La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

El objetivo general de este procedimiento es investigar los perfiles de expresión génica que subyacen a numerosos fenotipos o vías metabólicas. Esto se logra aislando primero el ARNm de dos cepas de nematodos contrastantes. El segundo paso del procedimiento es sintetizar CD NA que contenga secuencias de captura S, SI, tres o SFI e hibridarlas en un microarray.

El tercer paso del procedimiento es hibridar el microarray con secuencias anti captura que contengan S SI tres y SCIFI fluoro cuatro. El paso final del procedimiento es escanear el microarray y analizar los datos utilizando herramientas bioinformáticas como el software magic tool. En última instancia, se identifican los genes candidatos que median el fenómeno biológico investigado y se pueden validar y cuantificar mediante técnicas alternativas como la PCR en tiempo real.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque los nucleótidos manchados no son visibles para el usuario, por lo que es difícil superponer una mezcla de hibridación homogénea a los más de 23.000. Nucleótidos impresos de forma única Comience recolectando ARN de nematodos sanos sincronizados. Primero, se lavan y se resuspenden en tubos de 15 mililitros y los gránulos de gusano peletizados se resuspenden en siete mililitros de cloruro de sodio 0,1 molar y siete mililitros de hielo frío, 60% de peso por volumen de sacarosa.

Después de una incubación de 15 minutos en hielo, los gusanos se vuelven a peletizar. Ahora los gusanos libres de bacterias nadan, se recogen, se lavan en ARN, se liberan de agua y se peletizan. Una vez más, el pellet limpio y poco compactado se transfiere a un tubo de microcentrífuga que se hace girar a máxima velocidad durante 30 segundos.

Aspirado y almacenado en 10 volúmenes de ARN posteriormente a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para continuar. Para preparar muestras de ARN total, centrifugar los gránulos preparados a máxima velocidad, desechar el supernat y agregar una pizca de resina de molienda molecular al pellet. Luego congele la mezcla con nitrógeno líquido con un mortero.

Muele la suspensión de gusano congelada hasta convertirla en polvo fino y nitrógeno líquido según sea necesario para mantener el polvo frío después de molerlo. Pon el extracto en hielo durante cinco minutos. Después de cinco minutos, mezcle el extracto con 700 microlitros de R-L-T-B-M-E y 472 microlitros de etanol 100% total.

El ARN ahora se puede aislar utilizando un kit disponible comercialmente hasta un volumen final de 60 microlitros de ARN aislado por muestra biológica. Antes de continuar, elimine la posible contaminación genómica del ADN mediante el tratamiento con DNAS uno, seguido del uso de un kit de limpieza de ARN disponible en el mercado. Completa el kit aludiendo a un volumen de 60 microlitros.

Finalmente, determine la concentración de ARN y evalúe la integridad del ARN mediante tratamiento con carga de muestras de glioxal, análisis de colorante y gel antes de la hibridación de microarrays Utilizando métodos convencionales, el ARN purificado se invierte y se transcribe en ADN complementario, que se purifica a partir de la plantilla degradada con un kit disponible comercialmente y se alude a un volumen de 60 microlitros. Comienza la hibridación de microarrays bloqueando la elegancia del mar. Portaobjetos de microarrays con ADN de esperma de salmón sonicado Después de una hora, incline los portaobjetos bloqueados en agua bidestilada y gírelos.

Seque los portaobjetos en tubos cónicos de 50 mililitros acolchados con una toallita kim. Ahora prepare un tampón de hibridación basado en amida de dos formas x. Primero, caliéntelo a 55 grados centígrados durante 10 minutos para que disuelva completamente sus cristales.

Luego centrifugarlo durante un minuto a 10, 000 gs. A continuación, mezcle 25 microlitros de CD NA con 25 microlitros de tampón de hibridación y agite la mezcla suavemente. Ahora realice un giro rápido de la mezcla e incubela a 80 grados centígrados durante 10 minutos.

Después de la incubación, pipetee con cuidado toda la muestra de CDNA en el portaobjetos de microarrays sin tocar el portaobjetos. Para distribuir uniformemente la muestra en el portaobjetos del microarray. Baje suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos con una aguja de jeringa antes de que el cubreobjetos se baje por completo, tire hacia arriba y hacia abajo con la aguja nuevamente permitiendo que el cubreobjetos caiga suavemente en su lugar.

Esta técnica minimiza la formación de burbujas de aire. Ahora coloque el portaobjetos horizontalmente en un tubo cónico de 50 mililitros debajo del portaobjetos a 50 microlitros de agua destilada doble y déjelo incubar durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Se realiza una segunda hibridación brevemente después de lavar el portaobjetos.

