Summary
Detta protokoll erbjuder ett systematiskt ramverk för etablering av äggstockscancerorganoider från olika sjukdomsstadier och tar itu med utmaningarna med patientspecifik variabilitet för att öka utbytet och möjliggöra robust långsiktig expansion för efterföljande applikationer. Den innehåller detaljerade steg för vävnadsbearbetning, sådd, justering av mediekrav och immunofluorescensfärgning.
Abstract
Även om inrättandet av en biobank för äggstockscancer från patienthärledda organoider tillsammans med deras kliniska bakgrundsinformation lovar framsteg inom forskning och patientvård, är standardisering fortfarande en utmaning på grund av heterogeniteten hos denna dödliga malignitet, i kombination med den inneboende komplexiteten i organoidteknologin. Detta anpassningsbara protokoll ger ett systematiskt ramverk för att realisera den fulla potentialen hos äggstockscancerorganoider med hänsyn till en patientspecifik variabilitet av progenitorer. Genom att implementera ett strukturerat experimentellt arbetsflöde för att välja optimala odlingsförhållanden och såddmetoder, med parallell testning av direkt 3D-sådd kontra en 2D/3D-väg, erhåller vi i de flesta fall robusta långsiktiga expanderande linjer som är lämpliga för ett brett spektrum av nedströmsapplikationer.
Protokollet har testats och visat sig vara effektivt i ett stort antal fall (N = 120) av mycket heterogent utgångsmaterial, inklusive höggradig och låggradig äggstockscancer och sjukdomsstadier med primär debulking, återkommande sjukdom och post-neoadjuvanta kirurgiska prover. Inom en exogen signalmiljö med lågt Wnt och hög BMP observerade vi att progenitorer var olika mottagliga för aktivering av Heregulin 1 ß (HERß-1)-vägen, där HERß-1 främjar organoidbildning hos vissa medan den hämmar den hos andra. För en delmängd av patientens prover kräver optimal organoidbildning och långsiktig tillväxt tillsats av fibroblasttillväxtfaktor 10 och R-Spondin 1 till mediet.
Vidare belyser vi de kritiska stegen för vävnadsnedbrytning och progenitorisolering och pekar på exempel där kortvarig odling i 2D på plast är fördelaktigt för efterföljande organoidbildning i Basement Membrane Extract typ 2-matrisen. Sammantaget kräver optimal biobankning systematisk testning av alla huvudförhållanden parallellt för att identifiera en lämplig tillväxtmiljö för enskilda linjer. Protokollet beskriver också hanteringsproceduren för effektiv inbäddning, snittning och färgning för att få högupplösta bilder av organoider, vilket krävs för omfattande fenotypning.
Introduction
Den kliniska behandlingen av patienter med epitelial äggstockscancer är fortfarande utmanande på grund av dess heterogena kliniska presentation i avancerade stadier och höga återfallsfrekvenser1. För att förbättra vår förståelse av äggstockscancerns utveckling och biologiska beteende krävs forskningsmetoder som tar hänsyn till den patientspecifika variabiliteten under sjukdomsförloppet, behandlingssvar och histopatologiska såväl som molekylära egenskaper2.
Biobanking, som kännetecknas av systematisk insamling och långtidsbevarande av tumörprover från äggstockscancerpatienter tillsammans med deras kliniska information, erbjuder bevarande av en stor patientkohort i olika sjukdomsstadier, inklusive tumörprover från primära debulkingoperationer, efter neoadjuvant kemoterapi och från återkommande sjukdom. Det har en värdefull potential för att främja cancerforskning och fungerar som en resurs för lovande prognostiska biomarkörer och terapeutiska mål3. Konventionella biobanksmetoder, såsom formalinfixering och frysning, är dock inte mottagliga för att utföra funktionella studier på de ursprungliga tumörproverna på grund av förlusten av livsduglighet och störningen av den ursprungliga tredimensionella vävnadsarkitekturen 4,5.
Studier av molekylära mekanismer, inom onkologi och därefter, är i hög grad beroende av användningen av lämpliga experimentella modeller som troget återspeglar sjukdomens biologi och bibehåller in vitro-egenskaper hos den vävnad som observerats in vivo. Organoider som härrör från patienter, baserade på bevarandet av förnyelsepotentialen, reproducerar epitelets ursprungliga struktur och funktion i laboratoriet och möjliggör testning i ett patientspecifikt sammanhang. Därför har de dykt upp som mycket lovande verktyg för cancerforskning och personlig medicin, vilket överbryggar klyftan mellan klinisk mångfald och laboratorieforskning 6,7,8,9. Skräddarsydda terapeutiska strategier baserade på individuella läkemedelssvar från organoidlinjer och testning av den funktionella relevansen av molekylära profiler, kan potentiellt tillämpas direkt på patientvård10,11. Möjligheten till långsiktig odling inklusive patientspecifika egenskaper och insamling av relevanta prospektiva kliniska data över tid är mycket lovande för att identifiera nya prognostiska och prediktiva faktorer som är involverade i sjukdomsprogression och resistensmekanismer 3,9.
Att bygga en biobank som inkluderar organoider från olika tumörprover kräver dock en kombination av strikt efterlevnad av komplexa metoder och upprättande av protokoll för enkelt underhåll12. Processstandardisering säkerställer att biobanken kan etableras och underhållas effektivt av utbildad personal även vid hög omsättning, samtidigt som de högsta kvalitetsstandarderna följs13. Flera studier har rapporterat framgångsrik generering av stabila organoidlinjer för äggstockscancer som motsvarar den ursprungliga tumörens mutations- och fenotypiska profil med varierande effektivitet. Rutinmässig biobankning är dock fortfarande en utmaning i praktiken, särskilt för långsiktig stabil tillväxt av linjer, vilket är en förutsättning för storskalig expansion eller framgångsrik genomisk redigering.
