Summary
Este protocolo ofrece un marco sistemático para el establecimiento de organoides de cáncer de ovario de diferentes estadios de la enfermedad y aborda los desafíos de la variabilidad específica del paciente para aumentar el rendimiento y permitir una expansión robusta a largo plazo para aplicaciones posteriores. Incluye pasos detallados para el procesamiento de tejidos, la siembra, el ajuste de los requisitos de medios y la tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
Si bien el establecimiento de un biobanco de cáncer de ovario a partir de organoides derivados de pacientes junto con su información de antecedentes clínicos promete avances en la investigación y la atención al paciente, la estandarización sigue siendo un desafío debido a la heterogeneidad de esta neoplasia maligna letal, combinada con la complejidad inherente de la tecnología de organoides. Este protocolo adaptable proporciona un marco sistemático para aprovechar todo el potencial de los organoides del cáncer de ovario teniendo en cuenta la variabilidad de los progenitores específica de cada paciente. Mediante la implementación de un flujo de trabajo experimental estructurado para seleccionar las condiciones óptimas de cultivo y los métodos de siembra, con pruebas paralelas de siembra directa en 3D frente a una ruta 2D/3D, obtenemos, en la mayoría de los casos, líneas de expansión robustas a largo plazo adecuadas para una amplia gama de aplicaciones posteriores.
En particular, el protocolo ha sido probado y ha demostrado su eficacia en un gran número de casos (N = 120) de material de partida muy heterogéneo, incluido el cáncer de ovario de alto y bajo grado y los estadios de la enfermedad con citorreducción primaria, enfermedad recurrente y muestras quirúrgicas posneoadyuvantes. Dentro de un entorno de señalización exógena de bajo Wnt y alto BMP, observamos que los progenitores son susceptibles de manera diferente a la activación de la vía de la heregulina 1 ß (HERß-1), con HERß-1 promoviendo la formación de organoides en algunos mientras que la inhibe en otros. Para un subconjunto de las muestras del paciente, la formación óptima de organoides y el crecimiento a largo plazo requieren la adición del factor de crecimiento de fibroblastos 10 y R-Espondina 1 al medio.
Además, destacamos los pasos críticos de la digestión de los tejidos y el aislamiento de los progenitores y señalamos ejemplos en los que el cultivo breve en 2D sobre plástico es beneficioso para la posterior formación de organoides en la matriz del extracto de membrana basal tipo 2. En general, un biobanco óptimo requiere pruebas sistemáticas de todas las condiciones principales en paralelo para identificar un entorno de crecimiento adecuado para las líneas individuales. El protocolo también describe el procedimiento de manipulación para la inclusión, el corte y la tinción eficientes para obtener imágenes de alta resolución de los organoides, que se requiere para un fenotipado completo.
Introduction
El manejo clínico de las pacientes con cáncer epitelial de ovario sigue siendo un reto debido a su presentación clínica heterogénea en estadios avanzados y a las altas tasas de recurrencia1. Mejorar nuestra comprensión del desarrollo del cáncer de ovario y el comportamiento biológico requiere enfoques de investigación que aborden la variabilidad específica de la paciente durante el curso de la enfermedad, la respuesta al tratamientoy las características histopatológicas y moleculares.
El biobanco, caracterizado por la recolección sistemática y la preservación a largo plazo de muestras tumorales derivadas de pacientes con cáncer de ovario junto con su información clínica, ofrece la preservación de una gran cohorte de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, incluidas muestras tumorales de cirugías citorreductoras primarias, después de quimioterapia neoadyuvante y de enfermedad recurrente. Tiene un valioso potencial para avanzar en la investigación del cáncer, sirviendo como un recurso de biomarcadores pronósticos prometedores y dianas terapéuticas3. Sin embargo, los métodos convencionales de biobancos, como la fijación y congelación de formol, no son susceptibles de realizar estudios funcionales en las muestras tumorales originales debido a la pérdida de viabilidad y a la alteración de la arquitectura tridimensional del tejido nativo 4,5.
Los estudios de los mecanismos moleculares, en oncología y fuera de ella, dependen fundamentalmente del uso de modelos experimentales apropiados que reflejen fielmente la biología de la enfermedad y mantengan las propiedades in vitro del tejido observado in vivo. Los organoides derivados del paciente, basados en la preservación del potencial de renovación, reproducen en el laboratorio la estructura y función originales del epitelio y permiten realizar pruebas en un contexto específico del paciente. Por lo tanto, se han convertido en herramientas muy prometedoras para la investigación del cáncer y la medicina personalizada, cerrando la brecha entre la diversidad clínica y la investigación de laboratorio 6,7,8,9. Las estrategias terapéuticas personalizadas, basadas en las respuestas farmacológicas individuales de las líneas de organoides y en las pruebas de la relevancia funcional de los perfiles moleculares, pueden aplicarse directamente a la atención del paciente10,11. La posibilidad de cultivo a largo plazo, incluyendo las características específicas del paciente y la recopilación de datos clínicos prospectivos relevantes a lo largo del tiempo, es muy prometedora para identificar nuevos factores pronósticos y predictivos implicados en la progresión de la enfermedad y los mecanismos de resistencia 3,9.
Sin embargo, la construcción de un biobanco que incluya organoides de diferentes muestras tumorales requiere una combinación de cumplimiento estricto de una metodología compleja y el establecimiento de protocolos para facilitar su mantenimiento12. La estandarización de los procesos garantiza que el biobanco pueda ser establecido y mantenido de manera eficiente por personal capacitado, incluso con una alta rotación, al mismo tiempo que se adhiere a los más altos estándares de calidad13. Varios estudios informaron la generación exitosa de líneas organoides estables de cáncer de ovario correspondientes al perfil mutacional y fenotípico del tumor original con tasas de eficiencia variables. Aun así, los biobancos rutinarios siguen siendo un reto en la práctica, especialmente para el crecimiento estable a largo plazo de las líneas, que es un requisito previo para la expansión a gran escala o el éxito de la edición genómica.
