Name: La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Aprende a monitorear el autoensamblaje de nanocomplejos de ADN en tiempo real mediante QD-FRET y microfluídica. Este método integra puntos cuánticos y canales microfluídicos para estudiar poliplexos polielectrolíticos con aplicaciones en terapia génica.

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El apoyo financiero proporcionado por el NIH subvención HL89764, subvenciones NSF 0546012, 0730503 y 0725528.

A. biotinilación de ADN ADN plásmido se biotinilado covalentemente con las etiquetas de biotina guanina específicas como se describe por el fabricante (Mirus Bio, Madison, WI), pero a escala para que las etiquetas de ~ 1-2 biotina por ADN. ADN plásmido (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) fue etiquetado en este protocolo. <ol><li> Disolver la cantidad deseada de pDNA en buffer TE de DNasa y RNasa libre (biología molecular, grado de calidad) de agua para hacer una solución de ADN 1μg/μL. </li><li> Llevar a cabo la reacción de marcaje con las mezclas de reacción siguiente. Añadir la etiqueta lo último reactivo. </li></ol> Para la reacción de ADN 100 microgramos: <table border="1"><tbody><tr><td> Libre de DNasa y RNasa libre de agua </td><td> 75 l </td></tr><tr><td> Buffer 10X Un etiquetado </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> 1μg/μL ADN </td><td> 100 L </td></tr><tr><td> Etiqueta de TI reactivo </td><td> 5 l </td></tr><tr><td> Volumen Total </td><td> 200 l </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Incubar la reacción a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Purificar la muestra marcada por el etanol o isopropanol precipitación siguiendo protocolos estándar. </li></ol> Nota: Las columnas de filtración en gel base puede conducir a la absorción UV de alta o de fluorescencia de fondo, que puede afectar a la cuantificación del ADN o la caracterización de fluorescencia. Nota: El nivel de biotinilación puede ser determinado por las pruebas basadas en HABA. B. Etiquetado de los polímeros catiónicos Cy5- Quitosano (390 kDa, 83,5% desacetilado, Vanson, Redmond, WA) fue utilizado como un polímero catiónico modelo en este estudio. Las aminas primaria gratuita en la red troncal de polímero quitosano se marcaron con Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). <ol><li> Para facilitar la conjugación completa de tinte Cy5, calcular la cantidad necesaria de Cy5-NHS de tal manera que la proporción molar de Cy5: aminas primarias es de 1: 200. </li><li> Ajustar el pH de la solución de quitosano (en tampón acetato 25 mM) a ~ 6,5 por adición de NaOH. Tenga en cuenta que la reacción del NHS es más eficiente a pH básico, pero la solubilidad del quitosano aquí limita el rango de pH de trabajo. </li><li> Mientras se agita, se añade lentamente la cantidad calculada de Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) a la solución de quitosano en forma gota a gota. </li><li> Agite la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Para purificar, diálisis con 10k MWCO Slide-A-Lyzer (Pierce) durante 2 horas contra tampón acetato 1% a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Vuelva a colocar buffer y otra diálisis de 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Vuelva a colocar buffer y diálisis durante la noche a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Tienda purificada polímero marcado a -20 ° C. </li></ol> Nota: En este estudio, una curva estándar se construye mediante la medición de la intensidad de emisión de Cy5-NHS éster a 670 nm. Caracterizar la densidad de etiquetado a través de la medición de la emisiones que se obtengan a 670 nm de Cy5 marcado con quitosano en la curva estándar. Absorbancia también se puede utilizar para determinar el etiquetado de eficiencia, pero no se realizó aquí. C. Preparación de QD-ADN marcado y Cy5 polímeros La relación molar de pDNA a QD se mantuvo en exceso (pDNA: QD ≈ 1: 2) para asegurar la conjugación completa de los puntos cuánticos de pDNA. El número de puntos cuánticos etiquetados en cada pDNA se puede estimar a través de TEM imágenes u otros recursos equivalentes. En nuestro estudio, el número de puntos cuánticos por pDNA se