I synnerhet är frågan om expanderbarhet fortfarande vagt definierad i fält eftersom organoider som uppvisar långsam och begränsad tillväxtpotential ibland räknas som etablerade linjer. Som ursprungligen visades av Hoffmann et al., en studie vars huvudsakliga fynd låg till grund för detta vidareutvecklade protokoll, kräver optimal hantering av äggstockscancervävnad en unik strategi för att tillgodose heterogenitet14. Fenotypisk karakterisering av organoiderna erhållna med denna metod och nära likhet med modertumörvävnad bekräftades genom panel-DNA-sekvensering och transkriptomikanalys av mogna kulturer (4-10 månaders odling) som visade stabiliteten hos modellen 8,9,12,14.
Till skillnad från den parakrina miljön som reglerar homeostasen i de friska äggledarna, är epitelskiktet, som sannolikt ger höggradig serös äggstockscancer (HGSOC), cancerregenereringspotential och organoidbildningskapacitet, mindre beroende av exogent Wnt-tillskott. Dessutom visade sig aktiv BMP-signalering (Bone Morphogenetic Protein), kännetecknad av frånvaron av Noggin i organoidmedium, vara fördelaktig för etablering av långsiktiga kulturer från äggstockscancer fasta vävnadsavlagringar14,15. Under systematisk biobankning av fasta avlagringar av äggstockscancer har vi bekräftat dessa fynd och satt upp pipelinen, med detaljer som beskrivs i detta protokoll som säkerställer en hållbar långsiktig expansion i de flesta fall. Vi finner att parallell testning av olika mediesammansättningar och såddmodaliteter när man arbetar med primära isolat är avgörande för att förbättra etableringen av långsiktigt stabila organoidlinjer och för att öka utbytet, vilket möjliggör robust förökning och expansion till flerbrunnsformat som krävs för nedströmsexperiment16.
Dessutom är renheten och kvaliteten på de prover som samlas in under operationen av avgörande betydelse för den translationella potentialen hos äggstockscancerorganoider inom grundforskning och molekylär diagnostik. Komplexiteten i den kliniska presentationen av HGSOC kräver ett nära samarbete mellan kirurger, onkologer och forskare i laboratoriet för att säkerställa att relevant material identifieras korrekt, transportförhållanden hålls konstanta och organoidlinjer genereras med hög effektivitet som representerar de viktigaste egenskaperna hos sjukdomen hos varje patient. Detta protokoll ger ett standardiserat men anpassningsbart ramverk för att fånga den fulla potentialen hos äggstockscancerorganoider, med tanke på den heterogenitet som kännetecknar äggstockscancer16,17. Detta protokoll möjliggör tillförlitlig biobankning av det breda spektrumet av klinisk presentation av äggstockscancer, inklusive olika histologiska typer (höggradig och låggradig äggstockscancer, LGSOC), olika insättningar från samma patienter som uppvisar skillnader i stamhetsreglering, vävnader från operationer i postneoadjuvant miljö, biopsimaterial och prover från operationer i den återkommande fasen av sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumörvävnadsprover från äggstockscanceroperationer samlades in och organoider från patienter genererades i enlighet med etikkommittén vid LMU University (17-471), i enlighet med gällande EU-, nationella och lokala bestämmelser. Varje patient som deltar i studien har samtyckt skriftligen. Vid arbete med färska vävnadsprover krävs säkerhetstillstånd på biosäkerhetsnivå 2 och skåp med laminärt flöde. Med tanke på vävnadsprovernas potentiellt smittsamma karaktär, som inte kan uteslutas på grund av bristen på rutinmässig testning av relevanta infektionssjukdomar, är det nödvändigt att se till att institutionella bestämmelser om biosäkerhet följs strikt och att lämplig personlig skyddsutrustning finns tillgänglig för den personal som utför experimenten.
1. Förberedelser
- Medium förberedelse
- Förbered 2D- och 3D-medierna på nytt en gång i veckan och förvara dem vid 4 °C.
OBS: Den exakta sammansättningen av ingredienserna för varje medium anges i tabell 1. Både äggstockscancer medium 1 (OCM1) och OCM2 kan dessutom kompletteras med HER1ß (slutlig koncentration: 50 ng/ml), vilket resulterar i fyra olika tillstånd: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß. - Skapa stamlösningar av tillväxtfaktorreagenserna och förvara dem vid 20 °C och av A83-01 och nikotinamid (förvaring vid +4 °C). På grund av tillväxtfaktorernas temperaturkänslighet ska upptinade stamlösningar omedelbart användas för beredning av medium och upprepade upptiningscykler undvikas genom att alikvoter skapas.
OBS: Medieförberedelse är ett kritiskt steg som måste kontrolleras strikt. - Beredning av RSPO-1-konditionerat medium
- Tina HA-R-Spondin1-Fc 293 T-celler (förvaring vid -80 °C) snabbt vid 37 °C. Tvätta dem med 10 ml basalodlingsmedium, kompletterat med 10 % fetalt kalvserum (FCS), hädanefter kallat basalodlingsmedium++.
- Återsuspendera cellpelleten i 12 ml basalodlingsmedium++ och så den i en T75-kolv.
