrans . Gebruik de volgende syntaxis:
python ./FS_classification/testMain.py
De details van elke parameter zijn als volgt:
in-data-file: Het invoergegevensbestand
in-label-file: Het label van het invoergegevensbestand
uitvoermap: In deze map worden twee uitvoerbestanden opgeslagen, waaronder Output-score.xlsx (de methode voor het selecteren van functies en de nauwkeurigheid van de bijbehorende classificatie) en Output-SelectedFeatures.xlsx (de geselecteerde functienamen voor elk algoritme voor het selecteren van functies).- select_feature_number: selecteer het aantal objecten, variërend van 1 tot het aantal objecten van het gegevensbestand.
- test_size: Stel de verhouding van het te splitsen testmonster in. 0,2 betekent bijvoorbeeld dat de ingevoerde dataset willekeurig wordt opgesplitst in de trein: testsubsets in de verhouding 0,8:0,2.
- combineren: Als dit waar is, combineert u twee gegevensbestanden voor het selecteren van functies, d.w.z. de oorspronkelijke expressiewaarden en de mqTrans-functies. Als deze niet waar is, gebruikt u slechts één gegevensbestand voor het selecteren van functies, d.w.z. de oorspronkelijke expressiewaarden of de mqTrans-functies.
- bestand combineren: Als combineren waar is, geeft u deze bestandsnaam op om de gecombineerde gegevensmatrix op te slaan.
OPMERKING: Deze pijplijn is bedoeld om te demonstreren hoe de gegenereerde mqTrans-functies presteren op classificatietaken en maakt rechtstreeks gebruik van het bestand dat is gegenereerd door sectie 2 voor de volgende bewerkingen.
- Wijzig eerst de werkmap in de map HealthModel-mqTrans . Gebruik de volgende syntaxis:
- Voer het algoritme voor functieselectie uit voor de selectie van mqTrans-functies.
- Draai combine = False als de gebruiker mqTrans-functies of originele functies selecteert.
- Selecteer eerst 800 originele kenmerken en splits de dataset op in trein: test=0.8:0.2:
python ./FS_classification/testMain.py ./output/test_target.csv ./output/label.csv ./result 800 0.2 Onwaar - Draai combine =True, als de gebruiker de mqTrans-functies wil combineren met de oorspronkelijke expressiewaarden om objecten te selecteren. Hier is het demonstratieve voorbeeld om 800 functies te selecteren en de dataset op te splitsen in trein: test=0.8:0.2:
python ./FS_classification/testMain.py ./output/mq_targets.csv ./output/label.csv ./result_combine 800 0.2 True ./output/test_target.csv
OPMERKING: Afbeelding 5 toont de uitvoerinformatie. De aanvullende bestanden die nodig zijn voor dit protocol bevinden zich in HealthModel-mqTrans-v1-00.tar map (Supplementary Coding File 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van de mqTrans-weergave van de transcriptomische dataset
De testcode maakt gebruik van elf algoritmen voor functieselectie (FS) en zeven classificaties om te evalueren hoe de gegenereerde mqTrans-weergave van de transcriptomische dataset bijdraagt aan de classificatietaak (Afbeelding 6). De testdataset bestaat uit 317 colonadenocarcinoom (COAD) uit de database The Cancer Genome Atlas (TCGA)29. De COAD-patiënten in stadium I of II worden beschouwd als de negatieve monsters, terwijl die in stadium III of IV de positieve zijn.
In de testcode zijn elf FS-algoritmen geïmplementeerd. Er zijn drie op filters gebaseerde FS-algoritmen, waaronder geselecteerde K-beste functies op basis van MIC (SK_mic), geselecteerde K-functies op basis van de FPR van MIC (SK_fpr) en geselecteerde K-functies op basis van de hoogste FDR van MIC (SK_fpr). Drie op bomen gebaseerde FS-algoritmen evalueren de individuele kenmerken door respectievelijk een beslissingsboom met gini-index (DT_gini), de adaptieve versterkte beslissingsbomen (AdaBoost) en het willekeurige bos (RF_fs). De FS-pool van de testcode evalueert ook twee wrappers recursieve functie-eliminatie (RFE) met de lineaire ondersteuningsvectorclassificatie (SVC) (RFE_SVC) en RFE met de logistische regressieclassificatie (RFE_LR), en twee inbeddingsalgoritmen lineaire SVC-classificatie met de best gerangschikte L1-functiebelangrijkheidswaarden (lSVC_L1) en logistieke regressieclassificatie met de hoogst gerangschikte L1-functiebelangrijkheidswaarden (LR_L1).