En particular, la cuestión de la capacidad de expansión sigue estando vagamente definida en el campo, ya que los organoides que muestran un potencial de crecimiento lento y limitado se cuentan ocasionalmente como líneas establecidas. Como demostraron inicialmente Hoffmann et al., un estudio cuyos principales hallazgos proporcionaron la base para este protocolo más desarrollado, el manejo óptimo del tejido de cáncer de ovario requiere una estrategia única para acomodar la heterogeneidad14. La caracterización fenotípica de los organoides obtenidos por este método y la estrecha similitud con el tejido tumoral parental se confirmaron mediante secuenciación de ADN de panel y análisis transcriptómico de cultivos maduros (4-10 meses de cultivo), demostrando la estabilidad del modelo 8,9,12,14.
En contraste con el ambiente paracrino que regula la homeostasis en las trompas de Falopio sanas, la capa epitelial, que probablemente produce cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC), el potencial de regeneración del cáncer y la capacidad de formación de organoides, depende menos de la suplementación exógena con Wnt. Además, la señalización activa de la Proteína Morfogenética Ósea (BMP), caracterizada por la ausencia de Noggin en medio organoide, demostró ser beneficiosa para el establecimiento de cultivos a largo plazo a partir de depósitos de tejido sólido de cáncer de ovario14,15. Durante el biobanco sistemático de depósitos sólidos de cáncer de ovario, hemos confirmado estos hallazgos y hemos establecido la canalización, con detalles descritos en este protocolo que garantiza una expansión sostenida a largo plazo en la mayoría de los casos. Encontramos que las pruebas paralelas de diferentes composiciones de medios y modalidades de siembra cuando se trabaja con aislados primarios son esenciales para mejorar el establecimiento de líneas de organoides estables a largo plazo y para aumentar los rendimientos, lo que permite una propagación robusta y la expansión a formatos de pocillos múltiples requeridos para experimentos posteriores16.
Además, la pureza y la calidad de las muestras recogidas durante la cirugía son de crucial importancia para el potencial traslacional de los organoides del cáncer de ovario en la investigación básica y el diagnóstico molecular. La complejidad de la presentación clínica del HGSOC requiere una estrecha cooperación entre los cirujanos, oncólogos y los científicos del laboratorio para garantizar que el material relevante se identifique correctamente, que las condiciones de transporte se mantengan constantes y que se generen líneas de organoides con alta eficiencia que representen las características más importantes de la enfermedad de cada paciente. Este protocolo proporciona un marco estandarizado pero adaptable para capturar todo el potencial de los organoides del cáncer de ovario, considerando la heterogeneidad que caracteriza al cáncer de ovario16,17. En particular, este protocolo permite un biobanco confiable del amplio espectro de presentación clínica del cáncer de ovario, incluidos diferentes tipos histológicos (cáncer de ovario de alto y bajo grado, LGSOC), diferentes depósitos de las mismas pacientes que presentan diferencias en la regulación de la madre, tejidos de cirugías en un entorno posneoadyuvante, material de biopsia y muestras de cirugías en la fase recurrente de la progresión de la enfermedad.
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Protocol
Se recolectaron muestras de tejido tumoral de cirugías de cáncer de ovario y se generaron organoides derivados de pacientes de acuerdo con el Comité de Ética de la Universidad LMU (17-471), adhiriéndose a las regulaciones vigentes aplicables de la UE, nacionales y locales. Cada paciente que participa en el estudio ha dado su consentimiento por escrito. Cuando se trabaja con muestras de tejido fresco, se requiere un permiso de seguridad de nivel 2 de bioseguridad y cabinas de flujo laminar. Dada la naturaleza potencialmente infecciosa de las muestras de tejido, que no puede descartarse debido a la falta de pruebas rutinarias de enfermedades infecciosas relevantes, es necesario garantizar que se cumplan estrictamente las normas institucionales de bioseguridad y que se disponga de equipos de protección personal adecuados para el personal que realiza los experimentos.
1. Preparativos
- Preparación media
- Prepare los soportes 2D y 3D una vez por semana y guárdelos a 4 °C.
NOTA: La composición exacta de los ingredientes para cada medio se enumera en la Tabla 1. Tanto el medio de cáncer de ovario 1 (OCM1) como el OCM2 pueden complementarse adicionalmente con HER1ß (concentración final: 50 ng/mL), lo que da lugar a cuatro condiciones diferentes: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß. - Cree soluciones madre de los reactivos del factor de crecimiento y manténgalas a 20 °C y de A83-01 y nicotinamida (almacenamiento a +4 °C). Debido a la sensibilidad a la temperatura de los factores de crecimiento, utilice inmediatamente las soluciones madre descongeladas para la preparación del medio y evite los ciclos repetidos de descongelación mediante la creación de alícuotas.
NOTA: La preparación de los medios es un paso crítico que debe controlarse estrictamente. - Preparación del medio acondicionado RSPO-1
- Descongele rápidamente las células T HA-R-Spondin1-Fc 293 (almacenamiento a -80 °C) a 37 °C. Lavarlos con 10 ml de medio de cultivo basal, suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS), en adelante denominado medio de cultivo basal++.
- Resuspender el gránulo celular en 12 mL de medio de cultivo basal++ y sembrarlo en un matraz T75.
- Dividir las células en una proporción de 1:6 con un reactivo de disociación que contenga tripsina (4 min a 37 °C) cuando las células alcancen la confluencia. Siembre en un nuevo matraz T75.
