Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

La inmunofluorescencia es una técnica fundamental de la biología celular moderna desarrollada originalmente por Albert Coons, que permite la detección de moléculas en sus compartimentos celulares nativos y la caracterización de las composiciones moleculares de orgánulos o maquinarias subcelulares¹. Junto con las manipulaciones genéticas, la inmunofluorescencia ayuda a establecer el concepto ahora bien aceptado de que la localización de proteínas es esencial para^{su función.} Aparte de los anticuerpos primarios específicos y los colorantes fluorescentes brillantes, el éxito de esta técnica se basa en un proceso preliminar llamado fijación y permeabilización, que preserva las morfologías celulares, inmoviliza los antígenos y aumenta la accesibilidad de los anticuerpos a los compartimentos intracelulares. Inevitablemente, el proceso de fijación y permeabilización mataría a las células y terminaría con todos los procesos biológicos³. Por lo tanto, la inmunofluorescencia solo proporciona instantáneas del viaje de la vida de las proteínas. Sin embargo, muchos procesos biológicos, como la migración y la división celular, son de naturaleza dinámica, lo que requiere la investigación del comportamiento de las proteínas de una manera resuelta espacio-temporalmente ^4,5.

Para examinar la dinámica de las proteínas en los organismos vivos, se han desarrollado métodos de imagen en vivo basados en proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, como la proteína fluorescente verde (GFP)⁶ y microscopios confocales de alta velocidad. Brevemente, la proteína de interés puede ser manipulada genéticamente para ser fusionada con GFP⁷, y luego expresada ectópicamente a partir de promotores virales o de levaduras como el citomegalovirus (CMV)⁸ o la secuencia de activación ascendente (UAS)⁹. Debido a que la GFP es de naturaleza autofluorescente, no se requieren anticuerpos acoplados a fluoróforos para revelar la localización de las proteínas diana, lo que evita la necesidad de procesos preliminares de fijación o permeabilización. A lo largo de las últimas dos décadas, se han desarrollado etiquetas fluorescentes que abarcan todo el espectro de longitudes de onda¹⁰, lo que permite obtener imágenes en vivo multicolor de varias proteínas diana al mismo tiempo. Sin embargo, en comparación con los colorantes fluorescentes de ingeniería química como AlexaFluor o ATTO, la autofluorescencia de estas proteínas fluorescentes codificadas genéticamente es relativamente débil e inestable cuando se expresa a partir de promotores endógenos, especialmente durante la obtención de imágenes en vivo en escalas de tiempo más largas¹⁰. Si bien este déficit puede mitigarse mediante la sobreexpresión de proteínas diana marcadas con fluorescencia, muchas con actividades enzimáticas como quinasas y fosfatasas interrumpen gravemente los procesos biológicos normales si no se expresan a niveles fisiológicos.

Este protocolo presenta un método que permite la iluminación de dianas basada en anticuerpos fotoestables en una configuración de imagen en vivo, lo que esencialmente permite la inmunofluorescencia sin el proceso de fijación o permeabilización (Figura 1). A través de una simple reacción de amina primaria basada en NHS¹¹, se pueden conjugar colorantes fluorescentes como AlexaFluor 488 o 594 con esencialmente cualquier anticuerpo primario o GFP/HA/Myc^{nanobody 12}. Aprovechando una característica del desarrollo de que todas las células embrionarias de Drosophila comparten un citoplasma común durante la etapa¹³ de sincitio, se puede lograr la unión al antígeno y la iluminación en embriones enteros después de la inyección de anticuerpos conjugados con colorante. Con la expansión de las bibliotecas de proteínas marcadas endógenamente disponibles en Drosophila y otros sistemas modelo¹⁴, este método puede ampliar potencialmente las aplicaciones de estas bibliotecas al revelar la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia de baja abundancia y otras proteínas marcadas con fluorescencia (marcadas con HA/Myc) en tejidos vivos.

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y la aprobación de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad SUSTech. El organismo utilizado es Drosophila melanogaster, y los genotipos son Notch-Knockin-GFP (Cromosoma X) y Sqh-sqh-GFP (Cromosoma II), generosamente proporcionados por los laboratorios del Dr. François Schweisguth (Instituto Pasteur) y la Dra. Jennifer Zallen (Instituto Sloan Kettering), respectivamente. Si bien este protocolo se centra principalmente en aspectos del marcaje de anticuerpos y las imágenes en vivo, consulte los informes publicados para obtener descripciones más detalladas de la recolección e inyección de embriones de Drosophila ^15,16.