De testcode bouwt de classificatiemodellen met behulp van zeven classificaties, waaronder lineaire ondersteuningsvectormachine (SVC), Gaussiaanse naïeve Bayes (GNB), logistische regressieclassificatie (LR), k-dichtstbijzijnde buur, k-5 standaard (KNN), XGBoost, willekeurig bos (RF) en beslissingsboom (DT).
Figuur 6 toont de maximale testnauwkeurigheid van de mqTrans-kenmerken, de originele mRNA-kenmerken en de gecombineerde subset van de mRNA- en mqTrans-kenmerken die door elk FS-algoritme worden aanbevolen.
De gecombineerde kenmerksubsets (mRNA+mqTrans) hebben de hoogste nauwkeurigheid van 0,7656 bereikt op de "SK_fpr" FS-methode, beter dan de individuele kenmerktypen mqTrans (0,7188) en origineel mRNA (0,7188). Vergelijkbare patronen kunnen worden waargenomen voor de andere FS-algoritmen. De gebruiker kan de geselecteerde functies in het uitvoerbestand Output-SelectedFeatures.csv controleren.
Detectie van de donkere biomarkers
Eerdere studies toonden het bestaan aan van de niet-differentieel tot expressie gebrachte genen met significant differentieel vertegenwoordigde mqTrans-waarden tussen de fenotypische en controlegroepen 26,38,39. Deze genen worden donkere biomarkers genoemd omdat traditionele biomarkerdetectiestudies ze negeren door hun niet-differentiële expressies. De statistische analysefunctie t.test in Microsoft Excel kan worden gebruikt om een functie te definiëren die differentieel wordt uitgedrukt als de statistische p-waarde kleiner is dan 0,05.
Van de 3062 kenmerken met de gegenereerde mqTrans-waarden werden 221 donkere biomarkers gedetecteerd (Figuur 7). Het derde gen ENSG00000163697 (APBB2, Amyloid Beta Precursor Protein Binding Family B Member 2) vertoont significant differentieel vertegenwoordigde mqTrans-waarden (mqTrans.P = 2,03 x 10-4), terwijl het oorspronkelijke expressieniveau geen differentiële expressie vertoont (mRNA.P = 3,80 x 10-1). Het trefwoord APBB2 trof 27 publicaties in de PubMed-database40, maar er werden geen verbanden met de dikke darm of darm gedetecteerd.
Een ander gen ENSG00000048052 (HDAC9, histondeacetylase 9) heeft de differentieel vertegenwoordigde mqTrans-waarden (mqTrans.P = 6,09 x 10-3) met behoud van praktisch dezelfde normale verdelingen tussen de fenotypische en controlegroepen (mRNA.P = 9,62 x 10-1). Het trefwoord HDAC9 bereikte 417 publicaties in de PubMed-database. Drie studies noemden ook de trefwoorden "dikke darm" of "darm" in de samenvattingen 41,42,43. Maar geen van hen onderzocht de rol van HDAC9 bij darmkanker.
De gegevens suggereerden de noodzaak van verdere evaluaties van deze donkere biomarkers op basis van hun post-transcriptieactiviteiten, bijvoorbeeld de vertaalde eiwitniveaus44,45.
Pan-kanker distributies van metabolisme-gerelateerde donkere en traditionele biomarkers
De metabolismegerelateerde traditionele biomarkers werden gescreend en vergeleken met donkere biomarkers bij 26 soorten kanker in de TCGA-dataset38. Beide categorieën biomarkers ondergingen een statistische evaluatie om significantieniveaus te onderscheiden in vroege (stadia I en II) en late (stadia III en IV) kankerstadia. Deze evaluatie maakte gebruik van Student's t-toetsen voor p-waarden, vervolgens gecorrigeerd voor meervoudige testen met behulp van valse ontdekkingspercentages (FDR's). Gedetailleerde gegevens voor elk van de 26 soorten kanker zijn te vinden in figuur 8.
Genen die FDR-gecorrigeerde p-waarden van minder dan 0,05 opleverden, werden geclassificeerd als traditionele biomarkers. Daarentegen werden donkere biomarkers gedefinieerd als biomarkers met FDR-gecorrigeerde p-waarden lager dan 0,05 in de mqTrans-weergave, terwijl ze tegelijkertijd geen statistisch significante verschillen in expressieniveaus vertoonden.