- Al día siguiente, añadir fleomicina D1 (1,25 μL/mL) al medio.
- Dividir las células en una proporción de 1:20 con tripsina (4 min a 37 °C) cuando las células alcancen la confluencia. Siembre las células en múltiples matraces T75 (número de matraces según el volumen final deseado) en 30 ml de medio de cultivo basal++ (que contenga un 10 % de FCS) suplementado con fleomicina D1.
- Iniciar la producción de medios acondicionados cuando las células alcancen aproximadamente el 50% de confluencia: sustituir el medio por 40 mL de medio de cultivo basal suplementado con FCS al 5% sin fleomicina D1.
- Recoja el primer sobrenadante después de 3 días. Para eliminar los residuos, centrifugar durante 10 min a 1.200 × g. Conservar el sobrenadante en un recipiente estéril a 4 °C.
- Añadir nuevo medio de cultivo basal suplementado con FCS al 5% a las células. Recoja el segundo sobrenadante después de 3-4 días. Centrifugar durante 10 min a 1.200 × g. Agregue el segundo sobrenadante al primer sobrenadante.
- Cuele el medio acondicionado utilizando un filtro de tapa de botella de 0,2 μm.
- Para el control de calidad y la cuantificación de RSPO1, agregue el medio producido a una línea celular 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, transducida de manera estable con el plásmido GFP portador del reportero Wnt18.
NOTA: Dependiendo de la cantidad e intensidad de la señal GFP, la actividad de RSPO1 como agonista de la vía Wnt se prueba mediante la cuantificación de la línea celular reportera Wnt. - Mantener alícuotas de 15 ml para su uso inmediato (en el plazo de 1 semana) a 4 °C. Para un almacenamiento más prolongado (6 meses), mantenga el medio acondicionado a -20 °C.
- Prepare los soportes 2D y 3D una vez por semana y guárdelos a 4 °C.
2. Inicio de un cultivo de organoides de cáncer de ovario
- Aislamiento tisular primario
- Transportar tejido fresco y viable, preferiblemente inmediatamente después de la cirugía y realizar el aislamiento en un plazo máximo de 20 h después de la recolección. Asegure las condiciones de transporte adecuadas en el medio de recogida de tejidos con una caja de transporte equipada con compresas frías a aproximadamente 4 °C.
- En el laboratorio, prepare los reactivos y el equipo necesarios para facilitar el procesamiento oportuno de las muestras:
- Descongelar la matriz del extracto de membrana basal tipo II (matriz BME 2) en hielo (aproximadamente 2 h).
- Prepare bisturíes desechables, herramientas de disección esterilizadas (tijeras y pinzas) e insertos filtrantes de 400 μm para tubos de 50 ml.
- Prepare un recipiente con una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para la congelación instantánea y un baño de agua precalentado a 37 °C.
NOTA: Trabaje dentro de una campana de flujo laminar de cultivo celular.
- Lave bien el pañuelo fresco en una placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (sin Ca++ y Mg++). Dentro de la placa de Petri, fragmente el tejido con los bisturíes y/o tijeras desechables en trozos pequeños de 3-5 mm de tamaño.
- Separar el tejido obtenido en tres secciones para los siguientes propósitos:
- Recolectar tejido en tubos criogénicos. Transfiera los tubos criogénicos al recipiente preparado lleno de nitrógeno líquido para la congelación de choque.
- Recoger tejido (2-3 mm) en un recipiente de muestras histológicas lleno de formol para su fijación (24 h) e incrustarlo en parafina con fines de tinción19,20.
- Además, homogeneizar el tejido antes de la digestión enzimática. Maximice la disociación mecánica con un bisturí y transfiérala a un tubo de tejido de 50 ml.
NOTA: Asegúrese de que el tejido esté siempre empapado en PBS durante la homogeneización para evitar que se seque el tejido.
- Combine el tejido homogeneizado con una mezcla de digestión que contenga PBS (sin Ca++ y Mg++), colagenasa I (solución madre 5 U/μL, concentración final 1 U/μL) y un inhibidor selectivo de ROCK1 y 2 (concentración final de 3 μM) (componentes enumerados en la Tabla 1). Use 15 ml de mezcla para digestión en un tubo de 50 ml por cada 2cm3 del tumor.
NOTA: El material limitado (por ejemplo, muestras de biopsia) requiere solo pequeñas cantidades (aproximadamente 2-3 ml) de mezcla de digestión para garantizar la disociación enzimática. - Para la disociación enzimática, incubar el tubo durante 1,5 h en un baño de agua a 37 °C. Realizar vórtices esporádicos y vigorosos (aproximadamente cada 20 minutos durante 10-15 s) para apoyar la disociación mecánica.
- Después de la incubación, agregue 15 ml de medio de cultivo basal frío++ al tubo. Centrifugar 5 min a 300 × g.
- Después de retirar el sobrenadante, añadir 5 mL de nuevo medio de cultivo basal++. Cuele la suspensión celular utilizando un filtro de 400 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
- Centrifugar durante 5 min a 300 × g. Retire el sobrenadante y conserve el gránulo de la célula.
- Para la eliminación de eritrocitos, agregue 5 ml de tampón de lisado de glóbulos rojos (RBC) al gránulo celular. Incubar en baño maría durante 5 min a 37 °C.
- Añadir 5 mL de medio de cultivo basal++ para la inactivación de la lisis. Centrifugar durante 5 min a 300 × g. Añadir 3 mL de medio de cultivo basal++ al gránulo celular.