Varias veces en SSC, el segundo tampón, que contiene reactivos de captura sensibles a la luz y un reactivo Antifa, se aplica utilizando la misma técnica seguida de una incubación corta, más lavados y secado. A continuación, se puede escanear la diapositiva. Las imágenes se pueden analizar utilizando el software gratuito con la herramienta mágica de código abierto.

Brevemente, en la pestaña proyecto, cree y guarde un nuevo proyecto en la pestaña Perfil de expresión de compilación, seleccione Cargar par de imágenes y seleccione el archivo de imagen rojo como rojo y el archivo de imagen verde como verde. A continuación, seleccione la pestaña Perfil de expresión de compilación. Elija cargar lista de genes para cargar un archivo de lista de genes de elegancia C obtenido del sitio web de GCAT para direccionar y recuadrar la imagen del microarray.

Seleccione la pestaña Generar perfil de expresión y crear la opción de editar cuadrícula. Ahora edite la cuadrícula. Configure el cuadro de diálogo usando 48 para el número de cuadrículas, 22 filas y 22 columnas para cada cuadrícula y eligiendo numerar los puntos de izquierda a derecha y de arriba a abajo.

Aumente el cambio de contraste porcentual y amplíe la cuadrícula hasta que los puntos individuales se puedan distinguir fácilmente. Cree las cuadrículas seleccionando establecer el lugar superior izquierdo en el panel de la izquierda y luego haciendo clic en el centro del lugar superior izquierdo, seguido del lugar superior derecho y la fila inferior en la cuadrícula uno. Repita este procedimiento de cuadrícula para cada una de las 48 cuadrículas, procediendo de izquierda a derecha y de arriba a abajo.

A continuación, guarde seleccionando la pestaña de archivo y guarde la cuadrícula actual como una vez guardada. Seleccione la pestaña finalizado para eliminar las manchas no relacionadas del análisis. Abra la pestaña Perfil de expresión de compilación y, en la opción Cuadrícula de direccionamiento, seleccione Marcado de tinta puntual.

Ahora marque cualquier mancha de raya o fluorescencia de fondo y guarde seleccionando guardar banderas actuales. Al igual que en la pestaña de archivos, los archivos marcados deben segmentarse. Por último, analice los genes inducidos o reprimidos por un factor específico seleccionando explorar en la pestaña de expresión.

En el cuadro de diálogo de exploración, establezca los criterios de coincidencia de genes finos. El número de dobles aumenta o disminuye en la expresión. La intensidad se conoce como x y el valor de X es el criterio para el cambio de expresión.

X es la entrada por debajo de un valor máximo mayor que X para los genes inducidos y un valor mínimo menor que x para los genes reprimidos. En este experimento, se realiza un control de intercambio de colorantes, los dos aislamientos independientes de ARN total de las larvas de la etapa tres y la etapa cuatro se hibridan como mutante verde frente al tipo salvaje rojo, mientras que el mutante rojo frente al tipo salvaje verde para confirmar los cambios en la expresión génica realizan tres aislamientos independientes de ARN total utilizando el mismo procedimiento. y para cada muestra de CD NA realizar PCR en tiempo real y triplicar utilizando tres genes de mantenimiento como controles. Para demostrarlo, los siguientes resultados examinan la expresión génica inducida en VSM one.

AK 1468 mutantes, una cepa de nematodo caracterizada por una sináptica mejorada antes de realizar el análisis de microarrays, la calidad del ARN extraído se verifica mediante electroforesis en gel. La presencia de dos subunidades ribosómicas intactas antes y después del tratamiento con dase one es indicativa de una buena muestra de ARN en el CDNA de tipo salvaje de microarrays que se marca en rojo y VSM, un CD NA mutante se marca en verde. En esta de las 48 cuadrículas analizadas por microarray, cada cuadrado pequeño representa un solo oligonucleótido impreso en cada matriz, cada oligonucleótido único está representado.

Una vez que el análisis de microarrays de las transcripciones aisladas de las larvas en la etapa cuatro muestra que los genes que codifican para las principales proteínas del esperma o MSP se inducen en los mutantes VSM uno, el análisis de microarrays de las larvas en la etapa tres también revela cambios en la expresión dentro de la misma familia de genes en el mutante. Ensayo. Las predicciones del microarray mediante análisis de PCR en tiempo real revelan que un miembro de la familia de genes M ms P, MS P 32, es inducido en los mutantes VSM one. Los datos representan el promedio de tres réplicas de PCR en tiempo real de la misma colección de ARN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar herramientas bioinformáticas para el análisis de todo el genoma, especialmente considerando que hay muchos programas de software bioinformático de código abierto disponibles para la comunidad científica.