Figuur 9 onthult een algemene schaarste aan donkere biomarkers in vergelijking met traditionele biomarkers voor de meeste soorten kanker. Opmerkelijke uitzonderingen zijn BRCA, MESO en TGCT, die een grotere prevalentie van donkere biomarkers vertonen. Er wordt onthuld dat verschillende factoren, waaronder transcriptiefactoren, methylatiepatronen, genmutaties en omgevingsomstandigheden, de transcriptionele ontregeling van deze donkere biomarkers kunnen moduleren. Verdere complexiteit kan ontstaan als gevolg van overlappende niet-coderende RNA-transcripten die de expressieniveaus van donkere biomarkers kunnen verwarren. Transcriptie-ontregelingen van sommige donkere biomarkers werden ondersteund door hun differentiële eiwitniveaus44,45. De donkere biomarkers worden vaak over het hoofd gezien in traditionele studies en bieden intrigerende wegen voor toekomstig mechanistisch onderzoek.
Figuur 1: Een overzicht van het HealthModel en de modules voor functieselectie in dit protocol. Vervang de specifieke algoritmen in de functieselectiegroep en de classificatiegroep als de gebruiker bekend is met de Python-programmering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Volledige codestroom voor dit protocol. (a) Bereid de Python-omgeving voor. Maak om te beginnen een virtuele omgeving en installeer essentiële pakketten. Voor uitgebreide instructies, zie hoofdstuk 1. (B) Genereer mqTrans-functies. Verkrijg mqTrans-functies door de verstrekte code stap voor stap uit te voeren. Gedetailleerde uitleg is te vinden in hoofdstuk 2. (C) Selecteer mqTrans-functies. Dit gedeelte richt zich op het beoordelen van de mqTrans-functies. Raadpleeg hoofdstuk 3 voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Omgeving voorbereiden voor Python. (A) De opdracht om een gezondheidsmodel te maken. (B) Voer y in tijdens het maken van VE. (C) Het meest voorkomende commando voor het activeren van de VE. (D) Het commando voor het installeren van toorts 1.13.1. (E) Installeer extra bibliotheken voor het toortsgeometrische pakket. (F) Installeer het toorts-geometrische pakket. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 4: Voer het HealthModel uit om de mqTrans-functie op te halen. (A) Download de code. (B) Het voorbeeld van het gegevensbestand. Elke kolom bevat alle waarden van een regulerende factor en het eerste item is de gen-ID. Elke rij geeft de waarden van een bepaald monster, waarbij het eerste item de naam van het monster is. (C) Het voorbeeld van een labelbestand. De eerste kolom geeft de namen van de steekproeven en het klasselabel van elk steekproef wordt gegeven in de kolom met de titel label. De 0-waarde in de labelkolom betekent dat dit monster leeft, 1 betekent dood. (D) de output van mqTrans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Voer het algoritme voor het selecteren van functies uit voor de functie mqTrans. De resultaten van het algoritme voor functieselectie worden aan de gebruiker getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: De maximale nauwkeurigheid van de testset van elk algoritme voor het selecteren van functies. De horizontale as geeft de algoritmen voor het selecteren van functies weer en de verticale as geeft de waarden van de nauwkeurigheid weer. De histogrammen tonen de experimentele gegevens van de drie instellingen, d.w.z. mqTrans, mRNA, mRNA+mqTrans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Top 50 donkere biomarkers met de kleinste p-waarden in de mqTrans-weergave. De kolom "Dark Biomarker" geeft de namen van de donkere biomarkers. De kolommen "mRNA.P" en "mqTrans.P" zijn de statistische t-test p-waarden tussen de fenotypische en controlegroepen. De achtergrondkleuren van de p-waarden zijn gekleurd tussen de p-waarden 1,00 (blauw) en 0,00 (rood), en de witte kleur staat voor p-waarde = 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: De details van de 26 kankers in The Cancer Genome Atlas (TCGA) in verschillende stadia. De kolommen "Cohort" en "Ziekteweefsel" beschrijven voor elke dataset de patiëntengroep en de weefsels met ziekte. De laatste vier kolommen geven het aantal monsters in respectievelijk de ontwikkelingsstadia I, II, III en IV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Het aantal donkere biomarkers en traditionele biomarkers bij 26 kankers. Op de horizontale as staan de 26 soorten kanker. De verticale as geeft het aantal donkere biomarkers en traditionele biomarkers voor deze kankersoorten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend coderingsbestand 1: HealthModel-mqTrans-v1-00.tar Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sectie 2 (Gebruik het vooraf getrainde HealthModel om de mqTrans-functies te genereren) van het protocol is de meest kritieke stap binnen dit protocol. Na het voorbereiden van de computationele werkomgeving in sectie 1, genereert sectie 2 de mqTrans-weergave van een transcriptomische dataset op basis van het vooraf getrainde grote referentiemodel. Sectie 3 is een demonstratief voorbeeld van het selecteren van de gegenereerde mqTrans-functies voor biomarkerdetecties en voorspellingstaken. De gebruikers kunnen andere transcriptomische analyses uitvoeren op deze mqTrans-dataset met behulp van hun eigen tools of codes.