estima en ~ 3.1 por TEM y espectroscopia de moléculas individuales. Use un Millipore Milli-Q agua gradiente (&gt; 18,0 MW, 0.2um filtrados) durante la preparación. <ol><li> Calcular la cantidad necesaria de quitosano para 10μg pDNA según deseada N / P, la relación teórica de aminas protonadas en la solución de quitosano a los fosfatos negativos en la solución de ADN. </li><li> Añadir estreptavidina-funcionalizados 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) en la solución de biotina pDNA. </li><li> Incubar la solución a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. </li><li> Agregue el QD-ADN marcado en 50 mM solución de sulfato de sodio para hacer el volumen final de 200μL. </li><li> Diluir Cy5-quitosano, según deseada N / P, con agua Milli-Q para hacer que el volumen final de 200μL. </li></ol> Nota: Mantenga la reacción en la oscuridad para evitar photobleaching posible. Importante: Tenga cuidado al utilizar el Qdot 605 ITK ™ estreptavidina conjugada (la serie CTI), como puntos cuánticos en este catálogo están diseñados con el propósito de FRET. La serie Qdot regulares se conjugan con una capa de PEG para evitar la unión no específica, especialmente para el etiquetado de celular. Sin embargo, esta capa adicional amplía la distancia donador-aceptor, lo que resulta en rrelucida la eficiencia de transferencia de energía. D. La fabricación de la SU-8 Masters usando fotolitografía estándar <ol><li> Oblea de silicio se pirañas limpia y al horno a 200 ° C durante 5 min. </li><li> Por el espesor de 25μm maestro designado, capa fotosensible girar la negativa (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) en la oblea de Si a 2000 rpm durante 30 segundos. </li><li> Soft hornear la oblea en una placa con una rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Exponga a la luz UV (365 nm) para 250mJ/cm 2 a través de una máscara de la película (CAD / Servicios de arte, Bandon, Oregón) que contiene el diseño de microcanales. </li><li> Después de la exposición hornear la oblea en una placa con una rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Desarrollar la oblea con SU-8 desarrollador fotosensible. </li><li> La oblea patrón es difícil al horno en una placa con una rampa de 65 ° C / hr a 200 ° C. Mantener la oblea a 200 ° C durante al menos 5 horas, luego se enfrían gradualmente la oblea a temperatura ambiente. </li></ol> Importante: rampa gradual durante el SU-8 proceso de cocción maestro es necesario, de lo contrario el SU-8 puede separarse de la estructura de la oblea de silicio o grietas en la estructura de SU-8 puede ser inducida por el estrés de liberación. E. Replica Moldeo por inyección de PDMS de los maestros y la vinculación a la tapa de vidrio <ol><li> El maestro de SU-8 se coloca en un recipiente pesado. </li><li> Mezcla de silicona y elastómeros agente de curado (poli (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) en un 10: 1 relación. </li><li> Vierta la mezcla de PDMS sobre el SU-8 maestros y abandonar el barco con un peso de un secador de vacío para eliminar las burbujas. </li><li> Curar el PDMS a 65 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Pelar la franja de PDMS del molde maestro Si. </li><li> Golpe canal entradas y salidas del dispositivo de simulación. </li><li> Limpie la tira de PDMS y cubierta de vidrio con etanol y secar al aire. </li><li> El tratamiento de la limpieza PDMS tira y cubierta de vidrio con plasma de oxígeno (20 W para 1 minuto). </li><li> Inmediatamente de bonos de la franja de PDMS con cubierta de vidrio. </li><li> Deje el chip de microfluidos en condiciones de servidumbre en el horno a 95 ° C durante la noche. </li></ol> Importante: El tratamiento de plasma y hornear durante la noche son esenciales para la resistencia de unión mejorada. F. Monitor de la formación de ADN Nanocomplexes En el dispositivo de microfluidos <ol><li> Llene el canal de microfluidos con agua (para asegurar que no haya burbujas en el canal de microfluidos), antes de cargar los reactivos para asegurar el flujo suave durante el experimento. </li><li> Cargar el ADN QD-etiquetado y marcado con Cy5 soluciones de quitosano en dos jeringas de vidrio individuales, a través