- Dela cellerna i förhållandet 1:6 med ett dissociationsreagens som innehåller trypsin (4 min vid 37 °C) när cellerna når sammanflöde. Frö dem i en ny T75-kolv.
- Nästa dag tillsätts fleomycin D1 (1,25 μL/ml) till mediet.
- Dela cellerna i förhållandet 1:20 med trypsin (4 min vid 37 °C) när cellerna når sammanflöde. Frö cellerna till flera T75-kolvar (antal flaskor enligt den avsedda slutvolymen) i 30 ml basalodlingsmedium++ (innehållande 10 % FCS) tillsatt med fleomycin D1.
- Starta produktionen av konditionerade medier när cellerna når cirka 50 % av sammanflödet: ersätt mediet med 40 ml basalodlingsmedium kompletterat med 5 % FCS utan fleomycin D1.
- Samla in den första supernatanten efter 3 dagar. För att ta bort skräpet, centrifugera i 10 minuter vid 1 200 × g. Förvara supernatanten i en steril behållare vid 4 °C.
- Tillsätt ett nytt basalodlingsmedium kompletterat med 5 % FCS till cellerna. Samla in den andra supernatanten efter 3-4 dagar. Centrifugera i 10 minuter vid 1 200 × g. Tillsätt den andra supernatanten till den första supernatanten.
- Sila det konditionerade mediet med hjälp av ett 0.2 μm flasktoppfilter.
- För kvalitetskontroll och RSPO1-kvantifiering, tillsätt det producerade mediet till en 293T-cellinje (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, stabilt transducerad med GFP-plasmidbärande Wnt-reporter18.
OBS: Beroende på kvantiteten och intensiteten hos GFP-signalen testas aktiviteten hos RSPO1 som en agonist i Wnt-vägen genom kvantifiering av Wnt-reportercellinjen. - Förvara alikvoter på 15 ml för omedelbar användning (inom 1 vecka) vid 4 °C. För längre förvaring (6 månader) ska det konditionerade mediet förvaras vid -20 °C.
- Förbered 2D- och 3D-medierna på nytt en gång i veckan och förvara dem vid 4 °C.
2. Initiering av en organoidodling av äggstockscancer
- Isolering av primär vävnad
- Transportera färsk och livsduglig vävnad, helst omedelbart efter operationen och utför isolering inom högst 20 timmar efter insamling. Se till att vävnadsuppsamlingsmediet transporteras på rätt sätt med en transportlåda som är utrustad med kylförpackningar vid cirka 4 °C.
- I laboratoriet, förbered nödvändiga reagenser och utrustning för att underlätta snabb provbearbetning:
- Tina upp basalmembranextrakt typ II-matris (BME 2-matris) på is (cirka 2 timmar).
- Förbered engångsskalpeller, steriliserade dissektionsverktyg (sax och pincett) och 400 μm filterinsatser för 50 ml rör.
- Förbered en behållare med en liten mängd flytande kväve för snabbfrysning och ett förvärmt vattenbad vid 37 °C.
OBS: Arbeta i en laminär flödeshuv för cellodling.
- Tvätta den färska servetten i en petriskål noggrant i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (utan Ca++ och Mg++). Inuti petriskålen fragmenterar du vävnaden med hjälp av engångsskalpellerna och/eller saxen i små, 3-5 mm stora bitar.
- Separera den erhållna vävnaden i tre sektioner för följande ändamål:
- Samla vävnad i kryogena rör. Överför de kryogena rören till den förberedda behållaren fylld med flytande kväve för chockfrysning.
- Samla vävnaden (2–3 mm) i en behållare för histologiska prover fylld med formalin för fixering (24 timmar) och bädda in den i paraffin för färgning19,20.
- Homogenisera vävnaden före enzymatisk matsmältning. Maximera den mekaniska dissociationen med en skalpell och överför den till ett 50 ml vävnadsrör.
OBS: Se till att vävnaden alltid är indränkt i PBS under homogenisering för att undvika uttorkning av vävnaden.
- Kombinera den homogeniserade vävnaden med en digestionsblandning som innehåller PBS (utan Ca++ och Mg++), kollagenas I (stamlösning 5 E/μL, slutlig koncentration 1 E/μL) och en selektiv ROCK1- och ROCK2-hämmare (3 μM slutkoncentration) (komponenter förtecknade i tabell 1). Använd 15 ml digestionsblandning i ett 50 ml rör för varje 2 cm3 av tumören.
OBS: Begränsat material (t.ex. biopsiprover) kräver endast små mängder (cirka 2-3 ml) av matsmältningsblandningen för att säkerställa enzymatisk dissociation. - För enzymatisk dissociation, inkubera röret i 1,5 timme i ett vattenbad vid 37 °C. Utför sporadisk och kraftig vortexing (ungefär var 20:e minut i 10-15 s) för att stödja mekanisk dissociation.
- Efter inkubationen, tillsätt 15 ml kallt basalodlingsmedium++ till röret. Centrifugera 5 min vid 300 × g.
- Efter att ha tagit bort supernatanten, tillsätt 5 ml nytt basalodlingsmedium++. Sila cellsuspensionen med hjälp av ett 400 μm filter till ett nytt 50 ml rör.
- Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g. Ta bort supernatanten och behåll cellpelleten.
- För avlägsnande av erytrocyter, tillsätt 5 ml röd blodkroppslyseringsbuffert (RBC) till cellpelleten. Inkubera i vattenbad i 5 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 5 ml basalodlingsmedium++ för lysinaktivering. Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g. Tillsätt 3 ml basalodlingsmedium++ till cellpelleten.