Het oorspronkelijke HealthModel-framework kan het vooraf getrainde HealthModel verder verfijnen met behulp van de multitask-architectuur, zoals beschreven in26. Dit protocol richt zich op het gebruik van het vooraf getrainde referentiemodel om de mqTrans-weergave van een transcriptomische dataset te genereren.
Het standaard vooraf getrainde referentiemodel is vastgesteld op de gezonde monsters en is mogelijk geen goede keuze voor sommige specifieke taken, bijvoorbeeld het onderzoek tussen de primaire en gemetastaseerde kankers. De rekensnelheid is ook traag voor een grote transcriptomische dataset.
Het belang van dit protocol is om een complementair mqTrans-beeld te bieden van het meest overvloedig beschikbare OMIC-gegevenstype, d.w.z. transcriptoom. Donkere biomarkers kunnen worden onthuld uit de ongedifferentieerd tot expressie gebrachte genen die worden genegeerd door de conventionele transcriptomische analyse. Een recente studie detecteerde zeven donkere biomarkers van uitgezaaide darmkanker (mCC) op basis van drie onafhankelijke cohorten van in totaal 805 monsters44. Donkere biomarkers kregen beperkte nat-laboratoriumonderzoeken vanwege hun niet-differentiële expressies. Een van de gedetecteerde mCC donkere biomarker YTHDC2 codeert echter voor het eiwit YTH-domein dat 2 bevat, waarvan werd waargenomen dat de eiwitniveaus positief gecorreleerd waren met de metastasestatus van menselijke maagkankercellen46 en darmkankers47. Nieuwe biologische inzichten van donkere biomarkers moeten nog worden opgelost door middel van in-vitro- en in-vivotechnologieën.
Dit protocol is ontworpen om volledig modulair te zijn. Referentiemodellen die vooraf zijn getraind op andere grote datasets, zoals primaire kankers, zullen het onderzoek naar tumormetastasen vergemakkelijken. Dit protocol zal ook worden onderzocht voor toepassingen in andere levensdomeinen, waaronder planten, schimmels en microben.
Het is de bedoeling dat de rekenefficiëntie van dit protocol wordt verbeterd door parallellisatie en algoritmische optimalisatie.
Dit protocol beschrijft de procedure om een transcriptomische dataset te transformeren naar een nieuwe mqTrans-weergave, en de getransformeerde mqTrans-waarden van een gen meten kwantitatief de veranderingen in de transcriptieregulatie in vergelijking met de referentiemonsters. Een standaardmodel werd vooraf getraind op de gezonde transcriptomen en vrijgegeven als het referentie HealthModel.
