Name: La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a analizar perfiles de expresión génica en C. elegans mediante microarrays y PCR en tiempo real. Esta metodología permite identificar genes candidatos y validar resultados en nematodos.

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Este trabajo fue realizado por estudiantes de pregrado en Southwestern Oklahoma State University, OK Weatherford. Este trabajo fue apoyado por la NSF Rui-0963258, NIH OK INBRE 2P20RR016478, GCAT y OCAST HR09-137S. El vsm1 (ok1468) mutante fue aislado por el Consorcio golpe de gracia Oklahoma Gene. Los autores agradecen a Dan Wheeler Stefanovic y Tanner por su valiosa ayuda durante la ejecución del proyecto.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este estudio se desarrolló un protocolo sencillo, fácil de usar que se puede utilizar para determinar perfiles de expresión genética subyacente varios fenómenos biológicos. En este protocolo, el ARN total fue aislado por primera vez y tratados con DNasa I. Nuestro método de aislamiento de ARN ha sido dramáticamente simplificadas omitiendo extracciones con fenol y el uso de resinas de afinidad para la limpieza 5,6. En pocas palabras, C. elegans membranas cuticulares y células estaban rotas, abiertas por los nematodos congelación con nitrógeno líquido y la molienda con resina molecular. A continuación, extrae el ARN fue tratado con DNasa I antes de la síntesis de ADNc. El paso posterior fue agregado a minimizar hibridaciones inespecíficas, las muestras de ARN contaminadas con ADN genómico podría introducir interferencias y producir muchos falsos positivos. Entonces, de tipo salvaje y VSM-1 (ok1468) ADNc mutantes fueron marcadas con Cy3 y Cy5 secuencias de captura y se hibridan en C. microarrays elegans obtiene a través del programa GCAT. Este sistema es más sensible que otros productos similares, y sus dos colores diseño reduce el número de arreglos necesarios, resultando en una mayor eficiencia de costes y el tiempo 7,8. Además, este sistema no requiere el equipo especializado de otros sistemas similares, por lo tanto, este procedimiento podría llevarse a cabo en cualquier entorno de laboratorio estándar 7. Imágenes en tercer lugar, fluorescentes conjunto híbrido fueron analizados utilizando el software de código abierto MAGICTool, y perfiles de expresión génica que fueron creados. MAGICTool es un programa fácil de usar que es fácilmente utilizada por personas de todos los niveles, desde el pregrado a la post-doctorado. Sin embargo, un funcionamiento óptimo requiere la disponibilidad de grandes cantidades de memoria. Por último, los genes candidatos obtuvieron mediante el análisis de microarrays fueron validados con PCR en tiempo real. Aunque el enfoque genómico es un método eficaz para el estudio de los fenómenos biológicos, hay algunas limitaciones hay que tener en cuenta. En primer lugar, a pesar de la especificidad de este protocolo de microarrays, transcripciones dentro de una familia no se distinguen el uno del otro si el oligonucleótido impreso se ha tomado de secuencias conservadas. PCR en tiempo real compensa similitudes dentro de una familia de genes, e incluso se puede distinguir entre las isoformas específicas del mismo gen. Sin embargo, con PCR en tiempo real es un desafío para encontrar los controles de verdad que se expresan por igual durante toda la vida de un organismo. Debido a esto, los resultados serán relativos. Una aproximación proteómica es una alternativa a nuestra técnica. Proteínas individuales se pueden aislar mediante electroforesis en gel 2D y se identifica con la espectrometría de masas. Nuestros estudios muestran específicamente que los miembros de muchas de las principales proteínas de los espermatozoides (MSP) de la familia son inducidos en VSM-1 nematodos mutantes con una mayor densidad sináptica. MSPs son exclusivas de C. elegans y son responsables de la maduración de oocitos y la ovulación. Chai 1 ha demostrado que la regulación del número y tamaño bouton presináptica en la unión neuromuscular en moscas de la fruta es probable controlada por moléculas que contienen grandes dominios de