- Cuente las células viables después de la dilución 1:1 con una solución de tinción de azul de tripano (p. ej., 10 μL de la muestra + 10 μL de solución de tinción de azul de tripano) en un contador de células automático o manualmente en una cámara de Neubauer.
- Calcule el número de celdas necesarias para la siembra 3D directa. Para cada depósito tumoral, siembre en una placa de formato de 48 pocillos al menos 2-3 pocillos por medio de cáncer de ovario, lo que corresponde a un total de 8-12 pocillos en una matriz de siembra (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Calcule 30.000 células para cada pocillo en una gota de 25 μL de matriz BME Tipo 2. Opcionalmente, elija un formato de 24 pocillos con 50 μL de matriz BME 2 y 50.000 células sembradas por pocillo.
- Siembre las celdas restantes en 2D (consulte el paso 2.1.13).
- Pipetear la cantidad de medio de cultivo basal++ suspensión que contiene el número total de células necesarias en un tubo nuevo y centrifugar durante 5 min a 300 × g. Retire el sobrenadante y conserve el gránulo de la célula.
- Sobre el hielo, añadir la cantidad total de matriz BME 2 fría (25 μL por cada pocillo en una placa de formato de 48 pocillos; por lo tanto, 100 μL por 4 pocillos) al pellet y mezclar bien para conseguir una distribución uniforme de las células por pocillo pipeteando suavemente el pellet hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas.
- Siembre las células en gotas de matriz BME 2 (25 μL) en la placa vacía de 48 pocillos precalentada. Para lograr una distribución uniforme entre los pocillos, mueva suave y lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo (3-4x) dentro del tubo antes de transferir la gota de matriz BME 2 a cada pocillo para evitar la precipitación celular durante la distribución.
- Después de incubar la placa a 37 °C durante al menos 30 min para consolidar las gotas de la matriz BME 2, pipetear 250 μL de cada uno de los cuatro medios de cáncer de ovario (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) en los pocillos correspondientes.
- En paralelo al procedimiento de siembra directa en 3D, conserve las células aisladas restantes iniciando un cultivo en 2D.
- Después de la centrifugación durante 5 minutos a 300 × g, agregue el gránulo al medio 2D. Seleccione el formato (matraz T75 o matraz T25), en función del número de celdas disponibles después de la siembra 3D.
- Incubar el matraz durante 3-5 días a 37 °C para la adhesión celular. Mantenga el mismo medio durante las primeras 72 h.
- Cuando las células alcancen la confluencia, transfiera el cultivo a la matriz BME 2. No expanda los aislados primarios en el cultivo 2D dividiéndolos, ya que la propagación a largo plazo en 2D es perjudicial para el potencial de tallo.
- Transferencia de la cultura 2D a la cultura 3D
- En el matraz T75 o T25, lavar la monocapa 2 veces con 5 ml de PBS para separar las células de la superficie inferior. Incubar con 1 mL de tripsina durante 10 min a 37 °C.
- Añadir 5 mL de medio de cultivo basal frío++ para la inactivación del reactivo de disociación. Centrifugar durante 5 min a 300 × g.
- Añadir 3 mL de medio de cultivo basal++ al pellet. Cuente las celdas como se describe en los pasos 2.1.12-2.1.13. Semilla para las diferentes composiciones de medios (ver Figura 1) como se describe en los pasos 2.1.16-2.1.18.
- Evaluación del crecimiento de organoides
- Tome imágenes de los pocillos al menos una vez por semana para documentar el crecimiento de los organoides. Obtenga imágenes comparables de alta calidad de cultivos 2D/3D y placas de siembra directa con un microscopio de contraste de fases. Cuide la consistencia en el aumento y use 4x para una descripción general de los pocillos (cuantificación) y 10x y 20x para documentar la morfología de los organoides.
- Organice el almacenamiento de imágenes en carpetas dedicadas a líneas individuales.
- Seleccionar la mejor línea de organoides para el cultivo a largo plazo mediante una evaluación comparativa de la formación de organoides en las diferentes modalidades de siembra (siembra 2D seguida de siembra 3D versus siembra 3D directa) y diferentes composiciones de medios (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 y OCM2+ HER1ß).
- En promedio, 14-21 días después del aislamiento, evalúe el potencial de formación de organoides (cantidad), así como el tamaño y el fenotipo celular de los organoides cultivados en diferentes condiciones. Busque las siguientes características: ausencia de vacuolas, formación de burbujas en la membrana o pérdida de adhesión y redondeo de las células.
3. Cultivo de organoides a largo plazo
- Pasaje de organoides
- Evite dividir los organoides con demasiada frecuencia y durante la fase proliferativa. Realizar procedimientos de digestión mecánica y enzimática con intervalos de más de 10 días.
- Para interrumpir cada gota de matriz BME 2, agregue 250 μL (formato de 48 pocillos) o 500 μL (formato de 24 pocillos) de medio de cultivo basal helado++. Asegúrese de que la gota y la pipeta se disuelvan por completo de forma intermitente hacia arriba y hacia abajo y raspe la parte inferior de la placa. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y colóquelo en hielo. Añadir 1 ml de medio de cultivo basal helado++.
NOTA: La eficiencia de eliminación de la matriz BME 2 depende en gran medida de la temperatura del medio, ya que la mejor disolución se logra por debajo de 4 °C. - Piscina 2-3 pozos técnicos replicados para una expansión uniforme. Centrifugar durante 5 min a 300 × g. Inspeccione el contenido de la suspensión contra la fuente de luz para ver si el gel BME 2 aún es visible. Retire el sobrenadante y repita el lavado con un medio helado si la matriz BME 2 aún es visible.
- Incubar con 1 mL de tripsina (almacenado a 20-25 °C) en un baño de agua a 37 °C durante 7-10 min. Vórtice esporádicamente durante 10 s para mejorar la disociación. Inspeccione el tubo periódicamente visualmente para ver si la disociación está progresando.
