Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

En este procedimiento, se obtienen imágenes de la dinámica de la expresión génica en los tejidos vegetales a lo largo del tiempo con el uso de robótica, primero se esterilizan las semillas de frijol lima y se colocan entre toallas de papel humedecidas en un recipiente de cultivo de tejidos para su germinación. Después de cuatro días, los coan se extraen y se bombardean con una construcción de ADN que contiene un promotor fusionado con GFP Coan colocado en placas de Petri y se montan en un sistema de recolección de imágenes robóticas bidimensional diseñado a medida. El robot está programado para capturar imágenes de cada pieza de tejido cada hora durante 100 horas.

Las imágenes se someten a un análisis de imágenes, con datos cuantitativos sobre la intensidad de la expresión de GFP a lo largo del tiempo. Hola, soy John Finer, director del Laboratorio de Transformación de Plantas en el Departamento de Horticultura y Ciencias de los Cultivos de la Universidad Estatal de Ohio. Soy Carlos Herández García, estudiante de doctorado en el laboratorio final de la Universidad Estatal de Ohio.

Hoy Carlos os enseñará el protocolo que hemos desarrollado para el análisis de la expresión génica y de los tejidos vegetales utilizando la proteína verde fluorescente. Utilizamos este procedimiento que hemos desarrollado en el laboratorio para medir la deformación de la actividad de OD. Para ello, promotor nuestra primera corona aguas arriba del gen GFP, que son nuestros genes reporteros.

Le mostraré cómo introducimos el control del promotor en Lima veta Cataly y enviaré una aplicación en nuestro sistema de captura de imágenes robóticas de diseño personalizado. Terminaré repasando nuestro protocolo para el análisis de imágenes. Así que vamos a comenzar este procedimiento, esteriliza la superficie con semillas de frijol de lima utilizando procedimientos estándar.

Coloque las semillas esterilizadas en recipientes magenta GA siete entre capas de toallas húmedas y de papel e incube durante cuatro días a 25 grados centígrados. Aquí utilizamos un vector de expresión de alto número de copias, útil para el análisis de promotores y elementos promotores. Este vector contiene el gen GFP, que se utiliza para visualizar la función del promotor o del elemento promotor en los tejidos transformados alrededor de una o dos horas antes del bombardeo.

Impuestos especiales de frijol de lima CU plomo de cubiertas de semillas. El plomo CU adecuado para el bombardeo debe ser de color amarillo a verde claro, plano y libre de cualquier daño que pueda interferir con el análisis de imagen posterior inmediatamente después de la escisión, colocado 12 cu de plomo en una placa de Petri con medio de cultivo OMS que contenga sales MS, cinco vitaminas B, 3% de sacarosa y una tasa de gel del 0,2% a pH 5,7. A continuación, precipite la construcción de ADN en partículas de tungsteno M 10 Primero, justo antes de usar, vuelva a suspender las partículas en agua estéril a una concentración de 100 miligramos por mililitro.

Luego, en un tubo de fuga de 0,6 mililitros, agregue 25 microlitros de partículas, cinco microlitros de ADN a un microgramo por microlitro, 25 microlitros de cloruro de calcio de 2,5 molares y 10 microlitros de espermatozoides de 100 milimolares. Incube la preparación de ADN en hielo durante cinco minutos, luego retire y deseche 50 microlitros de la solución encima de las partículas. Vuelva a suspender las partículas recubiertas de ADN que permanecen en el fondo del tubo mediante vórtice.

E inmediatamente después del vórtice, retire un Eloqua de dos microlitros. Repita este paso de vórtice. Cada vez que se retira un Eloqua, las partículas recubiertas deben mantenerse en hielo y usarse dentro de los 15 minutos.

Ahora que el ADN está recubierto de las partículas, coloque dos microlitros de partículas a través de la parte superior de un filtro de jeringa en el medio de una pantalla de filtro. A continuación, coloque el filtro de jeringa en la unidad de retención de filtros dentro de la pistola de entrada de partículas o la cámara PIG. Coloque un frijol de lima con un lado axial hacia arriba en un deflector que consiste en una pantalla derretida hasta el fondo de un vaso de precipitados.