de la tubería se describe en el vídeo. </li><li> Conecte el tubo con las dos entradas de dispositivos de microfluídica. Tenga cuidado de no introducir aire durante el proceso. Establecer la velocidad de flujo en 20nL/min (PHD-2000 bomba de jeringa, Holliston, MA), bajo condiciones de flujo laminar. </li><li> Compruebe los microcanales bajo el microscopio. </li><li> Cuando el flujo es estable (~ 15 a 20 minutos), QD mediada por FRET deben ser observadas en el centro del canal. </li><li> Tome fotografías de fluorescencia (CCD enfriado, Qimaging, BC, Canadá) en diferentes lugares a lo largo del canal. </li><li> Analizar las imágenes de fluorescencia con ImageJ y OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. QD-FRET proporciona una indicación sensible de la aparición de Nanocomplexes ADN de auto-ensamblaje <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Puntos cuánticos mediada por la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET-QD) puede proporcionar una indicación cuantitativa y muy sensible de la estabilidad Polyplex en entornos de extra-o intra-celular, que permite la detección inequívoca de la aparición de las interacciones entre el ADN y el portador del gen. La pareja FRET, 605QD y Cy5, fue elegido basado en la maximización de solapamiento espectral entre el donante y el receptor y minimizar los posibles cross-talk. Para esta pareja, la distancia de Förster es 69.4Å 3. </li><li> Auto-ensamblaje de la nanocomplexes ADN QD-FRET. ADN plásmido aniónicos (pDNA) y el portador del gen catiónico se marcaron con QD (donante de energía) y Cy5 (aceptor de energía), respectivamente. QD-FRET nanocomplexes se formaron a través de coacervación compleja electrostática. A la excitación a 488 nm, QD-FRET mediada Cy5 emisiones indicó la formación de un nanocomplex compacto e intacta. El tiempo de residencia (R t) se puede calcular de acuerdo a la distancia (x), que mide desde donde las dos corrientes se encuentran en la posición de la reacción que se investiga, y la velocidad media del flujo (v). Debido a la naturaleza del flujo laminar, la mezcla sólo se lleva a cabo en la interfaz (el centro de cada imagen), lo que permite calcular de forma precisa el transporte de masa en función de t R. Resolución temporal puede ser ajustado por la variación de la applied caudales. (Recuadro) FRET mediada por la señal se observó inmediatamente en la interfaz cuando las dos corrientes se reunieron, lo que indica que la unión fue rápida, que ocurre dentro de unos pocos milisegundos de acuerdo con los caudales aplicados. Barra de escala: 100μm. </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<ul><li> Importancia de nuestro trabajo: <ol><li> Este es el primer intento de controlar poliméricos ADN nanocomplex de auto-ensamblaje cinética en tiempo real (resolución de milisegundos) a través de QD-FRET respuestas dentro de un chip de microfluidos sencillos. </li><li> QD mediada por FRET proporciona una indicación muy sensible y cuantitativo de la aparición de las interacciones moleculares y en todo el proceso de auto-ensamblaje, mientras que microfluidos ofrece un microambiente bien controlados para analizar espacialmente el proceso durante la síntesis de ADN nanocomplex. </li><li> La integración de la microfluídica y nanofotónica sugiere un enfoque nuevo e interesante para investigar cualquier tipo de reacciones de complejos. </li><li> El resultado de QD-FRET nanocomplexes ADN poliméricos podría ser fácilmente aplicada para el establecimiento de relaciones estructura-función. 1,2 </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>ADN plásmido</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4,9 kb, PM = 3,3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin Labeling Kit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>El protocolo estándar produce una eficiencia de marcado de aproximadamente una etiqueta cada 20-60 pb de ADN bicatenario; en este trabajo se ajustó la densidad de marcado.