De broncode van twee stroomafwaartse taken wordt verstrekt om het gemakkelijke gebruik van dit protocol door biomedische onderzoekers te vergemakkelijken. De experimentele gegevens laten zien dat de getransformeerde mqTrans-functies de voorspellingstaken kunnen verbeteren door alleen de oorspronkelijke expressieniveaus te gebruiken. De mqTrans-weergave kan ook de latente fenotypische verbindingen van sommige donkere biomarkers onthullen zonder differentiële expressies in de originele transcriptomische gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Senior en Junior Technological Innovation Team (20210509055RQ), Guizhou Provincial Science and Technology Projects (ZK2023-297), de Science and Technology Foundation of Health Commission van de provincie Guizhou (gzwkj2023-565), Science and Technology Project van het Education Department van de provincie Jilin (JJKH20220245KJ en JJKH20220226SK), de National Natural Science Foundation of China (U19A2061), het Jilin Provincial Key Laboratory of Big Data Intelligent Computing (20180622002JC), en de Fondsen voor Fundamenteel Onderzoek voor de Centrale Universiteiten, JLU. We betuigen onze oprechte waardering aan de review-editor en de drie anonieme reviewers voor hun constructieve kritiek, die een belangrijke rol heeft gespeeld bij het aanzienlijk verbeteren van de nauwkeurigheid en duidelijkheid van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaconda | Anaconda | version 2020.11 | Python programming platform |
| Computer | N/A | N/A | Any general-purpose computers satisfy the requirement |
| GPU card | N/A | N/A | Any general-purpose GPU cards with the CUDA computing library |
| pytorch | Pytorch | version 1.13.1 | Software |
| torch-geometric | Pytorch | version 2.2.0 | Software |
References
- Mutz, K. -O., Heilkenbrinker, A., Lönne, M., Walter, J. -G., Stahl, F. Transcriptome analysis using next-generation sequencing. Curr Opin in Biotechnol. 24 (1), 22-30 (2013).
- Meng, G., Tang, W., Huang, E., Li, Z., Feng, H. A comprehensive assessment of cell type-specific differential expression methods in bulk data. Brief Bioinform. 24 (1), 516 (2023).
- Iqbal, N., Kumar, P. Integrated COVID-19 Predictor: Differential expression analysis to reveal potential biomarkers and prediction of coronavirus using RNA-Seq profile data. Comput Biol Med. 147, 105684 (2022).
- Ravichandran, S., et al. VB(10), a new blood biomarker for differential diagnosis and recovery monitoring of acute viral and bacterial infections. EBioMedicine. 67, 103352 (2021).
- Lv, J., et al. Targeting FABP4 in elderly mice rejuvenates liver metabolism and ameliorates aging-associated metabolic disorders. Metabolism. 142, 155528 (2023).
- Cruz, J. A., Wishart, D. S. Applications of machine learning in cancer prediction and prognosis. Cancer Inform. 2, 59-77 (2007).
- Cox, D. R. Analysis of Survival Data. , Chapman and Hall/CRC. London. (2018).
- Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
- Ramilowski, J. A., et al. A draft network of ligand-receptor-mediated multicellular signalling in human. Nat Commun. 6 (1), 7866 (2015).
- Xu, Y., et al. MiR-145 detection in urinary extracellular vesicles increase diagnostic efficiency of prostate cancer based on hydrostatic filtration dialysis method. Prostate. 77 (10), 1167-1175 (2017).
- Wang, Y., et al. Profiles of differential expression of circulating microRNAs in hepatitis B virus-positive small hepatocellular carcinoma. Cancer Biomark. 15 (2), 171-180 (2015).
- Hu, S., et al. Transcriptional response profiles of paired tumor-normal samples offer novel. Oncotarget. 8 (25), 41334-41347 (2017).
- Xu, H., Luo, D., Zhang, F. DcWRKY75 promotes ethylene induced petal senescence in carnation (Dianthus caryophyllus L). Plant J. 108 (5), 1473-1492 (2021).
- Niu, H., et al. Dynamic role of Scd1 gene during mouse oocyte growth and maturation. Int J Biol Macromol. 247, 125307 (2023).
- Aznaourova, M., et al. Single-cell RNA sequencing uncovers the nuclear decoy lincRNA PIRAT as a regulator of systemic monocyte immunity during COVID-19. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (36), 2120680119 (2022).
- Prakash, A., Banerjee, M. An interpretable block-attention network for identifying regulatory feature interactions. Brief Bioinform. 24 (4), (2023).
- Zhai, Y., et al. Single-cell RNA sequencing integrated with bulk RNA sequencing analysis reveals diagnostic and prognostic signatures and immunoinfiltration in gastric cancer. Comput Biol Med. 163, 107239 (2023).
- Duan, L., et al. Dynamic changes in spatiotemporal transcriptome reveal maternal immune dysregulation of autism spectrum disorder. Comput Biol Med. 151, 106334 (2022).
- Zolotareva, O., et al. Flimma: a federated and privacy-aware tool for differential gene expression analysis). Genome Biol. 22 (1), 338 (2021).
- Su, R., Zhu, Y., Zou, Q., Wei, L. Distant metastasis identification based on optimized graph representation of gene. Brief Bioinform. 23 (1), (2022).