- Räkna livsdugliga celler efter 1:1 utspädning med trypanblå färgningslösning (t.ex. 10 μl av provet + 10 μl trypanblå färgningslösning) i en automatisk cellräknare eller manuellt i en Neubauerkammare.
- Beräkna antalet celler som behövs för direkt 3D-sådd. För varje tumördeponering, frö till en 48-hålsformatplatta minst 2-3 brunnar per äggstockscancermedium, vilket motsvarar totalt 8-12 brunnar i en såddmatris (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Beräkna 30 000 celler för varje brunn i en droppe på 25 μL BME typ 2-matris. Alternativt kan du välja ett 24-brunnarsformat med 50 μL BME 2-matris och 50 000 seedade celler per brunn.
- Seeda de återstående cellerna i 2D (se steg 2.1.13).
- Pipettera över mängden basalodlingsmedium++ suspension som innehåller det totala antalet nödvändiga celler i ett nytt rör och centrifugera i 5 minuter vid 300 × g. Ta bort supernatanten och behåll cellpelleten.
- På isen, tillsätt den totala mängden kall BME 2-matris (25 μL för varje brunn i en platta med 48 brunnar; alltså 100 μL för 4 brunnar) till pelleten och blanda väl för att uppnå en jämn fördelning av celler per brunn genom att försiktigt pipettera pelleten upp och ner utan att skapa bubblor.
- Frö cellerna i droppar av BME 2-matris (25 μL) till den förvärmda, tomma 48-hålsplattan. För att uppnå jämn fördelning mellan brunnarna, flytta försiktigt och långsamt pipetten upp och ner (3-4x) inuti röret innan du överför BME 2-matrisdroppen till varje brunn för att förhindra cellutfällning under distributionen.
- Efter inkubation av plattan vid 37 °C i minst 30 minuter för att konsolidera dropparna i BME 2-matrisen, pipettera 250 μl av vart och ett av de fyra medierna för äggstockscancer (OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2, OCM2 + HER1ß) i motsvarande brunnar.
- Parallellt med den direkta 3D-såddproceduren, bevara de återstående isolerade cellerna genom att starta en 2D-odling.
- Efter centrifugering i 5 minuter vid 300 × g, tillsätt pelleten till 2D-mediet. Välj format (T75-kolv eller T25-kolv), beroende på antalet celler som är tillgängliga efter 3D-sådd.
- Inkubera kolven i 3–5 dagar vid 37 °C för cellvidhäftning. Behåll samma medium under de första 72 timmarna.
- När cellerna når sammanflöde, överför kulturen till BME 2-matrisen. Expandera inte primära isolat i 2D-kultur genom att dela upp eftersom långsiktig förökning på 2D är skadlig för stamningspotentialen.
- Överföring från 2D-kultur till 3D-kultur
- I T75- eller T25-kolven, tvätta monoskiktet 2x med 5 ml PBS för att lossa cellerna från bottenytan. Inkubera med 1 ml trypsin i 10 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 5 ml kallt basalodlingsmedium++ för inaktivering av dissociationsreagenset. Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g.
- Tillsätt 3 ml basalodlingsmedium++ till pelleten. Räkna cellerna enligt beskrivningen i steg 2.1.12-2.1.13. Utsäde för de olika mediesammansättningarna (se figur 1) enligt beskrivningen i steg 2.1.16–2.1.18.
- Utvärdering av organoidtillväxt
- Avbilda brunnarna minst en gång i veckan för att dokumentera organoidtillväxt. Gör jämförbara bilder av hög kvalitet av 2D/3D-odling och direkta såddplattor med faskontrastmikroskop. Se till att förstoringen är konsekvent och använd 4x för en översikt över brunnarna (kvantifiering) och 10x och 20x för att dokumentera organoidernas morfologi.
- Organisera lagring av bilder i mappar som är dedikerade till enskilda rader.
- Välj den bästa organoidlinjen för långtidsodling genom jämförande bedömning av organoidbildning vid de olika såddmodaliteterna (2D följt av 3D-sådd kontra direkt 3D-sådd) och olika mediesammansättningar (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 och OCM2+ HER1ß).
- I genomsnitt, 14-21 dagar efter isolering, utvärdera den organoidbildande potentialen (kvantiteten) samt storleken och den cellulära fenotypen för organoider som odlats under olika förhållanden. Leta efter följande egenskaper: frånvaro av vakuoler, membranblödning eller förlust av vidhäftning och avrundning av celler.
3. Långsiktig organoidodling
- Organoid passaging
- Undvik att klyva organoider för ofta och under proliferativ fas. Utför mekaniska och enzymatiska matsmältningsprocedurer med intervaller på mer än 10 dagar.
- För att störa varje BME 2-matrisdroppe, tillsätt 250 μL (48-hålsformat) eller 500 μL (24-hålsformat) iskallt basalkulturmedium++. Se till att droppen och pipetten är helt upplöst med jämna mellanrum upp och ner och skrapa plattans botten. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och lägg den på is. Tillsätt 1 ml iskall basalkultur medium++.
OBS: Borttagningseffektiviteten för BME 2-matrisen beror starkt på medietemperaturen eftersom den bästa upplösningen uppnås under 4 °C. - Pool 2-3 tekniska replikatbrunnar för jämn expansion. Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g. Inspektera innehållet i suspensionen mot ljuskällan för att se om BME 2-gelen fortfarande är synlig. Ta bort supernatanten och upprepa tvättningen med ett iskallt medium om BME 2-matrisen fortfarande är synlig.