proteínas de esperma. Los estudios realizados por Tsuda y sus colegas han demostrado dos grandes dominios de la proteína de esperma puede servir como ligandos para los receptores Ephrine, provocando cascadas de señalización del receptor de la tirosina cinasa. Por otra parte, el análisis en tiempo real PCR validados y se redujeron los resultados de microarrays de un miembro de la familia msp, msp-32. En conjunto, el trabajo presentado aquí representa un análisis de todo el genoma de un dilema central de la neurociencia, así como el poder de la investigación de pregrado en el quehacer científico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Catálogo # </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Más tarde, el ARN </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Resina molecular de molienda </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNasa libre de agarosa LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel de preparación / ejecución de Buffer </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> ARN del Milenio marcador </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glioxal muestra colorante de carga </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNasa conjunto </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT enzima y tampón de reacción 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Matriz de 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR kit de purificación </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Salmón cortado ADN de los espermatozoides </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS solución </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> TDT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript Kit Síntesis de cDNA </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

la determinación de perfiles genéticos de expresión en c. elegans utilización de microarrays y pcr en tiempo real

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Las sinapsis se componen de una zona presináptica activa en la señalización celular y una terminal postsináptica en la célula diana. En el caso de las sinapsis químicas, los mensajes son transportados por neurotransmisores liberados desde las terminales presinápticas y recibida por los receptores en las células postsinápticas. Nuestra investigación previa en Caenorhabditis elegans han demostrado que VSM-1 regula negativamente la exocitosis. Además, el análisis de las sinapsis en el VSM-1 mutantes mostraron que los animales que carecen de un completo y funcional de conectividad VSM-1 se han incrementado sináptica. En base a estos hallazgos preliminares, la hipótesis de que la C. elegans VSM-1 puede desempeñar un papel crucial en la sinaptogénesis. Para probar esta hipótesis, de doble etiquetado de análisis de microarrays se llevó a cabo, y los perfiles de expresión génica se determinaron. En primer lugar, se aisló ARN total, inversamente transcribe a cDNA, y se hibridan con los microarrays de ADN. Luego, en silico análisis de hibridación de la sonda fluorescente reveló una inducción significativa de muchos genes que codifican para los miembros de la familia de los espermatozoides principal proteína (MSP) en mutantes con una mayor sinaptogénesis. Proyectos son el principal componente de los espermatozoides en el C. elegans y parece que la señal de la maduración de los ovocitos de nematodos y la ovulación. En las moscas de la fruta, Chai y sus colegas demostraron que un MSP moléculas similares a regular el número y el tamaño de Bouton presináptica en la unión neuromuscular. Además, el análisis realizado por Tsuda y compañeros de trabajo 2 sugiere que los MSPs pueden actuar como ligandos para los receptores Eph y del receptor de activación de la tirosina cinasa cascadas de señalización. Por último, el análisis de PCR en tiempo real corroboró que el gen que codifica para MSP-32 es inducida en VSM-1 (ok1468) mutantes. En conjunto, la investigación realizada por nuestro laboratorio han demostrado que VSM-1 mutantes tienen un aumento significativo en la densidad sináptica, lo que podría estar mediado por el MSP-32 de señalización.