- Tire de la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo con una jeringa a través de una aguja con un tamaño que oscila entre 23 G y 27 G. Verifique si todavía hay grumos de células grandes y repita el procedimiento si es necesario.
NOTA: La fragmentación a través de una jeringa es opcional y el tamaño de la aguja depende de la eficacia de disociación requerida. Una suspensión celular homogénea conduce a una distribución uniforme entre los pocillos. - Añadir 1 mL de medio de cultivo basal frío++ para inactivar la reacción.
- OPCIONAL: Cuente las celdas como se describe en los pasos 2.1.12-2.1.13 y decida la relación de división con el pasaje parental (por ejemplo, pocillos 1:3).
- Centrifugar durante 5 min a 300 × g. Retire el sobrenadante.
- Realice la siembra como se describe en los pasos 2.1.16-2.1.18 y aplique el medio organoide óptimo para el cáncer de ovario respectivo de acuerdo con el cultivo a largo plazo ya establecido. Cambie el medio para el cáncer de ovario cada 3-4 días.
- En caso de ruptura de la gota de matriz BME 2 durante el cambio de medio, considere la resiembra sin digestión enzimática. Para evitar la interrupción de la gota, realice con cuidado el procedimiento de cambio de medio sin pipetear directamente sobre la gota de la matriz BME 2. Además, evite dejar una cantidad excesiva de medio de cultivo basal residual ++ en el gránulo antes de la dilución con la matriz BME 2 en el paso 2.1.16, ya que podría afectar la fragilidad de las gotas.
- Criopreservación de organoides
NOTA: Realizar la criopreservación de los organoides durante la fase de proliferación en la primera semana después del paso.- Interrumpir la gota de la matriz BME 2 con medio de cultivo basal helado++ de acuerdo con el paso 3.1.2. Después de centrifugar y desechar el sobrenadante como se describe en el paso 3.1.3., trabajar con hielo y resuspender el gránulo celular en 1 ml de medio de criopreservación helado. Transfiera la suspensión celular a tubos criogénicos de 1,8 ml premarcados.
- Guarde los tubos en un recipiente congelado preenfriado que contenga alcohol isopropílico y colóquelos a -80 °C durante la noche.
- Mantenga los tubos madre a -80 °C durante un máximo de 2 meses. Transfiera a nitrógeno líquido para un almacenamiento estable a largo plazo.
- Descongelación de las existencias de organoides
- Precalentar 9 mL de medio de cultivo basal++ en un baño de agua a 37 °C en un tubo de 15 mL marcado.
- Transfiera el vial de almacenamiento deseado a -80 °C o al nitrógeno líquido a un recipiente de transporte lleno de nitrógeno líquido.
- Transfiera el tubo criogénico a un baño de agua a 37 °C y agítelo suavemente hasta que el material congelado cerca de las paredes del tubo comience a descongelarse.
- Distribuya la suspensión de organoide lentamente en el tubo marcado lleno de 9 ml de medio. Agite suavemente el tubo. Centrifugar durante 5 min a 300 × g y retirar el sobrenadante.
- Realice la siembra como se describe en los pasos 2.1.16-2.1.18 y aplique el medio organoide óptimo para el cáncer de ovario respectivo de acuerdo con las condiciones de cultivo a largo plazo ya determinadas para la línea individual.
- Fijación de organoides
- Realice la recolección de organoides como se describe en los pasos 3.1.2-3.1.3.
- Añadir 3 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS (pH 7,4) e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar 2 veces con 5 ml de PBS, centrifugar durante 3 min a 300 × g y retirar el sobrenadante. Agregue 4 ml de PBS fresco al gránulo y manténgalo a 4 °C hasta la inclusión.
NOTA: Los organoides fijos son estables y es posible almacenarlos a 4 °C durante 1 mes antes de su inclusión. - Calentar el gel histológico (almacenado a -20 °C) a 65 °C hasta que se licúe.
- Detecta los organoides fijos asentados y visibles en el fondo del tubo. Retire el sobrenadante. En caso de que se rompa un gránulo celular, realice la centrifugación durante 3 min a 300 × g y deseche el sobrenadante PBS.
- Suspenda el gránulo en 100 μL de gel tibio pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la gota a un trozo de película de sellado y deje que se produzca la solidificación después de ~ 15 minutos a temperatura ambiente.
- Mueva la gota de gel fija al casete de parafina de tejido. Llevar a cabo protocolos estándar de inclusión de tejidos19,20.
- Corte rodajas de 5-10 μm de grosor con una herramienta de corte de microseccionamiento. Transfiera los cortes a portaobjetos histológicos. Secar los portaobjetos durante 1 h a 65 °C; Guárdalos en un lugar seco.
- Tinción por inmunofluorescencia de secciones de organoides
- Mueva los portaobjetos preparados a través de bandejas de vidrio con la siguiente serie de diluciones: 2 x 15 min de agente aclarante para histología; 15 min 100% etanol; 1 min 100% etanol; 10 min 96% de etanol; 5 min Etanol al 70%; 5 min Etanol al 50%.
- Agregue PBS y mantenga 5 minutos en el agitador a 100 rpm. Repita el lavado 2 veces.
- Agregue solución de recuperación de antígeno (tampón de tris(hidroximetil)aminometano-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) [pH 9.0] o citrato [pH 6.0]) a los portaobjetos que se colocan en la cámara termoestable. En una vaporera, mantenga el recipiente con los portaobjetos durante 30 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente.
- Repita el paso 3.5.2.
- Transfiera la cámara que contiene los portaobjetos durante 15 min a una solución de detergente de permeabilización al 1% (en PBS).
