Summary
该协议为建立来自不同疾病阶段的卵巢癌类器官提供了一个系统框架，并解决了患者特异性变异性的挑战，以提高产量并为后续应用实现稳健的长期扩展。它包括组织处理、接种、调整培养基要求和免疫荧光染色的详细步骤。
Abstract
虽然从患者来源的类器官及其临床背景信息中建立卵巢癌生物库有望在研究和患者护理方面取得进展，但由于这种致命恶性肿瘤的异质性，加上类器官技术固有的复杂性，标准化仍然是一个挑战。这种适应性强的方案提供了一个系统框架，考虑到祖细胞的患者特异性变异性，以实现卵巢癌类器官的全部潜力。通过实施结构化的实验工作流程来选择最佳培养条件和接种方法，并同时测试直接 3D 接种与 2D/3D 路线，在大多数情况下，我们获得了适用于各种下游应用的稳健的长期膨胀系。
值得注意的是，该方案已在大量高度异质的起始材料病例 （N = 120） 中经过测试并证明有效，包括高级别和低级别卵巢癌以及原发性减瘤、复发性疾病和新辅助手术标本的疾病阶段。在低 Wnt、高 BMP 的外源信号转导环境中，我们观察到祖细胞对 Heregulin 1 ß （HERß-1） 通路的激活具有不同的敏感性，其中 HERß-1 促进某些类器官的形成，而抑制另一些类器官的形成。对于患者样本的一部分，最佳的类器官形成和长期生长需要向培养基中添加成纤维细胞生长因子 10 和 R-Spondin 1。
此外，我们强调了组织消化和祖细胞分离的关键步骤，并指出了在塑料上进行 2D 短暂培养有利于基底膜提取物 2 型基质中后续类器官形成的例子。总体而言，最佳生物样本库需要同时对所有主要条件进行系统测试，以确定单个品系的适当生长环境。该协议还描述了有效包埋、切片和染色以获得类器官的高分辨率图像的处理程序，这是综合表型分析所必需的。
Introduction
由于上皮性卵巢癌晚期临床表现异质性和高复发率，其临床管理仍然具有挑战性1。提高我们对卵巢癌发展和生物学行为的理解需要研究方法，以解决疾病过程中患者的特异性变异性、治疗反应以及组织病理学和分子特征2。
生物样本库的特点是系统地收集和长期保存卵巢癌患者的肿瘤样本及其临床信息，为处于不同疾病阶段的大量患者群体提供保存，包括来自初次减瘤手术、新辅助化疗后和复发性疾病的肿瘤样本。它具有推进癌症研究的宝贵潜力，可作为有前途的预后生物标志物和治疗靶点的资源3。然而，传统的生物样本库方法，如福尔马林固定和冷冻，由于活力的丧失和天然三维组织结构的破坏，不适合对原始肿瘤样本进行功能研究4,5。
肿瘤学及其他领域的分子机制研究在很大程度上取决于使用适当的实验模型，这些模型忠实地反映了疾病的生物学特性，并保持了体内观察到的组织的体外特性。基于保留更新潜力的患者来源类器官，在实验室中复制上皮细胞的原始结构和功能，并允许在患者特定环境中进行测试。因此，它们已成为癌症研究和个性化医疗的非常有前途的工具，弥合了临床多样性和实验室研究之间的差距6,7,8,9。基于类器官系的个体药物反应和分子图谱的功能相关性测试的定制治疗策略，可以潜在地直接应用于患者护理10,11。长期培养的可能性，包括患者特异性特征，以及随着时间的推移收集相关的前瞻性临床数据，对于确定与疾病进展和耐药机制有关的新的预后和预测因素具有很大的希望3,9。
尽管如此，建立一个包含来自不同肿瘤样本的类器官的生物库需要严格遵守复杂的方法，并建立易于维护的方案12。流程标准化确保即使在高流动率下，训练有素的员工也能有效地建立和维护生物样本库，同时遵守最高质量标准13.几项研究报告了与原始肿瘤的突变和表型特征相对应的稳定卵巢癌类器官系的成功生成，且效率各不相同。尽管如此，常规生物样本库在实践中仍然具有挑战性，特别是对于细胞系的长期稳定生长，这是大规模扩增或成功基因组编辑的先决条件。
特别是，可扩展性问题在该领域仍然定义模糊，因为显示出缓慢和有限的生长潜力的类器官偶尔被算作已建立的品系。正如 Hoffmann 等人最初证明的那样，该研究的主要发现为这一进一步发展的方案提供了基础，卵巢癌组织的最佳处理需要一种独特的策略来适应异质性14。通过成熟培养物的 DNA 测序和转录组学分析（培养 4-10 个月）证实了通过该方法获得的类器官的表型表征以及与亲本肿瘤组织的密切相似性，证明了模型的稳定性 8、9、12、14。