Análisis de microarrays se realizó para determinar los perfiles de expresión génica en<em&gt; C. elegans</em&gt;, Y en tiempo real PCR se utilizó para validar y cuantificar los datos de microarrays.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Las sinapsis están compuestas por una zona activa presináptica en la célula señalizadora y un terminal postsináptico en la célula diana. En el caso de las sinapsis químicas, ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar los perfiles de expresión génica que subyacen a numerosos fenotipos o vías metabólicas. Esto se logra primero aislado el ARNm de dos cepas de nematodos contrastantes. El segundo paso del procedimiento consiste en sintetizar ADNc que contenga secuencias de captura SSI tres o SFI y hibridarlas a un microarreglo.El tercer paso del procedimiento consiste en hibridar el microarreglo con secuencias anti captura que contienen S SI tres y SCIFI fluoro cuatro. El paso final del procedimiento es escanear el microarreglo y analizar los datos utilizando herramientas bioinformáticas como el software magic tool. En última instancia, se identifican los genes candidatos que median el fenómeno biológico bajo estudio y pueden validarse y cuantificarse mediante técnicas alternativas como la PCR en tiempo real.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los nucleótidos impresos no son visibles para el usuario, por lo que es difícil superponer una mezcla de hibridación homogénea sobre los más de 23.000 nucleótidos impresos de forma única. Comience recolectando ARN de nematodos sincronizados sanos. Primero, se lavan y resuspenden en tubos de 15 mililitros, y los pellet de gusanos se resuspenden en siete mililitros de cloruro de sodio 0,1 molar y siete mililitros de sacarosa al 60% peso por volumen, fríos con hielo.Tras una incubación de 15 minutos en hielo, los gusanos se centrifugan nuevamente. Ahora los gusanos libres de bacterias nadarán hacia arriba, se recogerán, se lavarán con agua libre de RNAsas y se centrifugarán. De nuevo, el pellet limpio y ligeramente compactado se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a velocidad máxima durante 30 segundos.Aspirar y almacenar en 10 volúmenes de RNA later a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para continuar. Para preparar muestras de ARN total, centrifugar los pellet preparados a velocidad máxima, desechar el sobrenadante y agregar una pizca de resina molecular para molienda al pellet. Luego, congelar la mezcla usando nitrógeno líquido y un pistilo.Muela la suspensión de gusanos congelada hasta obtener un polvo fino y agrega nitrógeno líquido según sea necesario para mantener el polvo frío después de molerlo. Coloque el extracto en hielo durante cinco minutos. Después de cinco minutos, mezcle el extracto con 700 microlitros de R-L-T-B-M-E y 472 microlitros de etanol al 100% en total.El ARN ya puede aislarse utilizando un kit disponible comercialmente, obteniendo un volumen final de 60 microlitros de ARN aislado por muestra biológica. Antes de continuar, elimine la posible contaminación con ADN genómico tratando con DNAS one, seguido del uso de un kit de purificación de ARN disponible comercialmente. Complete el procedimiento ajustando el volumen a 60 microlitros.Finalmente, determine la concentración de ARN y evalúe la integridad del ARN mediante tratamiento con carga de muestra de glioxal, tinción y análisis en gel antes de la hibridación en microarreglo. Mediante métodos convencionales, el ARN purificado se transcribe inversamente a ADN complementario, el cual se purifica a partir de la plantilla degradada utilizando un kit comercialmente disponible y se ajusta a un volumen de 60 microlitros. Comience la hibridación en microarreglo bloqueando la elegancia marina. Incube las laminillas de microarreglo con ADN de esperma de salmón sonicado. Después de una hora, sumerja las laminillas bloqueadas en agua doblemente destilada y centrifugue.Seque las laminillas en tubos cónicos de 50 mililitros acolchados con una toallita kim. Ahora prepare un tampón de hibridación basado en formamida 2x. Primero, cálientelo a 55 grados Celsius durante 10 minutos para disolver completamente sus cristales.Luego, centrifugue durante un minuto a 10.000 gs. A continuación, mezcle 25 microlitros de ADN con 25 microlitros de tampón de hibridación, y agite suavemente la mezcla. Realice ahora una centrifugación rápida de la mezcla e incúbele a 80 grados Celsius durante 10 minutos.Después de la incubación, pipetee cuidadosamente toda la muestra de ADNc sobre el portaobjetos de microarreglo sin tocar el portaobjetos. Para distribuir uniformemente la muestra sobre el portaobjetos de microarreglo, baje suavemente una cubreobjetos sobre el portaobjetos utilizando una aguja de jeringa; antes de que la cubreobjetos se asiente completamente, levántela ligeramente y vuelva a bajarla con la aguja, permitiendo que la cubreobjetos caiga suavemente en su lugar.Esta técnica minimiza la formación de burbujas de aire. Ahora coloque el portaobjetos horizontalmente en un tubo cónico de 50 mililitros debajo del portaobjetos con 50 microlitros de