- Repita el paso 3.5.2.
- Perfile la ubicación de los organoides en los portaobjetos con un bolígrafo de cera inmunotinción para mantener la gota durante los siguientes pasos.
- Añadir en cada portaobjetos 100 μL de suero al 10% en un medio de dilución, dependiendo de la especie del anticuerpo secundario.
- Repita el paso 3.5.2.
- Diluir los anticuerpos primarios en un medio, lo que lleva a un volumen final de 100 μL. Mantener a 4 °C durante al menos 16 h en una bandeja de incubación/cámara de humedad.
- Repita el paso 3.5.2.
- Diluir los anticuerpos secundarios en un medio, dando lugar a gotas de 100 μL, y mantener durante 2 h a temperatura ambiente en una bandeja de incubación.
- Repita el paso 3.5.2.
- Añadir solución de contratinción nuclear DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindol, diclorhidrato) diluida en un medio de dilución 1:1.000. Mantener durante 10 minutos a temperatura ambiente para la incubación.
- Repita el paso 3.5.2.
- Agregue el medio de montaje y cubra con el cubreobjetos. Asegure las diapositivas con esmalte de uñas transparente una vez secas (aproximadamente después de 8-12 h).
- Imagen con un microscopio confocal u otro microscopio de fluorescencia. Realice imágenes generales, así como imágenes detalladas de las estructuras subcelulares que capturen las principales características de la morfología de los organoides.
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Representative Results
Después de la disociación, filtración y recuento inicial de tejidos, las células se siembran en paralelo directamente en formato 3D, como se explicó anteriormente, así como la suspensión en el matraz para una breve expansión 2D. En algunos casos, la expansión transitoria 2D influye positivamente en la formación de organoides, y la línea a largo plazo se establece con éxito a través de esta ruta, mientras que la siembra 3D paralela comparativa puede resultar en la detención del crecimiento (Figura 1). Para cada tejido donante que se procesa, las células se analizan de acuerdo con la matriz de medios. Siguiendo esta estrategia, nuestro biobanco ahora contiene líneas representativas de cada condición de crecimiento estándar como se muestra en la Figura 2. Mediante la implementación estricta de esta mini plataforma de cribado de pruebas de diferentes medios y modos de siembra, hemos generado con éxito líneas de organoides de diferentes tipos histológicos y estadios de desarrollo de la enfermedad de cáncer de ovario (Figura 3) de cirugías serosas primarias de alto grado, cirugías de intervalo posneoadyuvantes y de enfermedad recurrente. La caracterización fenotípica de las líneas organoides mediante tinción por inmunofluorescencia de los marcadores principales en comparación con el tejido parental demuestra de manera convincente que las características distintivas del compartimento tumoral epitelial se conservan en el modelo organoide: arquitectura epitelial y adhesión marcadas por (EpCAM), identidad de linaje (PAX8) y mutación puntual típica de TP53 característica de HGSOC que conduce a la acumulación en el núcleo (Figura 4).
También se deben considerar algunos puntos metodológicos importantes para una toma de decisiones eficiente durante el biobanco de organoides. El potencial de crecimiento de los organoides no solo está determinado por el aumento del diámetro del organoide. Además, las características fenotípicas determinan potenciales de expansión como el color, la oscuridad y la integridad del contorno. La formación de vacuolas de estrés citoplasmáticas indica condiciones subóptimas. Los problemas iniciales con respecto al crecimiento y el potencial de formación de organoides pueden ocurrir debido a condiciones de transporte inadecuadas y retraso en la procesión del tejido. Como se observa una alta variabilidad interindividual en el potencial de expansión dentro de las líneas tumorales, recomendamos esperar al menos 14 días antes de tomar una decisión final sobre el potencial de crecimiento. Si inicialmente se observan patrones de crecimiento similares en diferentes medios, se deben expandir múltiples condiciones. Según nuestra experiencia, una distinción clara del potencial de crecimiento estable a largo plazo a menudo solo es posible después de un cultivo de varias semanas o meses.