1. Marcaje fluorescente de anticuerpos

1. Preferiblemente, utilizar anticuerpos monoclonales o nanocuerpos para la proteína de interés. Prepare la concentración de anticuerpos en 1 mg/ml o más.
   NOTA: En este estudio, se utiliza como ejemplo el nanocuerpo GFP (ver Tabla de Materiales). El nanocuerpo GFP disponible en el mercado se envasa a una concentración de 1,0 mg/ml y un volumen de 250 μl. Además, se utiliza un kit de etiquetado de anticuerpos disponible en el mercado (véase la tabla de materiales), que conjuga Alexa Fluor 594 con aminas primarias de proteínas a través de una reacción de éster de succinimidilo¹¹. Es importante destacar que este proceso de etiquetado no altera significativamente la concentración de anticuerpos.
2. Prepare una solución de bicarbonato de sodio 1 M resuspendiendo el Componente B (incluido en el kit de etiquetado de anticuerpos) en 1 ml de agua desionizada.
3. Ajuste la concentración de anticuerpos a 1,0 mg/ml, luego agregue 1/10^de volumen (10 μl para 100 μl de nanocuerpo GFP) de la solución de bicarbonato de sodio 1 M.
4. Agregue 110 μL de la mezcla de anticuerpos (del paso 1.3) directamente al tubo que contiene el colorante Alexa Fluor 594. Invierta para mezclar (no haga vórtice) e incubar en un rotador durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Ensamble la columna de purificación a partir del kit de conjugación (consulte la Tabla de materiales). Prepare un lecho de resina de 1,5 ml (incluido en el kit de etiquetado de anticuerpos) y centrifugue la columna a 1100 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente (RT) para eliminar el exceso de líquido de la resina.
6. Añadir la mezcla de reacción (del paso 1.4) gota a gota en la parte superior de la columna de resina y centrifugar a 1100 x g durante 5 min a 4 °C para recoger el anticuerpo marcado. El anticuerpo recolectado debe aparecer de color rosado y el volumen debe ser ligeramente inferior a 100 μL. Almacenar en tubos envueltos en papel de aluminio o de color oscuro a 4 °C.

2. Preparación de embriones de Drosophila

1. Coloque 200 Drosophila adultas recién nacidas en una jaula de plástico en forma de cilindro (diámetro = 5 cm, altura = 8 cm) con una proporción de macho a hembra de 1: 10. Selle un lado con una malla metálica porosa para ventilar y el otro lado con una placa de agar de jugo de frutas/pasta de levadura.
2. Cambiar la placa cada 12 h durante tres días antes de la recogida de embriones. Esto permite la sincronización de la puesta de huevos de Drosophila y mejora la eficiencia de la recolección.
3. El día de la inyección, cambiar la jaula a una placa de zumo de frutas con un mínimo de pasta de levadura y recoger los embriones a 25 °C durante 1 h. Si la primera ronda de recolección no produce suficientes embriones (<50 embriones), deseche la primera placa y repita este paso para una segunda ronda de recolección hasta que se pongan más de 100 embriones en 1 h.
4. Retirar la placa de la jaula para detener la puesta de huevos e incubar a 25 °C durante otras 2 h para obtener embriones de 2-3 h de edad. La etapa correcta de los embriones es fundamental para el éxito de la inyección de anticuerpos.
5. Para quitar la cáscara de huevo de los embriones, agregue 2 ml de lejía al 50% a la placa de jugo de frutas y desaloje suavemente los embriones de la placa con un pincel (Figura 2A-4). A menudo, los embriones se colocan directamente sobre la pasta de levadura. En este caso, es aceptable cepillar la pasta de levadura en la solución de lejía para recolectar todos los embriones.
6. Incubar los embriones flotantes en lejía al 50% durante 2 minutos y agitar la placa de jugo de frutas cada 30 s para mejorar la eficiencia de la eliminación de la cáscara del huevo.
7. Transfiera la mezcla de embrión y lejía vertiéndola en un colador de células de nailon de 70 μm (Figura 2A-7). Lave bien los embriones con una botella de agua para eliminar cualquier residuo de lejía y pasta de levadura. Seque completamente el colador de células con toallas de papel, asegurándose de eliminar el exceso de agua alrededor de los embriones.

