Factor de crecimiento-Coated colocación de bolas de explantes cerebro anterior dorsal

Entonces, estas son el primer tipo de perlas que usaré. Son perlas de gel azul. Son suaves.

Así que necesito usar una pipeta de vidrio agrupada en el extremo de una pipeta de boca para colocar estas perlas sobre las X. El segundo tipo de perla que demostraré son perlas de acrílico con heparina. Son un tipo rígido de perla, y colocaré estas perlas sobre explantes X utilizando una aguja de tungsteno. Estos son los tubos capilares de vidrio que primero fundiré usando el mechero Bunsen.

Luego los jalaré para crear una punta más fina. Así que sostengo el tubo capilar en el centro de la llama y lo giro mientras el tubo se derrite. Puedo sentir que se vuelve blando.

Lo sacaré de la llama y luego lo estiraré. Voy a rayar una línea a través del tubo capilar con este bolígrafo con punta de diamante para poder hacer un corte recto y limpio. Luego puliré los extremos con la llama para limpiarlos.

Voy a pasar el capilar por la llama para pulir el extremo y reducir la abertura, de modo que pueda capturar una perla en lugar de permitir que esta atraviese el capilar. Es importante tener en cuenta que no se debe mantener el tubo capilar en la llama durante mucho tiempo. En realidad, es un paso muy rápido, ya que de lo contrario se sellaría.

Normalmente preparo varios de estos porque muchos terminan con la punta sellada por la llama. Es difícil de controlar, así que simplemente se preparan varios. Este es un ejemplo de uno en el que la punta ha quedado sellada.

Este es un ejemplo de una buena pipeta. He pipetado 250 microlitros de las perlas agel en este tubo einor, y las voy a lavar cinco veces con un mililitro de PBS para eliminar la solución azi en la que estaban en remojo. Esperaré aproximadamente tres minutos para permitir que las perlas sedimenten y luego aspiraré el exceso de PBS, repitiendo este paso cuatro veces más.

Las perlas aún no se han asentado del todo, así que esperaré a que se asienten y voy a aspirar el exceso de PBS y repetiré este paso cuatro veces. Al final, añadiré 300 microlitros de PBS y comenzaré a trabajar con las perlas. Esta es una pipeta oral estándar y simplemente voy a tomar el capilar que preparé e introducirlo aproximadamente un tercio del camino hacia arriba.

Primero, llene las pipetas con PBS. Normalmente se llenan simplemente por acción capilar. Esta es la tapa de una placa de cultivo de 30 milímetros y he colocado una gota de microesferas en azul.

Y junto a ella hay una pequeña gota de PBS. Y en este platillo hay gotas de cinco microlitros de solución proteica. En este caso, es B y P cuatro, pero se podría usar una proteína de elección mediante la pipeta bucal.

Voy a transferir una perla desde este círculo azul aquí, enjuagarla una vez en la gota de PBS. Luego tomaré la perla con la pipeta de boca y la colocaré en la gota de solución de proteína e incubaré ya sea a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora o a cuatro grados durante varias horas. Aquí ven un grupo de perlas en PBS y necesito seleccionar perlas que tengan el tamaño adecuado.

Si son demasiado pequeñas, simplemente pasarán a través de la pipeta de boca. Deben quedar justo en el extremo. Así que ahora puede ver que he seleccionado algunas cuentas allí, tres cuentas más grandes y tres más pequeñas.

Utilizaré las cuentas más grandes en el experimento. Ahora voy a transferir una cuenta grande desde la gota de PBS hacia la gota de solución proteica. Para hacerlo, voy a retirar suavemente mi lengua del pipeta bucal.

No es un movimiento de succión, sino simplemente aplicar algo de presión negativa. Luego lo voy a transferir y básicamente colocar mi lengua nuevamente sobre la boca. Cabeza del tubo, sin soplar, pero agregando algo de presión positiva para empujar la partícula hacia fuera del extremo.

Ahora tengo cinco perlas en la gota de solución de proteína, y las incubaré a cuatro grados durante varias horas, o alternativamente a temperatura ambiente durante media hora hasta una hora. Esta es la placa de cultivo que contiene la membrana que flota en el medio junto con las berenjenas que ya he diseccionado. Voy a tomar la punta de mi pipeta y aspirar algo del medio.

Voy a enjuagar las perlas en una gota de medio solo una vez, inmediatamente antes de colocar la perla sobre el X explan. Estas son las agujas de tungsteno que utilizaré para recoger y colocar las perlas de acrílico. Esta es la aguja de tungsteno y ahora está en su soporte.

Y estas son unas pinzas finas. En un ángulo de 45 grados. Voy a usar mi aguja de tungsteno sostenida con las pinzas para levantar una perla de esta solución de PBS y transferir la perla hacia una gota de solución proteica.

Al igual que hice con las perlas de agel. Como con las perlas de agel, he lavado estas perlas acrílicas cinco veces en PBS y transferido una gota a esta placa. Luego voy a usar mi aguja de tungsteno en pinzas para transferir una perla a una gota de proteína e incubar tal como hice con las perlas de gel.

Así que se trata de levantar la perla. Mantengo mi mano derecha firmemente apoyada sobre la mesa y uso el dedo índice izquierdo para sostener la aguja mientras bajo al fluido; toco ligeramente una perla con la aguja y la levanto lentamente fuera del fluido. A veces se cae de la aguja, así que simplemente regrese a tomar otra.

Ahora, con mi mano izquierda, tengo la pinza en ángulo de 45 grados. Con las puntas hacia abajo, toco la perla y la aguja al fluido y uso. Utilice la punta de la pinza para presionarla suavemente y separarla.

Entonces, ahora tengo cinco perlas con proteína. Bien, con mi mano derecha tengo la aguja de tungsteno en la perla, y con mi mano izquierda las pinzas nuevamente, con la punta hacia abajo, de la misma manera que las empujo hacia afuera. Las cuatro, lo haré de nuevo aquí en el x explan. Incubar a 37 grados y el tiempo depende del ensayo específico.