</td></tr><tr><td>Estreptavidina 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin Conjugate</td><td></td></tr><tr><td>Éster de NHS-Cy5</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Quitosano</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>Desacetilado al 83,5 %</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1; Tamaño: 40 x 22 mm</td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio hermética</td><td>Hamilton Co</td><td>Serie TLL</td><td>50&amp;#x03BC;L a 500&amp;#x03BC;L según el volumen de la muestra</td></tr><tr><td>Tubo Tygon</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0,02 ID, 100 pies</td><td>Tubos Tygon Microbore, 0,02 ID, 100 pies</td></tr><tr><td>Conector</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>Personalizado en longitud de 0,750&quot;</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensificado Retiga Refrigerado</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>Lámpara de arco de mercurio de 100 W</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Versión estudiantil</td><td></td></tr><tr><td>Juegos de filtros para microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Filtro de excitación en ambos canales</td></tr><tr><td>Juegos de filtros para microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>Filtro de emisión en el canal 605QD</td></tr><tr><td>Juegos de filtros para microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>Filtro de emisión en el canal QD-FRET</td></tr><tr><td>Juegos de filtros para microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>Dicroico de paso largo en el canal 605QD</td></tr><tr><td>Juegos de filtros para microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>Dicroico de paso largo en el canal QD-FRET</td></tr></tbody></table>

la combinación de qd-fret y microfluídica para monitorear nanocomplex adn auto-ensamblado en tiempo real

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Los avances en genómica continuará impulsando el desarrollo de terapias que pueden dirigirse a la patogénesis a nivel celular y molecular. Por lo general funcional dentro de la célula, basadas en ácidos nucleicos terapéuticos requieren un eficiente sistema de suministro intracelular. Un enfoque ampliamente adoptado es el ADN complejo con un portador del gen para formar nanocomplexes electrostática a través de auto-ensamblaje, facilitando la captación celular de ADN, mientras que lo protege contra la degradación. El desafío radica en el diseño racional de los portadores del gen eficiente, ya que la disociación prematura o excesivamente unión estable sería perjudicial para la captación celular y la eficacia terapéutica. Nanocomplexes sintetizado por el volumen de mezcla mostró una amplia gama de comportamiento intracelular desembalaje y el tráfico, que se atribuyó a la heterogeneidad en el tamaño y la estabilidad de nanocomplexes. Esta heterogeneidad dificulta la evaluación precisa de la cinética de auto-ensamblaje y se suma a la dificultad en la correlación de sus propiedades físicas a las eficiencias de transfección o bioactividad. Se presenta una nueva convergencia de la nanofotónica (es decir, QD-FRET) y microfluídica para caracterizar la cinética en tiempo real de la nanocomplex auto-ensamblaje bajo flujo laminar. QD-FRET proporciona una indicación muy sensible a la aparición de las interacciones moleculares y medida cuantitativa de todo el proceso de síntesis, mientras que microfluidos ofrece un microambiente bien controlados para analizar espacialmente el proceso con una alta resolución temporal (~ milisegundos). Para el sistema de modelo de nanocomplexes poliméricos, dos etapas distintas en el proceso de auto-ensamblaje fueron capturados por esta plataforma analítica. El aspecto cinética del proceso de auto-ensamblaje obtenido en la microescala sería especialmente valioso para microreactor basada en las reacciones que son relevantes para muchas aplicaciones de micro-y nano-escala. Además, nanocomplexes puede ser personalizado mediante un diseño adecuado de los dispositivos de microfludic, y el resultado QD-FRET nanocomplexes polímeros de ADN pueden ser fácilmente aplicada para el establecimiento de relaciones estructura-función.

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Los avances en genómica continúan impulsando el desarrollo de terapias capaces de atacar la patogenia a nivel celular y molecular. Por lo general...