- Inkubera med 1 ml trypsin (förvaras vid 20–25 °C) i ett vattenbad vid 37 °C i 7–10 minuter. Vred sporadiskt i 10 s för att förbättra dissociationen. Inspektera röret med jämna mellanrum visuellt för att se om dissociationen fortskrider.
- Dra cellsuspensionen upp och ner med en spruta genom en nål med en storlek från 23 G till 27 G. Kontrollera om det fortfarande finns stora cellklumpar och upprepa proceduren vid behov.
OBS: Fragmentering genom en spruta är valfritt, och nålstorleken beror på den dissociationseffekt som krävs. En homogen cellsuspension leder till jämn fördelning mellan brunnarna. - Tillsätt 1 ml kallt basalodlingsmedium++ för att inaktivera reaktionen.
- VALFRITT: Räkna cellerna enligt beskrivningen i steg 2.1.12-2.1.13 och bestäm delningsförhållandet till föräldrapassagen (t.ex. 1:3 brunnar).
- Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g. Ta bort supernatanten.
- Genomför sådd enligt beskrivningen i steg 2.1.16-2.1.18 och applicera respektive optimalt organoidmedium för äggstockscancer enligt den redan etablerade långtidsodlingen. Byt medium för äggstockscancer var 3-4:e dag.
- I händelse av störning av BME 2-matrisdroppen under mediebyte, överväg omsådd utan enzymatisk nedbrytning. För att undvika avbrott i droppen, utför noggrant mediebytesproceduren utan direkt pipettering på BME 2-matrisdroppen. Undvik dessutom att lämna en överdriven mängd kvarvarande basalkulturmedium++ på pelleten före spädning med BME 2-matrisen vid steg 2.1.16 eftersom det kan påverka dropparnas bräcklighet.
- Kryokonservering av organoider
OBS: Utför kryokonservering av organoiderna under spridningsfasen under den första veckan efter passagen.- Bryt BME 2-matrisdroppen med iskallt basalkulturmedium++ enligt steg 3.1.2. Efter centrifugering och kassering av supernatanten enligt beskrivningen i steg 3.1.3, arbeta på is och återsuspendera cellpelleten i 1 ml iskall kryokonserveringsmedium. Överför cellsuspensionen till förmärkta 1,8 ml kryogena rör.
- Förvara rören i en förkyld frysbehållare med isopropylalkohol och placera dem vid -80 °C över natten.
- Förvara stamrören vid -80 °C i högst 2 månader. Överför till flytande kväve för långtidsstabil lagring.
- Upptining av organoidlager
- Förvärm 9 ml basalodlingsmedium++ i ett 37 °C vattenbad i ett märkt 15 ml rör.
- Överför den önskade injektionsflaskan från förvaringen vid -80 °C eller till flytande kväve till en transportbehållare fylld med flytande kväve.
- Överför kryoröret till ett vattenbad vid 37 °C och rör försiktigt om tills det frusna materialet nära rörets väggar börjar tina.
- Fördela organoidsuspensionen långsamt i det märkta röret fyllt med 9 ml medium. Skaka röret försiktigt. Centrifugera i 5 minuter vid 300 × g och ta bort supernatanten.
- Utför sådd enligt beskrivningen i punkterna 2.1.16–2.1.18 och applicera respektive optimalt organoidmedium för äggstockscancer enligt de redan fastställda långsiktiga odlingsförhållandena för den enskilda linjen.
- Fixering av organoider
- Utför organoidinsamling enligt beskrivningen i steg 3.1.2-3.1.3.
- Tillsätt 3 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 7,4) och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta 2 gånger med 5 ml PBS, centrifugera i 3 minuter vid 300 × g och ta bort supernatanten. Tillsätt 4 ml färsk PBS till pelleten och håll den vid 4 °C tills den bäddas in.
OBS: Fasta organoider är stabila och lagring vid 4 °C är möjlig i 1 månad före inbäddning. - Värm den histologiska gelen (förvaras vid -20 °C) vid 65 °C tills den är flytande.
- Detektera de fasta organoiderna som är sedimenterade och synliga i botten av röret. Ta bort supernatanten. I händelse av en avbruten cellpellet, utför centrifugering i 3 minuter vid 300 × g och kassera supernatanten PBS.
- Häng upp pelleten i 100 μL varm gel genom att försiktigt pipettera upp och ner. Överför droppen till en bit tätningsfilm och låt stelning ske efter ~15 minuter vid rumstemperatur.
- Flytta den fixerade geldroppen till vävnadsparaffinkassetten. Genomför standardprotokoll för vävnadsinbäddning19,20.
- Skär 5-10 μm tjocka skivor med ett mikrosektioneringsverktyg. Överför snitten till histologiglas. Torka objektglasen i 1 timme vid 65 °C. Förvara dem på en torr plats.
- Immunofluorescensfärgning av organoidsektioner
- Flytta de preparerade objektglasen genom glasbrickor med följande spädningsserie: 2 x 15 min röjningsmedel för histologi; 15 min 100% etanol; 1 min 100% etanol; 10 min 96% etanol; 5 min 70% etanol; 5 min 50% etanol.
- Tillsätt PBS och håll 5 min på shakern på 100 rpm. Upprepa tvätten 2 gånger.
- Tillsätt antigenuttagningslösning (Tris(hydroximetyl)aminometan-etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-buffert [pH 9,0] eller citrat [pH 6,0]) till objektglasen som placeras i den termostabila kammaren. Förvara behållaren med objektglasen i en ångkokare i 30 minuter, följt av att svalna till rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.5.2.