- Xing, X., et al. Multi-level attention graph neural network based on co-expression gene modules for disease diagnosis and prognosis. Bioinformatics. 38 (8), 2178-2186 (2022).
- Bongini, P., Pancino, N., Scarselli, F., Bianchini, M. BioGNN: How Graph Neural Networks Can Solve Biological Problems. Artificial Intelligence and Machine Learning for Healthcare: Vol. 1: Image and Data Analytics. , Springer. Cham. (2022).
- Muzio, G., O'Bray, L., Borgwardt, K. Biological network analysis with deep learning. Brief Bioinform. 22 (2), 1515-1530 (2021).
- Luo, H., et al. Multi-omics integration for disease prediction via multi-level graph attention network and adaptive fusion. bioRxiv. , (2023).
- Feng, X., et al. Selecting multiple biomarker subsets with similarly effective binary classification performances. J Vis Exp. (140), e57738 (2018).
- Duan, M., et al. Orchestrating information across tissues via a novel multitask GAT framework to improve quantitative gene regulation relation modeling for survival analysis. Brief Bioinform. 24 (4), (2023).
- Chicco, D., Starovoitov, V., Jurman, G. The benefits of the Matthews correlation Coefficient (MCC) over the diagnostic odds ratio (DOR) in binary classification assessment. IEEE Access. 9, 47112-47124 (2021).
- Goldman, M. J., et al. Visualizing and interpreting cancer genomics data via the Xena platform. Nat Biotechnol. 38 (6), 675-678 (2020).
- Liu, J., et al. An integrated TCGA pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416 (2018).
- Uhlen, M., et al. Towards a knowledge-based human protein atlas. Nat Biotechnol. 28 (12), 1248-1250 (2010).
- Hernaez, M., Blatti, C., Gevaert, O. Comparison of single and module-based methods for modeling gene regulatory. Bioinformatics. 36 (2), 558-567 (2020).
- Consortium, G. The genotype-tissue expression (GTEx) project. Nat Genet. 45 (6), 580-585 (2013).
- Kanehisa, M., et al. KEGG for taxonomy-based analysis of pathways and genomes. Nucleic Acids Res. 51, D587-D592 (2023).
- Han, H., et al. TRRUST v2: an expanded reference database of human and mouse transcriptional. Nucleic Acids Res. 46, D380-D386 (2018).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Sulaimanov, N., et al. Inferring gene expression networks with hubs using a degree weighted Lasso. Bioinformatics. 35 (6), 987-994 (2019).
- Kogelman, L. J. A., Kadarmideen, H. N. Weighted Interaction SNP Hub (WISH) network method for building genetic networks. BMC Syst Biol. 8, 5 (2014).
- Duan, M., et al. Pan-cancer identification of the relationship of metabolism-related differentially expressed transcription regulation with non-differentially expressed target genes via a gated recurrent unit network. Comput Biol Med. 148, 105883 (2022).
- Duan, M., et al. Detection and independent validation of model-based quantitative transcriptional regulation relationships altered in lung cancers. Front Bioeng Biotechnol. 8, 582 (2020).
- Fiorini, N., Lipman, D. J., Lu, Z.
- Liu, J., et al. Maternal microbiome regulation prevents early allergic airway diseases in mouse offspring. Pediatr Allergy Immunol. 31 (8), 962-973 (2020).
- Childs, E. J., et al. Association of common susceptibility variants of pancreatic cancer in higher-risk patients: A PACGENE study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (7), 1185-1191 (2016).
- Wang, C., et al. Thailandepsins: bacterial products with potent histone deacetylase inhibitory activities and broad-spectrum antiproliferative activities. J Nat Prod. 74 (10), 2031-2038 (2011).
- Lv, X., et al. Transcriptional dysregulations of seven non-differentially expressed genes as biomarkers of metastatic colon cancer. Genes (Basel). 14 (6), 1138 (2023).
- Li, X., et al. Undifferentially expressed CXXC5 as a transcriptionally regulatory biomarker of breast cancer. Advanced Biology. , (2023).
- Yuan, W., et al. The N6-methyladenosine reader protein YTHDC2 promotes gastric cancer progression via enhancing YAP mRNA translation. Transl Oncol. 16, 101308 (2022).
- Tanabe, A., et al. RNA helicase YTHDC2 promotes cancer metastasis via the enhancement of the efficiency by which HIF-1α mRNA is translated. Cancer Lett. 376 (1), 34-42 (2016).