Este procedimiento comienza con la marcación del ADN y del polímero para generar una perla de ADN plasmídico QD fret. El ADN se conjuga con puntos cuánticos, que actúan como donador de energía, y el polímero iónico se marca con un colorante orgánico flora cuatro sci cinco, que actúa como aceptor de energía.Al mezclar el sistema QD fret, se forman complejos nano mediante autoensamblaje electrostático y la señal de transferencia de resonancia de energía por fluorescencia (fret) mediada por puntos cuánticos (QD) puede seguirse a medida que ocurre la interacción. Este sistema QD fret se introduce en un canal microfluídico donde los componentes solo interactuarán mediante difusión en la interfaz de mezclado. El autoensamblaje del complejo nano de ADN puede entonces monitorearse mediante la combinación de QD fret y microfluídica.Hola, soy Megan Ho del laboratorio de Bios y dinámica de moléculas individuales del Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad Johns Hopkins. Hoy les mostraré un procedimiento para combinar amenazas cuánticas y microfluídica con el fin de monitorear la autoensamblaje de clavos de ADN en tiempo real. En nuestro laboratorio, utilizamos este procedimiento para estudiar complejos de DNNL destinados a la terapia génica.Así que comencemos. Se utiliza un kit de etiquetado con biotina de MIRIs bio para etiquetar covalentemente el ADN plasmático con etiquetas de biotina específicas para guanina, pero ajustado para tener aproximadamente una a dos etiquetas de biotina por molécula de ADN. Para empezar, disuelva la cantidad deseada de ADN plasmático en tampón TE para obtener una solución de ADN de un microgramo por microlitro.Prepare la reacción de etiquetado mezclando el ADN libre de plasma, agua libre de ARN, tampón de etiquetado 10x A y el reactivo de etiquetado. El reactivo de etiquetado se añade al final. Incube la reacción a 37 grados Celsius durante una hora.Después de la incubación de una hora, purifique la muestra marcada mediante precipitación con etanol. Siguiendo protocolos estándar. Almacene el ADN marcado a menos 20 grados Celsius hasta su uso.El siguiente paso consiste en marcar el polímero catiónico. En esta demostración, utilizaremos quitosano como polímero catiónico modelo y marcaremos las aminas primarias libres en la cadena principal del quitosano con sci-fi NHS. Primero calcule la cantidad necesaria de sci-fi NHS de modo que la relación molar de sci-fi a aminas primarias sea de 1 a 200. Esto facilitará la conjugación completa del colorante sci-fi.Añada hidróxido de sodio a la solución de quitosano en tampón acetato 25 milimolar para ajustar su pH a aproximadamente 6,5. Mientras agita lentamente, agregue la cantidad calculada de sci-fi NHS a la solución de quitosano gota a gota. Cubra el vial con papel de aluminio para mantener la mezcla en la oscuridad y agite a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, purifique la mezcla mediante diálisis con una membrana de 10 K-M-W-C-O de pierce frente a tampón acetato al 1% durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad.Después de dos horas, reemplace el tampón de acetato al 1 % y realice una diálisis durante otras dos horas. A temperatura ambiente y en la oscuridad, vuelva a reemplazar el tampón y realice una diálisis durante la noche a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Al día siguiente, retire el polímero marcado purificado de la cinta de diálisis.El quitosano marcado con SCI cinco se recoge entonces en un tubo de microcentrífuga y se almacena a menos 20 grados Celsius. Añada puntos 6 0 5 funcionalizados con estreptavidina a la solución de ADN plasmático biotinilado. Asegúrese de utilizar la serie ITK de puntos Q desnudos destinados a conjugación, en lugar de la serie regular de puntos Q, ya que los puntos cuánticos de la serie ITK están diseñados para el propósito de FRET.Incube la solución a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mantenga la reacción de etiquetado con puntos cuánticos (QD) en la oscuridad para evitar posible fotoblanqueo. Después de 15 minutos, agregue el ADN marcado con QD a una solución de sulfato de sodio 50 milimolar para obtener un volumen final de 200 microlitros.Para preparar el polímero sci-fi, calcule la cantidad requerida de quitosano para 10 microgramos de ADN plasmático según la relación NP deseada, que es la relación teórica entre los grupos inmunos protonados en la solución de quitosano y los fosfatos negativos en la solución de ADN. Diluya el quitosano sci-fi según la relación NP deseada con agua Milli Q para obtener un volumen final de 200 microlitros. Las soluciones de ADN marcado con QD y quitosano sci-fi ya están listas para cargarse en el dispositivo microfluídico, como se demostrará en la sección seis. La oblea de silicio se prepara previamente mediante limpieza con piraña y secado térmico para eliminar la humedad de la oblea, según el espesor maestro designado de 25 micrones. Aplique la resina fotosensible negativa sobre la oblea de silicio mediante centrifugado a 2000 RPM durante 