3. Alineación y desecación embrionaria

1. Prepare un gel de agarosa al 4% de 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (ancho, largo, alto) (Figura 2A-9) y deje que el gel se enfríe a temperatura ambiente. Corte un bloque de agarosa de 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (ancho, largo, alto) con una cuchilla de afeitar limpia y coloque el bloque en un portaobjetos de vidrio (Figura 2A-2). Examine el bloque de gel debajo del endoscopio de disección para asegurarse de que los bordes estén cortados rectos y que la superficie esté plana y seca.
2. Transfiere los embriones del colador al bloque de gel con un pincel. Extienda los embriones uniformemente a lo largo de la línea media del bloque cepillándolos suavemente. Lo ideal es que los grupos de embriones se separen en uno solo o en dobletes sin tocarse entre sí.
3. Prepare una pinza con dos patas pegadas con cinta adhesiva para crear una sola punta fina (Figura 2A-5). Bajo un endoscopio de disección, recoja embriones individuales con la pinza y colóquelos a lo largo del borde largo del bloque de gel. Alinear 20-30 embriones, asegurándose de que su eje antero-posterior esté paralelo al borde (Figura 2C).
4. Pipetear 10 μL de pegamento de heptano (ver Tabla de Materiales) en el centro de un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (Figura 2A-1) y extender el pegamento en un área rectangular de 0,5 cm x 3 cm con la punta de una pipeta. Espere a que el pegamento se seque por completo antes de usarlo.
5. Coloque el portaobjetos de vidrio con el bloque de gel en el borde del escritorio, con los embriones hacia afuera. Levante el cubreobjetos con pegamento usando una pinza de punta plana (Figura 2A-6) y manténgalo quieto encima de los embriones, con el lado del pegamento mirando hacia los embriones en un ángulo inclinado de alrededor de 45 grados.
   NOTA: Presione suavemente el cubreobjetos contra el bloque de gel para que los embriones entren en contacto con el pegamento, y luego libere rápidamente la presión y levante el cubreobjetos. La cantidad de tensión aplicada es fundamental para que los embriones puedan adherirse de manera estable al pegamento sin ser presionados demasiado fuerte y reventar.
6. Pipetear 10 μL de agua en el centro de un nuevo portaobjetos de vidrio y colocar el cubreobjetos con los embriones encima, con el lado del embrión hacia arriba (Figura 2B). Asegúrese de usar agua en lugar de esmalte de uñas u otro pegamento adhesivo para sujetar el cubreobjetos al portaobjetos de vidrio, ya que este lado del cubreobjetos se colocará directamente encima de la lente confocal para obtener imágenes en vivo.
7. Secar los embriones en una cámara de desecación (Figura 2A-3) (ver Tabla de Materiales) durante 10-15 min hasta que la membrana vitelina se arrugue (Figura 2E). El tiempo requerido puede variar con la humedad de la habitación y debe probarse experimentalmente para cada condición de laboratorio.
8. Pipetear 40 μL de aceite de halocarbono (una mezcla de tipo 27 y tipo 700 en una proporción de 1:1 en volumen, ver Tabla de Materiales) en un extremo de la tira embrionaria. Incline el portaobjetos hasta que el aceite de halocarbono cubra toda la superficie de los embriones.

