Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Qihong Zheng; Xiaoxiang Xiang; Yan Yan; Huapeng  H. Yu

doi:10.3791/66080

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Artículo de método

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

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DOI:

10.3791/66080

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19 de enero de 2024

Qihong Zheng^*¹ , Xiaoxiang Xiang^*¹ , Yan Yan²^,³ , Huapeng H. Yu¹

¹School of Life Sciences, SUSTech University, ²Shenzhen PKU-HKUST Medical Center, ³Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Resumen

La visualización de proteínas en células vivas utilizando GFP (proteína fluorescente verde) y otras etiquetas fluorescentes ha mejorado en gran medida la comprensión de la localización, la dinámica y la función de las proteínas. En comparación con la inmunofluorescencia, las imágenes en vivo reflejan con mayor precisión la localización de proteínas sin posibles artefactos que surjan de la fijación tisular. Es importante destacar que las imágenes en vivo permiten la caracterización cuantitativa y temporal de los niveles y la localización de proteínas, lo que es crucial para comprender los procesos biológicos dinámicos, como el movimiento o la división celular. Sin embargo, una limitación importante de los enfoques de marcado fluorescente es la necesidad de niveles de expresión de proteínas suficientemente altos para lograr una visualización exitosa. En consecuencia, no se pueden detectar muchas proteínas fluorescentes marcadas endógenamente con niveles de expresión relativamente bajos. Por otro lado, la expresión ectópica mediante promotores virales puede conducir a veces a una mala localización de proteínas o a alteraciones funcionales en contextos fisiológicos. Para abordar estas limitaciones, se presenta un enfoque que utiliza la detección de proteínas mediadas por anticuerpos de alta sensibilidad en embriones vivos, esencialmente realizando inmunofluorescencia sin necesidad de fijación tisular. Como prueba de principio, el receptor Notch marcado con GFP endógeno que apenas es detectable en embriones vivos se puede visualizar con éxito después de la inyección de anticuerpos. Además, este enfoque se adaptó para visualizar las modificaciones postraduccionales (PTM) en embriones vivos, lo que permitió detectar cambios temporales en los patrones de fosforilación de tirosina durante la embriogénesis temprana y reveló una nueva subpoblación de fosfotirosina (p-Tyr) debajo de las membranas apicales. Este enfoque puede modificarse para adaptarse a otros anticuerpos específicos de proteínas, específicos de etiquetas o específicos de PTM y debe ser compatible con otros organismos o líneas celulares modelo susceptibles de inyección. Este protocolo abre nuevas posibilidades para la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o PTM que antes eran difíciles de detectar con los métodos tradicionales de marcado fluorescente.

Introducción

La inmunofluorescencia es una técnica fundamental de la biología celular moderna desarrollada originalmente por Albert Coons, que permite la detección de moléculas en sus compartimentos celulares nativos y la caracterización de las composiciones moleculares de orgánulos o maquinarias subcelulares¹. Junto con las manipulaciones genéticas, la inmunofluorescencia ayuda a establecer el concepto ahora bien aceptado de que la localización de proteínas es esencial para^{su función.} Aparte de los anticuerpos primarios específicos y los colorantes fluorescentes brillantes, el éxito de esta técnica se basa en un proceso preliminar l....