Figura 1: Beneficios de la siembra breve en 2D de aislados primarios para la posterior generación de organoides. (A) Esquema del diseño experimental que muestra la estrategia de siembra paralela de dos vías: 2D/3D y siembra directa en 3D en cuatro medios diferentes. (B) Imagen de aislados primarios adherentes antes de la tripsinización y la transferencia 3D. (C) Un ejemplo del depósito primario donde la siembra paralela reveló la clara ventaja de la ruta 2D/3D, ya que la expansión de organoides a largo plazo solo fue posible a partir de progenitores que inicialmente se aislaron en plástico. La imagen superior izquierda muestra un cultivo 3D 7 días después del aislamiento en el pasaje 0 (denominado P0) con formación insuficiente de organoides después del primer paso (denominado P1) en la imagen inferior izquierda. Después de la siembra 2D en plástico (ver Figura 1B) seguida de la transferencia a un cultivo 3D, ya se observa una mejor formación de organoides en P0, mientras que el potencial de expansión a largo plazo se confirma en el pasaje 4 (P4). Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Requerimiento de medio específico para cada paciente. Ejemplos de cuatro líneas expandidas estables a largo plazo diferentes, cada una creciendo en un medio diferente. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: OCM = medio para cáncer de ovario; her = heregulina 1β; HGSO = cáncer de ovario seroso de alto grado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Generación de organoides en todas las etapas de la enfermedad. Imágenes de líneas expansivas estables a largo plazo, de cáncer de ovario seroso de grado alto y de cáncer de ovario seroso de grado bajo en la presentación primaria de la enfermedad, de cirugía de intervalo (quimioterapia posneoadyuvante) y de tejido canceroso recidivante. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: HGSOC = cáncer de ovario seroso de alto grado; LGSOC = cáncer de ovario seroso de bajo grado; NACT = quimioterapia neoadyuvante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Coincidencia cercana del fenotipo de los organoides y el tejido canceroso parental. Las imágenes confocales de la tinción por inmunofluorescencia de (A) tejido canceroso y (B) línea de organoides pareados muestran una similitud muy alta en el patrón de tinción y el nivel de expresión de todos los marcadores, EpCAM (verde), PAX8 (rojo), TP53 (magenta). Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Composición de los medios y la mezcla de digestión utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El protocolo diseñado aborda los desafíos previos del biobanco de organoides de cáncer de ovario con respecto a la formación de organoides y el potencial de paso a largo plazo y garantiza la generación de líneas completamente expandibles a partir de la mayoría de los depósitos de tumores sólidos. El proceso de recolección quirúrgica de muestras tumorales que se utilizarán para la generación de organoides tiene un impacto significativo en el rendimiento y el potencial de expansión. Las muestras de tejido tumoral se pueden obtener durante varios procedimientos, incluida la cirugía multivisceral, la laparoscopia diagnóstica o la biopsia. El cirujano gineco-oncológico experimentado debe priorizar la obtención de muestras tumorales limpias de localizaciones peritoneales. En particular, se ha observado que las áreas macroscópicamente necróticas dentro de grandes depósitos tumorales son menos adecuadas para la generación exitosa de cultivos de organoides. Dado que la pureza de la muestra es crucial para reflejar las características moleculares y fenotípicas para las aplicaciones posteriores, se requieren esfuerzos sincronizados de los equipos clínicos y de laboratorio para un biobanco óptimo, asegurando que las líneas se creen a partir de las regiones más relevantes del tumor.
Si bien este protocolo cubre las variaciones en las dependencias de los factores de crecimiento que hemos observado durante 2 años de biobancos, está claro que se justifica un refinamiento adicional para aumentar aún más la eficacia, ya que todavía no observamos ningún crecimiento de organoides en el 20% de los casos y el número de líneas que demostraron un potencial de expansión limitado sugirió un mantenimiento subóptimo del tallo. Aunque nuestro biobanco de organoides actualmente incluye solo muestras de cáncer de ovario de histología serosa (HGSOC y LGSOC), nuestra experiencia con muestras de diferentes histologías epiteliales de cáncer de ovario antes del programa de biobanco estructurado mostró tasas de éxito comparables sin diferencias específicas. En particular, la mayoría de los subtipos epiteliales de cáncer de ovario comparten una morfología pseudoestratificada cilíndrica similar con tejidos que se desarrollaron a partir del tracto mülleriano (trompa de Falopio, útero, cuello uterino), mientras que, por el contrario, el epitelio ovárico en sí se origina en el desarrollo de la cresta genital y el mesonefros, estando cubierto por una sola capa de epitelio cuboidal. Dado que las vías de desarrollo que regulan la homeostasis epitelial tienen un papel central en el control del potencial de las células madre adultas, las diferencias en el origen embrionario deben tenerse en cuenta al desarrollar protocolos para el biobanco de organoides. Por lo tanto, creemos que los progenitores de la superficie del ovario probablemente requieren condiciones de cultivo específicas del órgano para mantener un crecimiento estable a largo plazo.
Cabe destacar que, en nuestro laboratorio, el protocolo ha demostrado ser exitoso también para muestras de cáncer de ovario post-neoadyuvante, aunque la quimioterapia neoadyuvante afecta la viabilidad celular y el fenotipo tisular. Estas muestras exhiben más restos y agregados de tejido extracelular en comparación con las muestras derivadas de tejido previo a quimioterapia de cirugías citorreductoras primarias, lo que podría afectar el potencial de formación de organoides. En estos casos, experimentamos que una cantidad adecuada de tejido quirúrgico y el cumplimiento estricto de las condiciones de transporte recomendadas son cruciales para el éxito de la generación de organoides, ya que las muestras post-neoadyuvantes pueden ser más sensibles.
Un fenómeno muy interesante del efecto beneficioso de la breve expansión sobre el plástico en 2D de progenitores recién aislados sobre el crecimiento posterior de organoides, que hemos observado repetidamente y, por lo tanto, incluido en el procedimiento experimental estandarizado, es una adición importante a la metodología del campo de investigación de organoides cancerosos, que se basa en gran medida en estrategias de siembra directa. Es tentador especular que la sensibilidad de los progenitores después de la digestión enzimática y la capacidad de los factores de crecimiento para prepararlos adecuadamente podrían ser los mecanismos subyacentes detrás de esta diferencia, que en algunos casos es un factor decisivo si se puede establecer la línea. Sin embargo, se necesita más investigación para establecer dependencias claras.
Para hacer frente a los desafíos planteados por la alta adhesión celular y las uniones funcionales en los organoides de cáncer de ovario 3D, que son difíciles de digerir, una combinación de disociación mecánica y enzimática con aguja y jeringa puede ayudar cuando quedan grandes grumos después de la tripsinización. La experimentación con diferentes condiciones enzimáticas podría conducir a nuevas mejoras.
Después del almacenamiento a largo plazo, las líneas de organoides pueden descongelarse y cultivarse de acuerdo con el diseño experimental y utilizarse para aplicaciones posteriores. Esto permite acceder en cualquier momento a líneas de organoides ya generadas con fines de investigación específicos y es particularmente interesante para investigar el comportamiento a largo plazo de ciertas líneas a la luz de la progresión de la enfermedad del paciente. Sin embargo, la criopreservación de organoides de cáncer de ovario sigue siendo un desafío. Las variaciones de temperatura durante los ciclos de congelación y descongelación pueden afectar negativamente la viabilidad, la funcionalidad y el potencial de expansión de los organoides. El almacenamiento a largo plazo es más estable en nitrógeno líquido, donde las temperaturas muy bajas minimizan el riesgo de degradación para que se pueda mantener la integridad de los organoides. Sin embargo, se justifica la optimización continua para establecer procedimientos consistentes para congelar, almacenar y descongelar, para mejorar aún más estos procesos.