与调节健康输卵管稳态的旁分泌环境相比，上皮层可能产生高级别浆液性卵巢癌 （HGSOC）、癌症再生潜力和类器官形成能力，对外源性 Wnt 补充的依赖性较小。此外，以类器官培养基中不存在 Noggin 为特征的活性骨形态发生蛋白 （BMP） 信号转导被证明有利于从卵巢癌实体组织沉积物中建立长期培养物14,15。在卵巢癌固体沉积物的系统生物样本库期间，我们已经证实了这些发现并建立了管道，该协议中概述了详细信息，以确保在大多数情况下持续长期扩展。我们发现，在使用原代分离株时，对不同培养基组成和接种方式进行平行测试对于改善长期稳定的类器官系的建立和提高产量至关重要，从而能够稳健地繁殖和扩展到下游实验所需的多孔形式16。
此外，手术过程中收集的样本的纯度和质量对于卵巢癌类器官在基础研究和分子诊断中的转化潜力至关重要。HGSOC 临床表现的复杂性要求外科医生、肿瘤学家和实验室科学家之间的密切合作，以确保正确识别相关材料，保持运输条件恒定，并高效生成类器官系，代表每个患者疾病的最重要特征。考虑到卵巢癌的异质性，该协议提供了一个标准化但适应性强的框架，以捕获卵巢癌类器官的全部潜力16,17。值得注意的是，该协议能够对广泛的卵巢癌临床表现进行可靠的生物样本库，包括不同的组织学类型（高级别和低级别卵巢癌，LGSOC），来自同一患者的不同沉积物，这些患者在干性调节方面表现出差异，来自新辅助治疗后手术的组织，活检材料，以及来自疾病进展复发期的手术样本。
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Protocol
收集卵巢癌手术的肿瘤组织标本，并按照 LMU 大学伦理委员会 （17-471） 的规定生成患者来源的类器官，并遵守现有的适用欧盟、国家和地方法规。参与研究的每位患者均以书面形式同意。处理新鲜组织样品时，需要获得生物安全 2 级安全许可和层流柜。鉴于组织样本具有潜在的传染性，由于缺乏对相关传染病的常规检测，不能排除这种传染性，因此有必要确保严格遵守机构生物安全法规，并为进行实验的人员提供足够的个人防护设备。
1. 准备工作
- 培养基制备
- 每周新鲜制备一次2D和3D培养基，并将其储存在4°C。
注： 表1列出了每种培养基成分的确切成分。卵巢癌培养基 1 （OCM1） 和 OCM2 都可以额外补充 HER1ß（终浓度：50 ng/mL），从而产生四种不同的情况：OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß。 - 创建生长因子试剂的储备溶液，并将其保持在20°C和A83-01和烟酰胺（储存在+4°C）的储备溶液。由于生长因子对温度的敏感性，请立即使用解冻的储备溶液进行培养基制备，并通过创建等分试样来避免重复解冻循环。
注意：培养基制备是需要严格控制的关键步骤。 - RSPO-1条件培养基的制备
- 在37°C下快速解冻HA-R-Spondin1-Fc 293 T细胞（在-80°C下储存）。 用 10 mL 基础培养基洗涤它们，辅以 10% 胎牛血清 （FCS），以下称为基础培养基++。
- 将细胞沉淀重悬于12mL基础培养基++中，并将其接种在T75烧瓶中。
- 当细胞达到汇合时，用含有胰蛋白酶的解离试剂（在37°C下4分钟）以1：6的比例分裂细胞。将它们接种到新的 T75 烧瓶中。
- 第二天，向培养基中加入绒霉素D1（1,25μL / mL）。
- 当细胞达到汇合时，用胰蛋白酶以1：20的比例（在37°C下4分钟）分裂细胞。将细胞接种到补充有藻霉素 D1 的 30 mL 基础培养基++（含有 10% FCS）中的多个 T75 烧瓶（根据目标最终体积的烧瓶数量）。
- 当细胞达到约50%的汇合度时，开始条件培养基生产：用补充有5%FCS的40 mL基础培养基代替培养基，不含藻霉素D1。
- 3天后收集第一个上清液。为了去除碎片，在1,200× g下离心10分钟。将上清液保存在4°C的无菌容器中。
