La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

El objetivo general de este procedimiento es investigar los perfiles de expresión génica que subyacen a numerosos fenotipos o vías metabólicas. Esto se logra primero aislado el ARNm de dos cepas de nematodos contrastantes. El segundo paso del procedimiento consiste en sintetizar ADNc que contenga secuencias de captura SSI tres o SFI y hibridarlas a un microarreglo.

El tercer paso del procedimiento consiste en hibridar el microarreglo con secuencias anti captura que contienen S SI tres y SCIFI fluoro cuatro. El paso final del procedimiento es escanear el microarreglo y analizar los datos utilizando herramientas bioinformáticas como el software magic tool. En última instancia, se identifican los genes candidatos que median el fenómeno biológico bajo estudio y pueden validarse y cuantificarse mediante técnicas alternativas como la PCR en tiempo real.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los nucleótidos impresos no son visibles para el usuario, por lo que es difícil superponer una mezcla de hibridación homogénea sobre los más de 23.000 nucleótidos impresos de forma única. Comience recolectando ARN de nematodos sincronizados sanos. Primero, se lavan y resuspenden en tubos de 15 mililitros, y los pellet de gusanos se resuspenden en siete mililitros de cloruro de sodio 0,1 molar y siete mililitros de sacarosa al 60% peso por volumen, fríos con hielo.

Tras una incubación de 15 minutos en hielo, los gusanos se centrifugan nuevamente. Ahora los gusanos libres de bacterias nadarán hacia arriba, se recogerán, se lavarán con agua libre de RNAsas y se centrifugarán. De nuevo, el pellet limpio y ligeramente compactado se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a velocidad máxima durante 30 segundos.

Aspirar y almacenar en 10 volúmenes de RNA later a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para continuar. Para preparar muestras de ARN total, centrifugar los pellet preparados a velocidad máxima, desechar el sobrenadante y agregar una pizca de resina molecular para molienda al pellet. Luego, congelar la mezcla usando nitrógeno líquido y un pistilo.

Muela la suspensión de gusanos congelada hasta obtener un polvo fino y agrega nitrógeno líquido según sea necesario para mantener el polvo frío después de molerlo. Coloque el extracto en hielo durante cinco minutos. Después de cinco minutos, mezcle el extracto con 700 microlitros de R-L-T-B-M-E y 472 microlitros de etanol al 100% en total.

El ARN ya puede aislarse utilizando un kit disponible comercialmente, obteniendo un volumen final de 60 microlitros de ARN aislado por muestra biológica. Antes de continuar, elimine la posible contaminación con ADN genómico tratando con DNAS one, seguido del uso de un kit de purificación de ARN disponible comercialmente. Complete el procedimiento ajustando el volumen a 60 microlitros.

Finalmente, determine la concentración de ARN y evalúe la integridad del ARN mediante tratamiento con carga de muestra de glioxal, tinción y análisis en gel antes de la hibridación en microarreglo. Mediante métodos convencionales, el ARN purificado se transcribe inversamente a ADN complementario, el cual se purifica a partir de la plantilla degradada utilizando un kit comercialmente disponible y se ajusta a un volumen de 60 microlitros. Comience la hibridación en microarreglo bloqueando la elegancia marina. Incube las laminillas de microarreglo con ADN de esperma de salmón sonicado. Después de una hora, sumerja las laminillas bloqueadas en agua doblemente destilada y centrifugue.

Seque las laminillas en tubos cónicos de 50 mililitros acolchados con una toallita kim. Ahora prepare un tampón de hibridación basado en formamida 2x. Primero, cálientelo a 55 grados Celsius durante 10 minutos para disolver completamente sus cristales.

Luego, centrifugue durante un minuto a 10.000 gs. A continuación, mezcle 25 microlitros de ADN con 25 microlitros de tampón de hibridación, y agite suavemente la mezcla. Realice ahora una centrifugación rápida de la mezcla e incúbele a 80 grados Celsius durante 10 minutos.

Después de la incubación, pipetee cuidadosamente toda la muestra de ADNc sobre el portaobjetos de microarreglo sin tocar el portaobjetos. Para distribuir uniformemente la muestra sobre el portaobjetos de microarreglo, baje suavemente una cubreobjetos sobre el portaobjetos utilizando una aguja de jeringa; antes de que la cubreobjetos se asiente completamente, levántela ligeramente y vuelva a bajarla con la aguja, permitiendo que la cubreobjetos caiga suavemente en su lugar.

Esta técnica minimiza la formación de burbujas de aire. Ahora coloque el portaobjetos horizontalmente en un tubo cónico de 50 mililitros debajo del portaobjetos con 50 microlitros de agua doblemente destilada y déjelo incubar durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Se realiza brevemente una segunda hibridación después de lavar el portaobjetos.