- Överför kammaren som innehåller objektglasen i 15 minuter till 1 % permeabiliseringslösning (i PBS).
- Upprepa steg 3.5.2.
- Konturera placeringen av organoider på objektglasen med en immunfärgande vaxpenna för att behålla droppen under följande steg.
- Tillsätt 100 μl 10-procentigt serum i ett spädningsmedium på varje objektglas, beroende på den sekundära antikroppens art.
- Upprepa steg 3.5.2.
- Späd de primära antikropparna i ett medium, vilket leder till en slutlig volym på 100 μL. Förvaras vid 4 °C i minst 16 timmar i en inkubationsbricka/fuktkammare.
- Upprepa steg 3.5.2.
- Späd de sekundära antikropparna i ett medium, så att det blir 100 μL droppar, och förvara i 2 timmar i rumstemperatur i ett inkubationstråg.
- Upprepa steg 3.5.2.
- Tillsätt nukleär motfärgningslösning DAPI (4',6-Diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid) utspädd i ett spädningsmedium 1:1 000. Förvaras i 10 minuter i rumstemperatur för inkubation.
- Upprepa steg 3.5.2.
- Lägg till monteringsmedium och täck med täckglaset. Fäst objektglasen med genomskinligt nagellack när de är torra (ungefär efter 8-12 timmar).
- Bild med konfokalmikroskop eller annat fluorescensmikroskop. Göra översiktsbilder såväl som detaljerade bilder av subcellulära strukturer som fångar de viktigaste egenskaperna hos organoidmorfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter inledande dissociation, filtrering och räkning av vävnad sås cellerna parallellt direkt i 3D-format, som förklarats ovan, samt suspensionen i kolven för kort 2D-expansion. I vissa fall påverkar den transienta 2D-expansionen organoidbildningen positivt, och den långsiktiga linjen etableras framgångsrikt via denna väg medan jämförande parallell 3D-sådd kan resultera i tillväxtstopp (Figur 1). För varje donatorvävnad som bearbetas testas cellerna enligt mediamatrisen. I enlighet med denna strategi innehåller vår biobank nu linjer som är representativa för varje standardtillväxttillstånd som visas i figur 2. Genom strikt implementering av denna miniscreeningplattform för att testa olika medier och såddsätt, har vi framgångsrikt genererat organoidlinjer från olika histologiska typer och stadier av sjukdomsutveckling av äggstockscancer (Figur 3) av primära höggradiga serösa, postneoadjuvanta intervalloperationer och från återkommande sjukdomar. Fenotypisk karakterisering av organoidlinjerna genom immunofluorescensfärgning av huvudmarkörer i jämförelse med föräldravävnad visar på ett övertygande sätt att kännetecken för epiteltumörkompartment bevaras i organoidmodellen: epitelarkitektur och vidhäftning markerad av (EpCAM), härstamningsidentitet (PAX8) och typisk TP53-punktmutation som är karakteristisk för HGSOC som leder till ackumulering i kärnan (Figur 4).
Några viktiga metodologiska punkter ska också beaktas för effektivt beslutsfattande vid organoid biobankning. Organoidernas tillväxtpotential bestäms inte bara av ökningen av organoiddiametern. Dessutom bestämmer fenotypiska egenskaper expansionspotentialer som färg, mörker och konturintegritet. Bildandet av cytoplasmatiska stressvakuoler indikerar suboptimala förhållanden. Initiala problem med avseende på tillväxt och organoidbildande potential kan uppstå på grund av olämpliga transportförhållanden och fördröjning av vävnadsprocession. Eftersom en hög interindividuell variabilitet i expansionspotential observeras inom tumörlinjerna, rekommenderar vi att du väntar minst 14 dagar innan du fattar ett slutgiltigt beslut om tillväxtpotentialen. Om liknande tillväxtmönster initialt observeras i olika medier bör flera förhållanden utökas. Enligt vår erfarenhet är en tydlig distinktion av långsiktig stabil tillväxtpotential ofta möjlig först efter odling i flera veckor eller månader.