- 向细胞中加入补充有 5% FCS 的新基础培养基。3-4天后收集第二个上清液。在1,200× g下离心10分钟。将第二上清液加入第一上清液中。
- 使用0.2μm瓶顶过滤器过滤调节介质。
- 为了进行质控和RSPO1定量，将产生的培养基加入293T细胞系（293T WntR，7xTcf-eGFP）14中，用携带Wnt报告基因18的GFP质粒稳定转导。
注意：根据GFP信号的数量和强度，通过Wnt报告细胞系的定量来测试RSPO1作为Wnt通路激动剂的活性。 - 将15mL的等分试样保持在4°C下立即使用（1周内）。 对于更长的储存时间（6个月），将调节培养基保持在-20°C。
- 每周新鲜制备一次2D和3D培养基，并将其储存在4°C。
2. 卵巢癌类器官培养的开始
- 原代组织分离
- 最好在手术后立即运输新鲜和活的组织，并在收集后最多20小时内进行隔离。使用配备冷袋的运输箱在大约4°C下确保组织收集介质中的适当运输条件。
- 在实验室中，准备必要的试剂和设备，以便及时处理样品：
- 在冰上解冻基底膜提取物II型基质（BME 2基质）（约2小时）。
- 准备一次性手术刀、灭菌解剖工具（剪刀和镊子）和 400 μm 大小的过滤器插入物，用于 50 mL 试管。
- 准备一个装有少量液氮的容器进行快速冷冻，并在37°C下进行预热水浴。
注意：在细胞培养层流罩内工作。
- 在培养皿中用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（不含Ca++和 Mg++）彻底洗涤新鲜组织。在培养皿内，使用一次性手术刀和/或剪刀将组织切成 3-5 毫米大小的小块。
- 将获得的组织分为三个部分，用于以下目的：
- 在低温管中收集组织。将低温管转移到装满液氮的准备好的容器中进行冲击冷冻。
- 将组织（2-3mm）收集到装有福尔马林的组织学标本容器中进行固定（24小时），并将其嵌入石蜡中以进行染色19,20。
- 此外，在酶消化之前使组织均质化。用手术刀最大限度地进行机械解离，并将其转移到 50 mL 组织管中。
注意： 确保在均质化过程中始终将组织浸泡在 PBS 中，以避免组织变干。
- 将匀浆组织与含有PBS（不含Ca++和 Mg++），胶原酶I（储备溶液5U / μL，终浓度1U / μL）和选择性ROCK1和2抑制剂（3μM终浓度）的消化混合物（ 表1中列出的组分）混合。在 50 mL 管中使用 15 mL 消化混合物，用于每 2 cm3 的肿瘤。
注意：有限的材料（例如活检样品）只需要少量（约 2-3 mL）消化混合物即可确保酶解离。 - 对于酶解离，将管在37°C的水浴中孵育1.5小时。 进行零星和剧烈的涡旋（大约每 20 分钟一次，持续 10-15 秒）以支持机械解离。
- 孵育后，向试管中加入 15 mL 冷基础培养基 ++。在300× g下离心5分钟。
- 除去上清液后，加入 5 mL 新的基础培养基++。使用 400 μm 过滤器将细胞悬液过滤到新鲜的 50 mL 管中。
- 在300× g下离心5分钟。除去上清液并保留细胞沉淀。
- 为了去除红细胞，向细胞沉淀中加入 5 mL 红细胞裂解 （RBC） 缓冲液。在37°C的水浴中孵育5分钟。
- 加入 5 mL 基础培养基++ 用于裂解灭活。在300× g下离心5分钟。向细胞沉淀中加入 3 mL 基础培养基++。
- 用台盼蓝染色溶液（例如，10 μL 样品 + 10 μL 台盼蓝染色溶液）在自动细胞计数器中或在 Neubauer 室中手动稀释后，对活细胞进行计数。
- 计算直接 3D 接种所需的细胞数量。对于每个肿瘤沉积物，将每个卵巢癌培养基至少 2-3 孔接种到 48 孔格式的培养皿中，这相当于接种基质中总共 8-12 个孔（OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß）。在 25 μL BME 2 型基质的液滴中计算每个孔的 30,000 个细胞。或者，选择含有 50 μL BME 2 基质和每孔 50,000 个接种细胞的 24 孔规格。