30 segundos.Hornee suavemente la oblea en una placa caliente con una rampa de 65 grados Celsius por hora hasta 95 grados Celsius. Esto evaporará el disolvente en la fotoresina SU-8 y la solidificará antes de la exposición a la luz ultravioleta.Después del horneado suave, coloque una película de máscara que contenga el diseño de los microcanales sobre la oblea de silicio expuesta a luz ultravioleta a 365 nanómetros durante 250 milijoules por centímetro cuadrado tras la exposición. Hornee la oblea en una placa caliente con un rampa de 65 grados Celsius por hora hasta alcanzar 95 grados Celsius. Revele la oblea utilizando el revelador de resistencia fotográfica SU eight para verificar si el revelado es completo.Sumerja la oblea en alcohol isopropílico. El alcohol isopropílico no debe volverse lechoso. Finalmente, para reforzar la estructura de SU-8, hornee la oblea patroneada en una placa calefactora con un rampa de 65 grados Celsius por hora hasta 200 grados Celsius.Mantenga la oblea a 200 grados Celsius durante al menos cinco horas. Luego, enfríe gradualmente la oblea hasta la temperatura ambiente. Coloque el molde maestro de SU ocho en un recipiente de pesaje.Mezcle el elastómero de silicona y el agente de curado poli(dimetilsiloxano) o PDMS en una proporción de 10 a 1. Vierta la mezcla de PDMS sobre el molde maestro SU-8 y deje el recipiente de pesaje en un desecador al vacío para eliminar las burbujas. Cure el PDMS a 65 grados Celsius durante una a dos horas.Después de que el PDMS se cure, desprenda la tira de PDMS del molde matriz de silicona utilizando un punzón completo, dos entradas de canal y una salida de canal para el dispositivo fluidico. Limpie la tira de PDMS y el cubreobjetos con etanol y luego séquelos al aire. Sometan la tira de PDMS y el cubreobjetos limpios a un tratamiento con plasma de oxígeno a 20 vatios.En primer lugar, una inmediatamente la tira de PDMS con el cubreobjetos. Deje el chip microfluídico unido en el horno a 95 grados Celsius durante la noche. El tratamiento con plasma y la cocción prolongada son esenciales para mejorar la resistencia de la unión.Antes de cargar los reactivos, llene el canal microfluídico con agua para asegurarse de que no haya burbujas en el interior. Esto garantizará un flujo uniforme. Durante el experimento, cargue las soluciones previamente preparadas de QD, ADN marcado y quitosano marcado con sci-fi en dos jeringas de vidrio individuales a través del tubo.Conecte el tubo con las dos entradas del dispositivo microfluídico. Tenga cuidado de no introducir aire durante el proceso. Establezca el caudal a 20 nanolitros por minuto bajo condiciones de flujo laminar.Revise los microcanales bajo el microscopio cuando el flujo sea estable, aproximadamente entre 15 y 20 minutos. Debe observarse el FRET mediado por puntos cuánticos en el centro del canal. Adquiera imágenes fluorescentes en diferentes ubicaciones a lo largo del canal utilizando una cámara CCD refrigerada.Analice estas imágenes con ImageJ y OriginLab. La señal mediada por FRET se monitorea en diferentes posiciones axiales a lo largo del canal. El tiempo de residencia se calcula en función del caudal aplicado utilizando esta fórmula, donde TISA bar es el tiempo de residencia.El tiempo X es la distancia desde donde se encuentran las dos corrientes hasta la posición de la reacción bajo estudio. Y V es la velocidad media del flujo. Los perfiles de intensidad transversales de las señales de sci-fi mediadas por fret pueden entonces analizarse en nuestro sistema.Los perfiles medidos experimentalmente presentan una distribución gaussiana. Acabamos de mostrarle cómo monitorear complejos de ADN en forma de clavo mediante hilo cuántico en un canal microfluídico sencillo. Al realizar estos procedimientos, es importante recordar diseñar una marca en su canal microfluídico para que el tiempo de residencia pueda determinarse directamente a partir del caudal aplicado y la geometría del canal.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Biología

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Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia &gt; 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Utilizando ADN marcado con puntos cuánticos y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, podemos investigar el mecanismo de reacción de las endonucleasas de restricción mientras usamos proteínas no marcadas. Esta técnica de una sola molécula permite la observación masiva y multiplexada de las interacciones individuales proteína-ADN, y los datos se pueden agrupar para generar distribuciones de tiempo de permanencia bien pobladas.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Aprende a monitorear el autoensamblaje de nanocomplejos de ADN en tiempo real mediante QD-FRET y microfluídica. Este método integra puntos cuánticos y canales microfluídicos para estudiar poliplexos polielectrolíticos con aplicaciones en terapia génica.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

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