4. Inyección de anticuerpos e imágenes

1. Prepare algunas agujas de vidrio para inyección con un extractor de micropipetas (consulte la Tabla de materiales para conocer la configuración de los parámetros) y cargue cada aguja con 5 μl de solución de anticuerpos marcada con AlexaFluor (del paso 1.6).
2. Coloque un cubreobjetos de 25 mm x 25 mm encima de un portaobjetos de vidrio. Pipetear 40 μL de aceite de halocarbono y extenderlo a lo largo del borde del cubreobjetos.
3. Debajo del endoscopio de inyección, alinee la punta de la aguja contra el borde del cubreobjetos debajo del aceite. Ajuste la presión de aire de inyección de la picobomba (consulte la Tabla de materiales) para que una bomba genere una burbuja llena de anticuerpos. El diámetro de la burbuja debe limitarse a 20-50 μm (Figura 2F).
4. Reemplace el portaobjetos de vidrio vacío por uno que contenga embriones bajo aceite. Alinear la punta de la aguja de inyección perpendicularmente contra el eje antero-posterior de los embriones (Figura 2D, G).
5. Verifique el estado de los embriones para asegurarse de que la mayoría hayan iniciado la celularización pero aún no hayan comenzado la gastrulación (etapa 4 y etapa 5), permaneciendo como un sincitio (Figura 2F, G).
   NOTA: El sello distintivo de esta etapa es la ausencia de surcos o pliegues y la presencia de un saco vitelino de forma ovalada y color oscuro visible en el centro del embrión. La caracterización morfológica de la etapa embrionaria bajo aceite se basa en el capítulo del libro "Etapas de la embriogénesis de Drosophila" de Volker Hartenstein¹⁷.
6. Utilice el manipulador de la etapa X-Y para mover los embriones hacia la aguja hasta que la punta llegue al centro de la yema. Bombee dos o tres veces para inyectar anticuerpos en la yema. El éxito de la inyección está indicado por la rápida desaparición de la arruga de la membrana vitelina a medida que los embriones ganan volumen de la solución de anticuerpos (Figura 2G).
7. Utilice el manipulador de la etapa X-Y para alejar los embriones de la aguja después de la inyección y moverlos hacia abajo hasta el siguiente embrión. Repita el paso 6 hasta que se inyecten todos los embriones en el portaobjetos.
8. Transfiera el portaobjetos de vidrio con los embriones inyectados a una cámara de humedad (Figura 2A-8). Incubar a 25 °C hasta alcanzar la etapa deseada de desarrollo embrionario.
9. Levante el cubreobjetos de 24 mm x 50 mm del portaobjetos de vidrio y colóquelo directamente en el portaobjetos del microscopio. El equipo sin embriones estará de cara a los objetivos. Localice los embriones usando una lente de bajo aumento bajo iluminación de campo brillante y cambie a una lente de 40x o 63x para obtener imágenes fluorescentes en vivo de alta resolución.

Para demostrar las ventajas del método de inyección de anticuerpos sobre las imágenes vivas basadas en marcadores fluorescentes o la inmunofluorescencia, se proporcionan dos estudios de caso que caracterizan la localización dinámica de un receptor transmembrana de baja abundancia, Notch, y un tipo de modificación postraduccional llamada fosforilación de tirosina en embriones vivos.

La actividad de señalización de Notch juega un papel importante en la determinación del destino celular durante la embriogénesis y la homeostasis de los órganos adultos18,19. Tras la activación por sus ligandos Delta/Jagged20, el dominio intracelular del receptor transmembrana Notch se escinde y se libera en el núcleo21, iniciando programas transcripcionales posteriores para impulsar cambios en el destino celular22. La localización estática del receptor Notch ha sido bien caracterizada por inmunofluorescencia en tejidos fijados en formaldehído. Sin embargo, la localización dinámica de Notch durante la unión del ligando o el proceso de escisión intracelular sigue siendo en gran medida desconocida23, debido a la falta de un método para obtener imágenes en vivo de esta proteína de abundancia relativamente baja a alta velocidad. Aquí, inyectamos nanocuerpo GFP conjugado con AlexaFluor en embriones que expresaban Notch marcado con GFP del locusendógeno 20. Sin inyección, Notch-GFP es apenas detectable en condiciones estándar de imágenes en vivo, y la señal fluorescente se blanquea rápidamente durante las imágenes de lapso de tiempo. Después de la inyección, la relación señal-ruido del receptor Notch mejora significativamente, comparable a la calidad de la señal de la inmunofluorescencia (Figura 3A). Además, la inyección de anticuerpos permite la caracterización temporal de la localización de Notch a intervalos de 45 s, sin una pérdida aparente de la intensidad de la señal durante una ventana de imagen de 5 minutos (Figura 3B).

La fosforilación de tirosina es un tipo importante de modificación postraduccional de proteínas que media la transducción de señales en muchas vías biológicas24. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales altamente específicos (como PY20 y 4G10) contra la fosfotirosina (p-Tyr) para caracterizar la localización y los niveles de fosforilación general de la tirosina mediante inmunofluorescencia y Western blots25. Si bien no hay marcadores fluorescentes que puedan rastrear los cambios en la fosforilación, los tejidos o las células deben fijarse y teñirse o lisarse y secarse en diferentes puntos de tiempo para proporcionar instantáneas del estado de fosforilación a lo largo del tiempo, para estudiar la cinética de la fosforilación de la tirosina tras la activación de la señal26 (por ejemplo, el tratamiento con factores de crecimiento). El intervalo de tiempo de este enfoque es de al menos unos pocos minutos de duración e inherentemente inexacto debido al tiempo variable requerido para procedimientos como la fijación o la lisis celular.