- 在2D中播种剩余的细胞（参见步骤2.1.13）。
- 将含有所需细胞总数的基础培养基++悬浮液的量移液到新管中，并以300× g离心5分钟。除去上清液并保留细胞沉淀。
- 在冰上，将冷 BME 2 基质的总量（48 孔板中每个孔 25 μL;因此 4 孔 100 μL）添加到沉淀中并充分混合，通过轻轻上下移液沉淀来实现每个孔的细胞均匀分布不产生气泡。
- 将细胞接种在 BME 2 基质 （25 μL） 的液滴中，接种到预热的空 48 孔板中。为了实现孔之间的均匀分布，在将BME 2基质液滴转移到每个孔中之前，在管内轻轻缓慢地上下移动移液器（3-4x），以防止分布过程中细胞沉淀。
- 在37°C孵育板至少30分钟以巩固BME 2基质的液滴后，将四种卵巢癌培养基（OCM1，OCM1 + HER1ß，OCM2，OCM 2 + HER1ß）中的每一种250μL移液到相应的孔中。
- 在直接 3D 接种程序的同时，通过开始 2D 培养来保留剩余的分离细胞。
- 在300× g离心5分钟后，将沉淀加入2D培养基中。选择格式（T75 培养瓶或 T25 培养瓶），具体取决于 3D 接种后可用的细胞数量。
- 将烧瓶在37°C孵育3-5天以进行细胞粘附。在前72小时内保持相同的培养基。
- 当细胞达到汇合时，将培养物转移到 BME 2 基质中。不要通过分裂来扩增 2D 培养物中的原代分离株，因为在 2D 上长期繁殖不利于干性潜力。
- 从 2D 培养到 3D 培养的转移
- 在 T75 或 T25 烧瓶中，用 5 mL PBS 洗涤单层 2 次，以将细胞从底表面分离。在37°C下与1mL胰蛋白酶孵育10分钟。
- 加入 5 mL 冷基础培养基++ 以灭活解离试剂。在300× g下离心5分钟。
- 向沉淀中加入 3 mL 基础培养基 ++。按照步骤 2.1.12-2.1.13 中的说明对单元格进行计数。不同介质组合物的种子（见 图1），如步骤2.1.16-2.1.18中所述。
- 类器官生长的评估
- 每周至少对孔进行一次成像，以记录类器官的生长。通过相差显微镜制作高质量的 2D/3D 培养物和直接接种板的可比图像。注意放大倍率的一致性，并使用 4 倍来概述孔（定量），并使用 10 倍和 20 倍来记录类器官的形态。
- 将图片存储在专用于单个行的文件夹中。
- 通过比较评估不同接种方式（2D 后 3D 接种与直接 3D 接种）和不同培养基组成（OCM1、OCM1+ HER1ß、OCM2 和 OCM2+ HER1ß）的类器官形成，选择最佳的类器官系进行长期培养。
- 平均而言，在分离后 14-21 天，评估类器官形成潜力（数量）以及在不同条件下生长的类器官的大小和细胞表型。寻找以下特征：没有液泡、膜起泡或失去粘附，以及细胞四舍五入。
3.长期类器官培养
- 类器官传代
- 避免在增殖阶段过于频繁地分裂类器官。进行间隔超过 10 天的机械和酶消化程序。
- 要破坏每个 BME 2 基质液滴，加入 250 μL（48 孔形式）或 500 μL（24 孔形式）冰冷基础培养基++。确保液滴和移液管间歇性地上下完全溶解，并刮擦板底部。将细胞悬液转移到 15 mL 试管中并将其置于冰上。加入 1 mL 冰冷基础培养基++。
注：BME 2基质的去除效率很大程度上取决于介质温度，因为在4°C以下可实现最佳溶解。 - 池2-3技术重复井，均匀扩容。在300× g下离心5分钟。对光源检查悬浮液的内容物，看看BME 2凝胶是否仍然可见。除去上清液，如果BME 2基质仍然可见，则用冰冷培养基重复洗涤。
- 在37°C的水浴中与1mL胰蛋白酶（储存在20-25°C）一起孵育7-10分钟。零星涡旋 10 秒以增强解离。定期目视检查试管，看看解离是否在进行。
- 用注射器通过大小范围为23G至27G的针头上下拉动细胞悬浮液，检查是否仍然存在大细胞团块，并在必要时重复该过程。
注意：通过注射器碎裂是可选的，针头尺寸取决于所需的解离效果。均匀的细胞悬液导致孔之间的均匀分布。 - 加入 1 mL 冷基础培养基++ 以灭活反应。