Varias veces en SSC, el segundo tampón, que contiene reactivos de captura sensibles a la luz y un reactivo Antifa, se aplica utilizando la misma técnica, seguido de una incubación breve, más lavados y secado. Luego, la preparación puede escanearse. Las imágenes pueden analizarse utilizando el software gratuito con la herramienta mágica de código abierto.

Brevemente, en la pestaña del proyecto, cree y guarde un nuevo proyecto en la pestaña crear perfil de expresión, seleccione cargar par de imágenes y elija el archivo de imagen roja como rojo y el archivo de imagen verde como verde. Luego, seleccione la pestaña crear perfil de expresión. Elija cargar lista de genes para subir un archivo de lista de genes de C. elegans obtenido del sitio web de GCAT para alinear y cuadricular la imagen de microarreglo.

Seleccione la pestaña de perfil de expresión de construcción y la opción de crear cuadrícula de edición. Ahora edite la cuadrícula. Configure el cuadro de diálogo con 48 como número de cuadrículas, 22 filas y 22 columnas para cada cuadrícula, y elija numerar los puntos de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.

Aumente el porcentaje de cambio de contraste y acerque la cuadrícula hasta que los puntos individuales sean fácilmente distinguibles. Cree las cuadrículas seleccionando el punto superior izquierdo establecido en el panel izquierdo y luego haciendo clic en el centro del punto superior izquierdo, seguido del punto superior derecho y la fila inferior en la cuadrícula uno. Repita este procedimiento de cuadriculado para cada una de las 48 cuadrículas, procediendo de izquierda a derecha y de arriba abajo.

Luego guarde seleccionando la pestaña de archivo y guardando la cuadrícula actual. Seleccione la pestaña finalizada para eliminar cualquier punto no relacionado del análisis. Abra la pestaña de crear perfil de expresión y, en la opción de cuadriculado de direccionamiento, seleccione marcado de puntos.

Ahora marque cualquier punto de trazo o fluorescencia de fondo y guarde seleccionando guardar marcas actuales. Como bajo la pestaña de archivo, los archivos marcados deben segmentarse. Por último, analice los genes inducidos o reprimidos por un factor especificado seleccionando explorar bajo la pestaña de expresión.

En el cuadro de diálogo de exploración, establezca los criterios de coincidencia para los genes finos. El número de incrementos o decrementos en dos veces la expresión. La intensidad se conoce como x y el valor de X es el criterio para el cambio de expresión.

X se introduce con un valor máximo mayor que X para genes inducidos y un valor mínimo menor que x para genes represados. En este experimento, se realiza un control de intercambio de colorantes: dos aislamientos independientes de ARN total a partir de larvas en estadio tres y estadio cuatro se hibridan como mutante verde versus tipo silvestre rojo, y mutante rojo versus tipo silvestre verde, para confirmar los cambios en la expresión génica. Realice tres aislamientos independientes de ARN total utilizando el mismo procedimiento, sintetice ADNc con un kit comercialmente disponible y, para cada muestra de ADNc, lleve a cabo PCR en tiempo real por triplicado utilizando tres genes de referencia como controles. A modo de demostración, los siguientes resultados examinan la expresión génica inducida en VSM uno.

Los mutantes AK 1468 son una cepa de nematodo caracterizada por una sinapsis potenciada; antes de realizar el análisis con microarreglos, se verifica la calidad del ARN extraído mediante electroforesis en gel. La presencia de dos subunidades ribosomales intactas antes y después del tratamiento con una enzima indica una muestra de ARN adecuada. En el microarreglo, el ADNc del tipo silvestre se marca con color rojo y el ADNc del mutante VSM uno se marca con verde. En esta, una de las 48 cuadrículas analizadas por microarreglo, cada cuadrado pequeño representa un oligonucleótido impreso individual, y en cada matriz, cada oligonucleótido único está representado.

Una vez que el análisis de microarrays de transcritos aislados de larvas en la etapa cuatro muestra que los genes que codifican las proteínas mayores de espermatozoides o MSP se inducen en mutantes VSM one, el análisis de microarrays de larvas en la etapa tres también revela cambios en la expresión dentro de la misma familia génica en el mutante. La verificación de predicciones del microarray mediante análisis de PCR en tiempo real revela que un miembro de la familia génica M ms P, MS P 32, se induce en los mutantes VSM one. Los datos representan el promedio de tres réplicas de PCR en tiempo real a partir de la misma colección de ARN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar herramientas bioinformáticas para análisis genómicos a escala completa, especialmente considerando que existen muchos programas bioinformáticos de código abierto disponibles para la comunidad científica.