Figur 1: Fördelar med kortvarig sådd i 2D av primära isolat för efterföljande organoidgenerering. (A) Schema över försöksupplägget som visar tvåvägs, parallell såddstrategi: 2D/3D och direkt 3D-sådd i fyra olika medier. (B) Bild av vidhäftande primära isolat före trypsinisering och 3D-överföring. (C) Ett exempel på den primära fyndigheten där parallell sådd avslöjade den tydliga fördelen med 2D/3D-vägen eftersom långsiktig organoidexpansion endast var möjlig från progenitorer som initialt isolerades på plast. Den övre vänstra bilden visar en 3D-kultur 7 dagar efter isolering vid passage 0 (kallad P0) med otillräcklig organoidbildning efter den första passagen (kallad P1) på den nedre vänstra bilden. Efter 2D-sådd på plast (se figur 1B) följt av överföring till en 3D-kultur är en bättre organoidbildning redan uppenbar vid P0, medan långsiktig expansionspotential bekräftas vid passage 4 (P4). Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Patientspecifikt mediebehov. Exempel på fyra olika långsiktigt stabila expanderade linjer som var och en växer i olika medier. Skalstapel = 500 μm. Förkortningar: OCM = medium för äggstockscancer; henne = heregulin 1β; HGSO = höggradig serös äggstockscancer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Organoidgenerering från alla stadier av sjukdomen. Bilder av långvarigt stabila expanderande linjer, från höggradig serös och låggradig serös äggstockscancer i primär sjukdomspresentation, från intervallkirurgi (postneoadjuvant kemoterapi) och från återkommande cancervävnad. Skalstapel = 500 μm. Förkortningar: HGSOC = höggradig serös äggstockscancer; LGSOC = låggradig serös äggstockscancer; NACT = neoadjuvant kemoterapi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Nära överensstämmelse mellan fenotyp av organoider och modercancervävnad. Konfokalbilder av immunofluorescensfärgning av (A) cancervävnad och (B) parad organoidlinje visar mycket hög likhet i färgningsmönster och uttrycksnivå för alla markörer, EpCAM (grön), PAX8 (röd), TP53 (magenta). Skalstapel = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammansättning av de medier och den rötningsblandning som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det utformade protokollet adresserar tidigare utmaningar med organoidbiobankning av äggstockscancer med avseende på organoidbildning och långsiktig passagepotential och säkerställer generering av fullt expanderbara linjer från majoriteten av solida tumöravlagringar. Den kirurgiska insamlingsprocessen av tumörprover som ska användas för organoidgenerering påverkar avsevärt avkastningen och expansionspotentialen. Tumörvävnadsprover kan erhållas under olika procedurer, inklusive multivisceral kirurgi, diagnostisk laparoskopi eller biopsi. Den erfarna gyneko-onkologiska kirurgen bör prioritera att få rena tumörprover från peritoneala platser. Framför allt har det observerats att makroskopiskt nekrotiska områden i stora tumöravlagringar är mindre lämpliga för framgångsrik generering av organoidkulturer. Eftersom provernas renhet är avgörande för att återspegla molekylära och fenotypiska egenskaper för nedströmsapplikationer, krävs synkroniserade insatser från både det kliniska teamet och laboratorieteamet för optimal biobankning, vilket säkerställer att linjerna skapas från de mest relevanta regionerna i tumören.
Även om detta protokoll täcker variationer i tillväxtfaktorberoenden som vi har observerat under 2 års biobankning, är det tydligt att ytterligare förfining är motiverad för att ytterligare öka effekten eftersom vi fortfarande inte observerade någon organoidtillväxt i 20 % av fallen och antalet linjer som visade begränsad expansionspotential tydde på suboptimalt bibehållande av stam. Även om vår organoida biobank för närvarande endast innehåller äggstockscancerprover med serös histologi (HGSOC och LGSOC), uppvisade vår erfarenhet av prover från olika epitelial äggstockscancerhistologier före det strukturerade biobanksprogrammet jämförbara framgångsfrekvenser utan specifika skillnader. Noterbart är att majoriteten av epitelial äggstockscancer subtyper delar en liknande kolumnär pseudostratifierad morfologi med vävnader som utvecklats från Müllerska kanalen (äggledare, livmoder, livmoderhals) medan däremot äggstocksepitelet i sig härstammar utvecklingsmässigt från genitala åsen och mesonefros, och är täckt med ett enda lager kuboidalt epitel. Eftersom utvecklingsvägar som reglerar epitelhomeostas har en central roll i kontrollen av adulta stamcellers potential, bör skillnaderna i embryonalt ursprung beaktas vid utveckling av protokoll för biobankning av organoider. Således tror vi att stamceller från äggstockens yta sannolikt kräver organspecifika odlingsförhållanden för att upprätthålla långsiktig stabil tillväxt.
I vårt laboratorium har protokollet visat sig vara framgångsrikt även för postneoadjuvanta äggstockscancerprover, även om den neoadjuvanta kemoterapin påverkar cellviabiliteten och vävnadsfenotypen. Dessa prover uppvisar mer skräp och extracellulära vävnadsaggregat jämfört med prover som härrör från kemoterapinaiv vävnad från primära debulkingoperationer som kan påverka organoidbildningspotentialen. I dessa fall upplevde vi att en lämplig mängd kirurgisk vävnad och strikt följsamhet till de rekommenderade transportförhållandena är avgörande för framgångsrik organoidgenerering, eftersom de post-neoadjuvanta proverna kan vara känsligare.
Ett mycket intressant fenomen av den gynnsamma effekten av kort expansion på plast i 2D av nyligen isolerade progenitorer på efterföljande organoidtillväxt, som vi upprepade gånger har observerat och därför inkluderat i det standardiserade experimentella förfarandet, är ett viktigt tillägg till metodiken för forskningsområdet cancerorganoider, som till stor del förlitar sig på direkta såddstrategier. Det är frestande att spekulera i att progenitorernas känslighet efter enzymatisk nedbrytning och tillväxtfaktorernas förmåga att prima dem på ett adekvat sätt kan vara de underliggande mekanismerna bakom denna skillnad, som i vissa fall är en avgörande faktor om linjen kan fastställas. Det behövs dock mer forskning för att fastställa tydliga beroenden.
För att möta de utmaningar som hög celladhesion och funktionella korsningar i 3D-äggstockscancerorganoider, som är svåra att smälta, kan en kombination av mekanisk och enzymatisk dissociation med nål och spruta hjälpa när stora klumpar kvarstår efter trypsinisering. Att experimentera med olika enzymatiska betingelser kan leda till ytterligare förbättringar.