- 可选：按照步骤 2.1.12-2.1.13 中的描述对细胞进行计数，并确定与亲本传代的分裂比例（例如，1：3 孔）。
- 在300× g下离心5分钟。除去上清液。
- 按照步骤2.1.16-2.1.18中所述进行接种，并根据已经建立的长期培养物应用相应的最佳卵巢癌类器官培养基。每 3-4 天更换一次卵巢癌培养基。
- 如果在培养基变化过程中 BME 2 基质液滴被破坏，请考虑在不进行酶消化的情况下重新接种。为避免液滴中断，请小心地进行介质更换程序，不要直接移液到BME 2基质液滴上。此外，在步骤2.1.16中使用BME 2基质稀释之前，避免在沉淀上留下过量的残留基础培养基++，因为它可能会影响液滴的脆弱性。
- 类器官的冷冻保存
注意：在传代后第一周内的增殖阶段对类器官进行冷冻保存。- 根据步骤 2.1.2，用冰冷的基础培养基++破坏BME 2基质液滴。如步骤3.1.3所述离心并弃去上清液后，在冰上工作并将细胞沉淀重悬于1mL冰冷的冻存培养基中。将细胞悬液转移到预先标记的1.8ml低温管中。
- 将试管储存在预冷的含有异丙醇的冷冻容器中，并将其置于-80°C过夜。
- 将储备管保持在-80°C最多2个月。转为液氮进行长期稳定储存。
- 类器官储备的解冻
- 在标记的 15 mL 试管中的 37 °C 水浴中预热 9 mL 基础培养基++。
- 将所需的储备瓶从-80°C的储存或液氮转移到充满液氮的运输容器中。
- 将冷冻管转移到37°C的水浴中，并轻轻搅拌，直到管壁附近的冷冻材料开始解冻。
- 将类器官悬浮液缓慢分布到装有 9 mL 培养基的标记管中。轻轻摇晃管子。在300× g 下离心5分钟，除去上清液。
- 按照步骤2.1.16-2.1.18中所述进行接种，并根据已经确定的单个品系的长期培养条件施用相应的最佳卵巢癌类器官培养基。
- 类器官的固定
- 按照步骤3.1.2-3.1.3中所述进行类器官收集。
- 加入 3 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS （pH 7.4） 溶液，并在室温下孵育 1 小时。
- 用 5 mL PBS 洗涤 2 次，以 300 × g 离心 3 分钟，并除去上清液。向沉淀中加入4mL新鲜PBS，并将其保持在4°C直至嵌入。
注意：固定类器官是稳定的，在嵌入前可以在4°C下储存1个月。 - 在65°C下加热组织学凝胶（储存在-20°C）直至液化。
- 检测固定的类器官沉降并在管底部可见。除去上清液。如果细胞沉淀被破坏，则在300× g 下离心3分钟，并弃去上清液PBS。
- 通过轻轻上下移液，将沉淀悬浮在 100 μL 温凝胶中。将液滴转移到一块密封膜上，并在室温下~15分钟后凝固。
- 将固定凝胶液滴移至组织石蜡盒中。进行标准组织包埋方案19,20。
- 用微切片切割工具切割 5-10 μm 厚的切片。将切口转移到组织学载玻片上。将载玻片在65°C下干燥1小时;将它们放在干燥的地方。
- 类器官切片的免疫荧光染色
- 使用以下稀释系列将制备的载玻片移过玻璃托盘：2×15分钟用于组织学的透明剂;15分钟100%乙醇;1分钟100%乙醇;10分钟96%乙醇;5分钟70%乙醇;5分钟50%乙醇。
- 加入 PBS 并以 100 rpm 的速度在振动台上保持 5 分钟。重复洗涤 2 次。
- 将抗原修复溶液（三（羟甲基）氨基甲烷 - 乙二胺四乙酸（EDTA）-缓冲液[pH 9.0]或柠檬酸盐[pH 6.0]）添加到放置在热稳定室中的载玻片中。在蒸锅中，将装有载玻片的容器保持 30 分钟，然后冷却至室温。
- 重复步骤 3.5.2。
- 将含有载玻片的腔室转移到1%透化洗涤剂溶液（PBS中）中15分钟。
- 重复步骤 3.5.2。
- 在以下步骤中，用免疫染色蜡笔勾勒出载玻片上类器官的位置，以保持液滴。
- 在每张载玻片上加入 100 μL 10% 血清稀释培养基，具体取决于二抗的种类。
- 重复步骤 3.5.2。