agua doblemente destilada y déjelo incubar durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Se realiza brevemente una segunda hibridación después de lavar el portaobjetos.Varias veces en SSC, el segundo tampón, que contiene reactivos de captura sensibles a la luz y un reactivo Antifa, se aplica utilizando la misma técnica, seguido de una incubación breve, más lavados y secado. Luego, la preparación puede escanearse. Las imágenes pueden analizarse utilizando el software gratuito con la herramienta mágica de código abierto.Brevemente, en la pestaña del proyecto, cree y guarde un nuevo proyecto en la pestaña crear perfil de expresión, seleccione cargar par de imágenes y elija el archivo de imagen roja como rojo y el archivo de imagen verde como verde. Luego, seleccione la pestaña crear perfil de expresión. Elija cargar lista de genes para subir un archivo de lista de genes de C. elegans obtenido del sitio web de GCAT para alinear y cuadricular la imagen de microarreglo.Seleccione la pestaña de perfil de expresión de construcción y la opción de crear cuadrícula de edición. Ahora edite la cuadrícula. Configure el cuadro de diálogo con 48 como número de cuadrículas, 22 filas y 22 columnas para cada cuadrícula, y elija numerar los puntos de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.Aumente el porcentaje de cambio de contraste y acerque la cuadrícula hasta que los puntos individuales sean fácilmente distinguibles. Cree las cuadrículas seleccionando el punto superior izquierdo establecido en el panel izquierdo y luego haciendo clic en el centro del punto superior izquierdo, seguido del punto superior derecho y la fila inferior en la cuadrícula uno. Repita este procedimiento de cuadriculado para cada una de las 48 cuadrículas, procediendo de izquierda a derecha y de arriba abajo.Luego guarde seleccionando la pestaña de archivo y guardando la cuadrícula actual. Seleccione la pestaña finalizada para eliminar cualquier punto no relacionado del análisis. Abra la pestaña de crear perfil de expresión y, en la opción de cuadriculado de direccionamiento, seleccione marcado de puntos.Ahora marque cualquier punto de trazo o fluorescencia de fondo y guarde seleccionando guardar marcas actuales. Como bajo la pestaña de archivo, los archivos marcados deben segmentarse. Por último, analice los genes inducidos o reprimidos por un factor especificado seleccionando explorar bajo la pestaña de expresión.En el cuadro de diálogo de exploración, establezca los criterios de coincidencia para los genes finos. El número de incrementos o decrementos en dos veces la expresión. La intensidad se conoce como x y el valor de X es el criterio para el cambio de expresión.X se introduce con un valor máximo mayor que X para genes inducidos y un valor mínimo menor que x para genes represados. En este experimento, se realiza un control de intercambio de colorantes: dos aislamientos independientes de ARN total a partir de larvas en estadio tres y estadio cuatro se hibridan como mutante verde versus tipo silvestre rojo, y mutante rojo versus tipo silvestre verde, para confirmar los cambios en la expresión génica. Realice tres aislamientos independientes de ARN total utilizando el mismo procedimiento, sintetice ADNc con un kit comercialmente disponible y, para cada muestra de ADNc, lleve a cabo PCR en tiempo real por triplicado utilizando tres genes de referencia como controles. A modo de demostración, los siguientes resultados examinan la expresión génica inducida en VSM uno.Los mutantes AK 1468 son una cepa de nematodo caracterizada por una sinapsis potenciada; antes de realizar el análisis con microarreglos, se verifica la calidad del ARN extraído mediante electroforesis en gel. La presencia de dos subunidades ribosomales intactas antes y después del tratamiento con una enzima indica una muestra de ARN adecuada. En el microarreglo, el ADNc del tipo silvestre se marca con color rojo y el ADNc del mutante VSM uno se marca con verde. En esta, una de las 48 cuadrículas analizadas por microarreglo, cada cuadrado pequeño representa un oligonucleótido impreso individual, y en cada matriz, cada oligonucleótido único está representado.Una vez que el análisis de microarrays de transcritos aislados de larvas en la etapa cuatro muestra que los genes que codifican las proteínas mayores de espermatozoides o MSP se inducen en mutantes VSM one, el análisis de microarrays de larvas en la etapa tres también revela cambios en la expresión dentro de la misma familia génica en el mutante. La verificación de predicciones del microarray mediante análisis de PCR en tiempo real revela que un miembro de la familia génica M ms P, MS P 32, se induce en los mutantes VSM one. Los datos representan el promedio de tres réplicas de PCR en tiempo real a partir de la misma colección de ARN.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar herramientas bioinformáticas para análisis genómicos a escala completa, especialmente considerando que existen muchos programas bioinformáticos de código abierto disponibles para la comunidad científica.

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