A pesar de los problemas pendientes mencionados, este protocolo demuestra la capacidad de generar consistentemente líneas organoides estables a partir de muestras de tumores sólidos de pacientes con cáncer de ovario. En nuestro laboratorio, procesamos hasta la fecha 120 muestras de tejido de cáncer primario de ovario logrando el éxito en aproximadamente el 50% de los casos, incluyendo una amplia gama de subtipos histológicos y estadios de la enfermedad con citorreducción primaria, enfermedad recurrente y muestras quirúrgicas posneoadyuvantes. Al proporcionar un marco estructurado para la generación de organoides derivados de varias muestras de pacientes, la siembra paralela en diferentes medios y la implementación de diferentes estrategias de siembra, este protocolo brinda la oportunidad de evaluar las diferencias individuales en el potencial de tallo, proporcionando así información adicional sobre la biología tumoral. Hasta donde sabemos, la gran mayoría de los estudios suelen seguir el enfoque inverso de probar los componentes del medio en un pequeño número de muestras y elegir por simplicidad un medio óptimo. Nuestras pruebas sistemáticas del efecto de HER1ß, el efecto de la suplementación con RSPO1 y FGF10 y la siembra 2D/3D demuestran de manera concluyente que el tejido de cáncer de ovario tiene un grado de variabilidad entre pacientes en las propiedades de la madre, y el medio óptimo es, de hecho, específico para el paciente. Por lo tanto, es esencial realizar pruebas paralelas sistemáticas de diferentes composiciones de medios que proporcionen diferentes entornos de señalización paracrina exógena.
El establecimiento de un biobanco viviente con un amplio panel de organoides derivados de varias pacientes con cáncer de ovario, junto con su información clínica recopilada prospectivamente, sirve como un recurso valioso para una amplia gama de aplicaciones de investigación y refleja el panorama clínico heterogéneo que es potencialmente aplicable a una población de pacientes más grande17. El cultivo y la criopreservación a largo plazo permiten la consistencia experimental y la accesibilidad repetida de la misma línea de organoides a lo largo del tiempo, sirviendo como base para diseños experimentales longitudinales con propiedades celulares inalteradas de la línea tumoral.
Al conservar la arquitectura epitelial y la polarización, las líneas organoides son un modelo adecuado para estudiar la comunicación célula-célula y la toma de decisiones sobre el destino celular dependiente del contexto mediada por vías de señalización paracrinas. La inclusión de los organoides en el gel histológico es un paso intermedio práctico y eficiente para evitar la pérdida de material después de la fijación y garantiza que el procesamiento posterior (inclusión en parafina y corte) se pueda realizar en paralelo con las muestras de tejido. La pérdida de organoides durante el procedimiento de fijación es un problema crítico cuando el número de organoides es muy limitado. Sin embargo, esta pérdida puede contrarrestarse eliminando completamente los organoides de la matriz extracelular mediante el lavado en un medio de cultivo basal frío y agrupando al menos dos pocillos completamente desarrollados de una placa de formato de 24 pocillos antes de la fijación. El protocolo de tinción por inmunofluorescencia permite que las imágenes confocales de alta resolución correspondan las características moleculares y fenotípicas de los organoides del cáncer de ovario con el tejido tumoral parental, pero también es una herramienta valiosa para estudiar la respuesta celular a compuestos químicos o la caracterización de líneas modificadas genéticamente. El método también es adecuado para la tinción histológica sin ninguna modificación específica. Dependiendo del propósito del estudio, se deben considerar secciones más delgadas cortadas con un micrótomo (2-3 μm).
Es importante destacar que el cultivo estable a largo plazo es un requisito previo para los experimentos de edición genética y los ensayos funcionales sobre la respuesta a los fármacos y la resistencia a las terapias nuevas y estándar17,21. En particular, los organoides generados a partir de las rebiopsias que se realizan durante la progresión y la recurrencia de la enfermedad ofrecen la posibilidad de realizar análisis comparativos directos entre el tumor original sin tratamiento previo y las características recién adquiridas observadas durante la recaída. La identificación de las respuestas al tratamiento específicas de cada paciente y la formación de resistencia a la terapia in vitro hacen avanzar el campo de la medicina de precisión en la investigación del cáncer de ovario21.
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Disclosures
M.K. figura como inventor en una patente relacionada con un medio para organoides de cáncer de ovario. F.T. recibió fondos de investigación, consejo asesor, honorarios y gastos de viaje de AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics y Tesaro/GSK. S.M. recibió fondos de investigación, consejo asesor, honorarios o gastos de viaje: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Acknowledgments
El estudio está financiado por el Centro Alemán de Investigación del Cáncer DKTK, sede asociada de Múnich, una asociación entre DKFZ y el Hospital Universitario LMU de Múnich. El estudio también cuenta con el apoyo de la beca German Cancer Aid (#70113426 y #70113433). La inclusión en parafina de tejidos y organoides se ha realizado en las instalaciones centrales del Instituto de Anatomía de la Facultad de Medicina de la LMU de Múnich. La obtención de imágenes confocales se ha realizado en la instalación principal de bioimagen en el Centro Biomédico (BMC). Los autores quieren agradecer a Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink y Martina Rahmeh por su ayuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
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