- 在培养基中稀释一抗，最终体积为 100 μL。 在培养盘/湿室中保持在4°C至少16小时。
- 重复步骤 3.5.2。
- 在培养基中稀释二抗，产生 100 μL 液滴，并在室温下在培养盘中保存 2 小时。
- 重复步骤 3.5.2。
- 加入核复染液DAPI（4'，6-二脒-2-苯吲哚，二盐酸盐）在稀释介质中1：1,000稀释。在室温下保存10分钟进行孵育。
- 重复步骤 3.5.2。
- 添加安装介质并用盖玻片盖住。干燥后（大约8-12小时后），用透明指甲油固定载玻片。
- 使用共聚焦显微镜或其他荧光显微镜拍摄图像。制作概述图片以及亚细胞结构的详细图像，以捕捉类器官形态的主要特征。
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Representative Results
在初始组织解离、过滤和计数后，如上所述，直接以 3D 形式平行接种细胞，并在烧瓶中悬浮液进行短暂的 2D 扩增。在某些情况下，瞬时 2D 扩增对类器官形成产生积极影响，并且通过该途径成功建立了长期品系，而相对平行的 3D 接种可导致生长停滞（图 1）。对于处理的每个供体组织，根据培养基基质测试细胞。按照这一策略，我们的生物样本库现在包含代表每种标准生长条件的品系，如 图2所示。通过严格实施这个测试不同培养基和接种模式的小型筛选平台，我们成功地从原发性高级别浆液性、新辅助间期手术和复发性疾病的卵巢癌（图3）的不同组织学类型和疾病发展阶段生成类器官系。与亲本组织相比，通过主要标志物的免疫荧光染色对类器官系进行表型表征令人信服地表明，类器官模型中保留了上皮肿瘤区室的标志：上皮结构和粘附以 （EpCAM）、谱系同一性 （PAX8） 和 HGSOC 的典型 TP53 点突变特征，导致细胞核中积累（图 4）。
在类器官生物样本库期间，为了做出有效的决策，还需要考虑一些重要的方法学要点。类器官的生长潜力不仅取决于类器官直径的增加。此外，表型特征决定了扩展潜力，例如颜色、暗度和轮廓完整性。细胞质应激液泡的形成表明条件欠佳。由于运输条件不合适和组织进程延迟，可能会出现有关生长和类器官形成潜力的初始问题。由于在肿瘤系中观察到扩增电位的个体间变异性很高，我们建议至少等待 14 天，然后再对生长电位做出最终决定。如果最初在不同的培养基中观察到相似的生长模式，则应扩展多种条件。根据我们的经验，通常只有在种植数周或数月后才能明确区分长期稳定的生长潜力。
图 1：在 2D 中对原代分离株进行短暂接种对后续类器官生成的好处。 （A） 实验布局方案，显示双向、平行接种策略：2D/3D，以及四种不同培养基中的直接 3D 接种。（B） 胰蛋白酶消化和 3D 转移前的贴壁初级分离株的图像。（C） 原生矿床的一个例子，其中平行播种揭示了 2D/3D 路线的明显优势，因为只有从最初在塑料上分离的祖细胞中才能进行长期类器官扩增。左上图显示了分离后 7 天第 0 代（称为 P0）的 3D 培养物，左下角图片中第一次传代（称为 P1）后类器官形成不足。在塑料上进行2D接种（参见 图1B）然后转移到3D培养物后，在P0处已经明显形成更好的类器官，而在传代4（P4）处确认了长期扩增潜力。比例尺 = 200 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：患者特定的培养基要求。 四个不同的长期稳定扩展系的例子，每个系都在不同的培养基中生长。比例尺 = 500 μm。缩写：OCM = 卵巢癌培养基;她 = heregulin 1β;HGSO = 高级别浆液性卵巢癌。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：疾病各个阶段的类器官生成。 长期稳定扩张线的图像，来自原发疾病表现中的高级别浆液性和低级别浆液性卵巢癌，间隔手术（新辅助化疗后）和复发性癌症组织。比例尺 = 500 μm。缩写：HGSOC = 高级别浆液性卵巢癌;LGSOC = 低级别浆液性卵巢癌;NACT = 新辅助化疗。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：类器官和亲本癌症组织的表型紧密匹配。 （A）癌组织和（B）配对类器官系的免疫荧光染色的共聚焦图像显示，所有标记物EpCAM（绿色）、PAX8（红色）、TP53（品红色）的染色模式和表达水平非常相似。比例尺 = 20 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1：本方案中使用的培养基和消解混合物的组成。请按此下载此表格。