Efter långtidslagring kan organoidlinjer tinas upp och odlas enligt försöksdesignen och användas för efterföljande tillämpningar. Detta möjliggör tillgång när som helst till redan genererade organoidlinjer för specifika forskningsändamål och är särskilt intressant för att undersöka det långsiktiga beteendet hos vissa linjer mot bakgrund av patientens sjukdomsprogression. Kryokonservering av äggstockscancerorganoider är dock fortfarande en utmaning. Temperaturvariationer under frys- och upptiningscykler kan negativt påverka organoidens livskraft, funktionalitet och expansionspotential. Långtidslagring är mer stabil i flytande kväve, där mycket låga temperaturer minimerar risken för nedbrytning så att organoidernas integritet kan bibehållas. Kontinuerlig optimering är dock motiverad för att upprätta konsekventa procedurer för frysning, lagring och upptining, för att ytterligare förbättra dessa processer.
Trots de nämnda utestående problemen visar detta protokoll förmågan att konsekvent generera stabila organoidlinjer från solida tumörprover från patienter med äggstockscancer. I vårt laboratorium har vi hittills bearbetat 120 vävnadsprover från primär äggstockscancer och uppnått framgång i cirka 50 % av fallen, inklusive ett brett spektrum av histologiska subtyper och stadier av sjukdomen med primär debulking, återkommande sjukdom och postneoadjuvanta kirurgiska prover. Genom att tillhandahålla ett strukturerat ramverk för generering av organoider som härrör från olika patientprover, parallell sådd i olika medier och implementering av olika såddstrategier, ger detta protokoll en möjlighet att bedöma individuella skillnader i stampotential, vilket ger ytterligare information om tumörbiologi. Såvitt vi vet följer de allra flesta studier vanligtvis det omvända tillvägagångssättet att testa mediekomponenterna på ett litet antal prover och för enkelhetens skull välja mestadels ett optimalt medium. Vår systematiska testning av effekten av HER1ß, effekten av RSPO1- och FGF10-tillskott och 2D/3D-sådd visar slutgiltigt att äggstockscancervävnad har en viss interpatientvariabilitet i stamegenskaper, och det optimala mediet är verkligen patientspecifikt. Därför är systematisk parallell testning av olika mediesammansättningar som ger olika exogena parakrina signalmiljöer avgörande.
Att etablera en levande biobank med en omfattande panel av organoider som härrör från olika äggstockscancerpatienter tillsammans med deras prospektivt insamlade kliniska information, fungerar som en värdefull resurs för ett brett spektrum av forskningstillämpningar och återspeglar det heterogena kliniska landskapet som potentiellt är tillämpligt på en större patientpopulation17. Långtidsodling och kryokonservering möjliggör experimentell konsistens och upprepad tillgänglighet av samma organoidlinje över tid, vilket fungerar som bas för longitudinella experimentella designer med oförändrade tumörlinjecellulära egenskaper.
Genom att bibehålla epitelarkitektur och polarisering är organoidlinjerna en adekvat modell för att studera cell-cellkommunikation och kontextberoende beslutsfattande om cellens öde medierat av parakrina signalvägar. Inbäddning av organoiderna i den histologiska gelen är ett praktiskt och effektivt mellansteg för att undvika förlust av material efter fixering och säkerställer att nedströmsbearbetning (inbäddning i paraffin och snittning) kan utföras parallellt med vävnadsprover. Förlusten av organoider under fixeringsproceduren är en kritisk fråga när antalet organoider är mycket begränsat. Denna förlust kan dock motverkas genom att grundligt avlägsna organoiderna från den extracellulära matrisen genom att tvätta i ett kallt basalodlingsmedium och genom att slå samman minst två fullvuxna brunnar av en 24-hålsformatplatta före fixering. Immunofluorescensfärgningsprotokollet gör det möjligt för högupplöst konfokalavbildning att motsvara molekylära och fenotypiska egenskaper hos äggstockscancerorganoiderna med modertumörvävnaden, men är också ett värdefullt verktyg för att studera det cellulära svaret på kemiska föreningar eller karakterisering av genetiskt modifierade linjer. Metoden är också lämplig för histologisk färgning utan några specifika modifieringar. Beroende på syftet med studien bör tunnare sektioner skurna med en mikrotom (2-3 μm) övervägas.
Det är viktigt att notera att stabil långtidsodling är en förutsättning för genredigeringsexperiment och funktionella analyser av läkemedelsrespons och resistens mot nya och standardterapier17,21. I synnerhet organoider som genereras från återbiopsier som utförs under sjukdomsprogression och återfall, erbjuder möjligheten till direkta jämförande analyser mellan den terapinaiva ursprungliga tumören och de nyförvärvade egenskaperna som observerats under återfall. Identifiering av patientspecifika behandlingssvar och bildandet av terapiresistens in vitro främjar området precisionsmedicin inom äggstockscancerforskning21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.K. är listad som uppfinnare på ett patent relaterat till ett medium för äggstockscancerorganoider. F.T. erhöll forskningsfinansiering, advisory board, arvoden och resekostnader från AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics och Tesaro/GSK. S.M. erhöll forskningsfinansiering, advisory board, heders- eller resekostnader: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Acknowledgments
Studien finansieras av det tyska cancerforskningscentret DKTK, partnersite Munich, ett partnerskap mellan DKFZ och Universitetssjukhuset LMU München. Studien stöds också av det tyska cancerbiståndet (#70113426 och #70113433). Paraffininbäddning av vävnad och organoider har utförts vid Core facility of the Institute of Anatomy, Faculty of Medicine, LMU München, München. Konfokal avbildning har utförts vid Core faciliteten Bioimaging vid Biomedicinskt Centrum (BMC). Författarna vill tacka Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink och Martina Rahmeh för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021).
- Thermo Scientific. Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