Aquí, se presenta evidencia de que el método de inyección de anticuerpos permite la visualización directa del estado de fosforilación en embriones vivos, rastreando los cambios de localización e intensidad de la fosforilación de tirosina a intervalos de tiempo regulares a nivel de segundos. El anticuerpo PY20 conjugado con AlexaFluor se inyectó en embriones que expresaban una cadena ligera de miosina marcada con GFP y se realizaron imágenes en vivo de doble color a intervalos de 45 s. Como se ha demostrado anteriormente, la fosforilación de tirosina está altamente enriquecida en las uniones tricelulares27, un patrón que también se recapitula por inmunofluorescencia (Figura 4A). Curiosamente, las imágenes en vivo también revelaron una nueva segunda población de señal de p-Tyr debajo del centro de la membrana apical, que no se observa mediante inmunofluorescencia (Figura 4B). A través de imágenes de doble color, se encontró que esta población de la señal p-Tyr está muy cerca de la miosina medial (Figura 4B, primeros planos), una subpoblación de miosina28 que de manera similar solo se pronuncia en condiciones de imágenes en vivo, pero apenas detectable mediante inmunofluorescencia. Además, la población medial de p-Tyr exhibe patrones de coalescencia y disipación pulsátiles similares (Figura 4C), como se mostró anteriormente para la miosinamedial 28. Todavía se desconoce la identidad y la función de una subpoblación medial de p-Tyr. En conjunto, estos resultados demuestran que el método de inyección de anticuerpos podría complementar en gran medida los enfoques tradicionales para caracterizar los comportamientos de las proteínas de baja abundancia y revelar nuevos patrones de localización que podrían haberse interrumpido durante el proceso de inmunofluorescencia.

Figura 1: Flujo de trabajo de inyección de anticuerpos. Flujo de trabajo esquemático que ilustra los pasos involucrados en el método de inyección de anticuerpos. Todo el proceso, desde la recolección de embriones hasta la inyección de anticuerpos, suele tardar entre 4 y 5 horas en completarse. Después de la inyección de anticuerpos, los embriones pueden incubarse en una cámara de humedad hasta la etapa deseada de desarrollo antes de la obtención de imágenes en vivo. AEL, después de la puesta de huevos; RT: temperatura ambiente; Ab: anticuerpo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Alineación e inyección embrionaria. (A) Descripción general de los elementos requeridos antes de la inyección, incluido un cubreobjetos, un portaobjetos de vidrio, una caja de desecación, un pincel, pinzas, un colador de células, una cámara de humedad y gel de agarosa. (B) Embriones alineados adheridos a pegamento de heptano en el centro del cubreobjetos y colocados encima de las perlas de desecación. (C) Alineación del eje antero-posterior de los embriones en paralelo con el borde del gel de agarosa. (D) Descripción general de la configuración de la inyección. (E) Comparación de la morfología embrionaria antes y después del proceso de desecación, con un enfoque en la arruga de la membrana vitelina después de la desecación. (F) Tamaño de la burbuja de inyección después de una sola pulsación de la picobomba. (G) Comparación de la morfología embrionaria antes y después de la inyección de anticuerpos, destacando la desaparición de las arrugas de la membrana después de la inyección. (E-G) se capturaron bajo una lente de objetivo de 10 aumentos utilizando microscopía de campo claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes en vivo del receptor Notch en embriones tempranos. (A) Localización del receptor Notch marcado con GFP endógenamente a través de inmunofluorescencia (izquierda), imágenes directas en vivo basadas en la autofluorescencia de GFP (centro) e inyección de nanocuerpo GFP conjugada con AlexaFluor 594 (derecha). (B) Localización dinámica de Notch-GFP a intervalos de 45 s después de la inyección de anticuerpos. Todas las imágenes se adquirieron con la parte anterior de los embriones hacia la izquierda y la cara ventral hacia abajo. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes en vivo de los patrones embrionarios de fosfotirosina. (A) Localización de tirosina fosforilada (p-Tyr) en embriones fijados mediante inmunofluorescencia. (B) Localización de p-Tyr (magenta) en embriones vivos que expresan cadena ligera de miosina marcada con GFP (verde). El recuadro discontinuo blanco indica vistas de cerca de la población medial de fosfotirosina y miosina debajo de la membrana apical. Barras de escala = 10 μm. (C) Localización de p-Tyr y GFP-miosina cada 45 s en embriones vivos. Las flechas blancas indican la población medial de p-Tyr y miosina. Todas las imágenes fueron capturadas con la parte anterior de los embriones hacia la izquierda y el lado ventral hacia abajo. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.