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Discussion
所设计的方案解决了卵巢癌类器官生物样本库在类器官形成和长期传代潜力方面的先前挑战，并确保从大多数实体瘤沉积物中产生完全可扩展的细胞系。用于类器官生成的肿瘤样本的手术采集过程显着影响产量和扩增潜力。肿瘤组织样本可以在各种手术中获得，包括多脏器手术、诊断性腹腔镜检查或活检。有经验的妇科肿瘤外科医生应优先从腹膜位置获取干净的肿瘤样本。值得注意的是，已经观察到大肿瘤沉积物内的宏观坏死区域不太适合成功产生类器官培养物。由于样品纯度对于反映下游应用的分子和表型特征至关重要，因此需要临床和实验室团队的同步努力才能实现最佳生物样本库，确保从肿瘤最相关的区域创建细胞系。
虽然该方案涵盖了我们在 2 年的生物样本库中观察到的生长因子依赖性的变化，但很明显，需要进一步改进以进一步提高疗效，因为我们仍然没有观察到任何类器官生长在 20% 的病例中，并且表现出有限扩增潜力的品系数量表明干性的维持欠佳。尽管我们的类器官生物样本库目前仅包括浆液性组织学（HGSOC 和 LGSOC）的卵巢癌样本，但在结构化生物样本库计划之前，我们对来自不同上皮性卵巢癌组织学样本的经验显示出相当的成功率，没有特定差异。值得注意的是，大多数上皮性卵巢癌亚型与从苗勒管（输卵管、子宫、子宫颈）发育而来的组织具有相似的柱状假分层形态，而相比之下，卵巢上皮本身发育起源于生殖器嵴和中肾，覆盖着单层立方体上皮。由于调节上皮稳态的发育途径在控制成体干细胞潜力方面起着核心作用，因此在开发类器官生物库方案时应考虑胚胎起源的差异。因此，我们认为来自卵巢表面的祖细胞可能需要器官特异性培养条件来维持长期稳定的生长。
值得注意的是，在我们的实验室中，尽管新辅助化疗会影响细胞活力和组织表型，但该方案已被证明对新辅助卵巢癌样本也是成功的。与来自初次减瘤手术的初次化疗组织的样品相比，这些样品表现出更多的碎片和细胞外组织聚集体，这可能会影响类器官形成的潜力。在这些情况下，我们经验到适量的手术组织和严格遵守推荐的运输条件对于成功生成类器官至关重要，因为新辅助后样本可能更敏感。
一个非常有趣的现象是，在新鲜分离的祖细胞的2D中对塑料的短暂扩增对后续类器官生长的有益影响，我们已经反复观察到并因此包含在标准化的实验程序中，这是对癌症类器官研究领域方法的重要补充，这在很大程度上依赖于直接播种策略。人们很容易推测，酶消化后祖细胞的敏感性和生长因子充分启动它们的能力可能是这种差异背后的潜在机制，在某些情况下，如果可以建立该系，这是一个决定性因素。然而，需要更多的研究来建立明确的依赖关系。
为了应对难以消化的 3D 卵巢癌类器官中高细胞粘附和功能连接带来的挑战，当胰蛋白酶消化后残留大团块时，使用针头和注射器进行机械和酶解离的组合可能会有所帮助。尝试不同的酶促条件可以带来进一步的改进。
长期储存后，可以根据实验设计解冻并带入培养物中，用于后续应用。这使得可以随时访问已经生成的类器官系用于特定的研究目的，并且对于根据患者的疾病进展研究某些系的长期行为特别有趣。然而，卵巢癌类器官的冷冻保存仍然是一个挑战。冻融循环期间的温度变化会对类器官的活力、功能和扩增潜力产生负面影响。在液氮中长期储存更稳定，在液氮中，非常低的温度将降解的风险降至最低，从而可以保持类器官的完整性。但是，需要持续优化，以建立一致的冷冻、储存和解冻程序，以进一步改进这些过程。
尽管存在上述悬而未决的问题，但该协议证明了从卵巢癌患者的实体瘤样本中持续产生稳定类器官系的能力。在我们的实验室中，我们处理了迄今为止的 120 份原发性卵巢癌组织样本，在大约 50% 的病例中取得了成功，包括广泛的组织学亚型和疾病分期，包括原发性减瘤、复发性疾病和新辅助手术标本。通过为生成来自各种患者样本的类器官、不同培养基中的平行接种以及不同接种策略的实施提供结构化框架，该协议提供了评估干性潜力的个体差异的机会，从而提供了有关肿瘤生物学的额外信息。据我们所知，绝大多数研究通常采用相反的方法，即在少量样品上测试培养基成分，并为简单起见选择一种最佳培养基。我们对 HER1ß 的效果、补充 RSPO1 和 FGF10 的效果以及 2D/3D 接种的系统测试最终证明，卵巢癌组织在干性特性方面具有一定程度的患者间变异性，并且最佳培养基确实是患者特异性的。因此，对提供不同外源性旁分泌信号转导环境的不同培养基成分进行系统的并行测试至关重要。
建立一个活体生物库，其中包含来自各种卵巢癌患者的大量类器官，以及他们前瞻性收集的临床信息，可作为广泛研究应用的宝贵资源，并反映出可能适用于更大患者群体的异质性临床景观17.长期培养和冷冻保存可实现实验一致性，并随着时间的推移重复获得相同的类器官系，作为具有未改变肿瘤系细胞特性的纵向实验设计的基础。
通过保留上皮结构和极化，类器官系是研究旁分泌信号通路介导的细胞间通讯和上下文依赖性细胞命运决策的适当模型。将类器官包埋在组织学凝胶中是一个实用且有效的中间步骤，可以避免固定后材料的损失，并确保下游处理（包埋在石蜡中和切片）可以与组织样本并行进行。当类器官的数量非常有限时，固定过程中类器官的丢失是一个关键问题。然而，这种损失可以通过在冷的基础培养基中洗涤并在固定前将至少两个 24 孔规格板的成熟孔从细胞外基质中彻底去除来抵消。免疫荧光染色方案允许高分辨率共聚焦成像，以将卵巢癌类器官的分子和表型特征与亲本肿瘤组织相对应，同时也是研究细胞对化合物的反应或转基因细胞系表征的宝贵工具。该方法也适用于组织学染色，无需任何特定修饰。根据研究的目的，应考虑用切片机（2-3μm）切割较薄的切片。
重要的是，稳定的长期培养是基因编辑实验和药物反应以及对新型和标准疗法耐药性的功能测定的先决条件17,21。特别是，在疾病进展和复发期间进行的再活检产生的类器官，为在未治疗的原始肿瘤和复发期间观察到的新获得的特征之间进行直接比较分析提供了可能性。患者特异性治疗反应的识别和体外治疗耐药性的形成推动了卵巢癌研究中精准医学领域的发展21.
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Disclosures
M.K.被列为与卵巢癌类器官培养基相关的专利的发明人。F.T.获得了阿斯利康、克洛维斯、卫材、ImmunoGen、Medac、默沙东、PharmaMar、罗氏、SAGA diagnostics和Tesaro/GSK的研究经费、顾问委员会、酬金和差旅费。S.M.获得了研究经费、顾问委员会、荣誉或差旅费：艾伯维、阿斯利康、克洛维斯、卫材、葛兰素史克、Hubro、Medac、默沙东、诺华、尼科德、奥林巴斯、PharmaMar、辉瑞、罗氏、Sensor Kinesis、Teva、Tesaro。
Acknowledgments
该研究由德国癌症研究中心 DKTK 资助，合作伙伴网站慕尼黑，DKFZ 和慕尼黑大学医院 LMU 之间的合作伙伴关系。该研究还得到了德国癌症援助基金（#70113426和#70113433）的支持。组织和类器官的石蜡包埋已在慕尼黑慕尼黑大学医学院解剖学研究所的核心设施中进行。共聚焦成像已在生物医学中心 （BMC） 的核心设施生物成像中进行。作者要感谢 Simone Hofmann、Maria Fischer、Cornelia Herbst、Sabine Fink 和 Martina Rahmeh 提供的技术帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
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