Coloque el deflector, que se utiliza como plataforma para sostener los tejidos durante el bombardeo en la cámara del cañón de partículas. Para bombardear el tejido, primero abra la válvula que conduce al vacío para evacuar la cámara. Cuando el vacío alcanza los 760 milímetros de mercurio, se activa el solenoide y se libera el helio para propulsar las partículas.

La presión del helio utilizada para acelerar las partículas es de 50 a 60 PSI. Después del bombardeo de partículas, cierre la válvula de la línea de vacío y libere el vacío usando la válvula de escape. Cuando se libere el vacío, abra la puerta de la cámara para recuperar el cable de co bombardeado y devuelva el cable de co a un lado dal.

Hasta el medio de cultivo OMS para la cuantificación y la elaboración de perfiles de expresión. Bombardea un mínimo de tres coleadinas por cada construcción de ADN. También se incluye un control positivo, que proporciona un perfil de expresión génica bien estudiado.

Los colíderes ya están listos para la toma de imágenes. Encienda la lámpara de mercurio y espere 30 minutos para que la lámpara se caliente. Encienda las fuentes de alimentación para la cámara SPOT R-T-C-C-D y el controlador del motor, que impulsa el movimiento de la plataforma robótica diseñada a medida, que contiene ocho placas.

Configure el conjunto de filtros para la detección de GFP seleccionando el conjunto de dos filtros GFP con una excitación de 480 nanómetros y una emisión de 510 nanómetros en un microscopio de disección MZ L tres. A continuación, esterilice las tapas de las placas de Petri de policarbonato engrosadas rociándolas con etanol al 70%. Las tapas especializadas utilizadas para cubrir la base de la placa de Petri evitan la condensación durante la recopilación de imágenes.

Coloque las placas que contienen cuan bombardeado en la plataforma robótica y apriete el tornillo de fijación lateral para sujetarlas en su posición. Ahora abra la aplicación de software personalizada que controla tanto la plataforma robótica como la adquisición de imágenes. Abra también el interruptor del controlador de luz blanca del software con el software, oriente la plataforma a la posición de inicio.

Esto se hace antes de entrar en las posiciones. Para cada cable de mimo en la pestaña del motor, seleccione la primera placa. La plataforma posicionará el centro de la placa de Petri bajo el objetivo del microscopio.

Con los botones de distancia de movimiento, coloque con precisión el primer CU LEADIN para la recopilación de imágenes. Con la función de modo en vivo, mueva el plomo de abrazo al área de visualización adecuada Para el primer plomizo, use las perillas manuales del microscopio de disección para establecer el enfoque y establecer el aumento en 1.6x. Una vez que se haya establecido la región de interés, haga clic en el botón agregar esta posición.

El software agregará las coordenadas de esta región a un archivo de programación de posiciones y la plataforma regresará al centro de las posiciones establecidas para todas las placas restantes en las placas. Usando los botones de distancia de movimiento, use los tres tornillos de nivelación manual ubicados debajo de cada placa en la plataforma robótica para ajustar el enfoque del coan restante en la misma placa. Una vez introducidas todas las coordenadas de todos los coan, guarde las coordenadas del horario de posición.

Introduzca los parámetros de la colección de imágenes, como el tipo de luz, que es azul para GFP y el ajuste de exposición, y especifique dónde almacenar las imágenes como se describe en el protocolo escrito adjunto. Vaya a la pestaña de control de tiempo de captura y establezca el intervalo de tiempo de adquisición de imágenes y el número total de ciclos de recopilación de imágenes. Por lo general, las imágenes se recopilan cada hora durante 100 horas.

Generación de perfiles de expresión génica bien definidos. Inicie la adquisición de imágenes abriendo la pestaña de programación de posiciones y luego haciendo clic en el botón de programación de ejecución. Aísle el sistema de recolección de imágenes de la luz extraña al final de la recolección de imágenes de 100 horas.

Las imágenes de alta resolución, de unos cinco megabytes cada una, están listas para el análisis de imágenes. Utilice la imagen lista para ensamblar las 100 imágenes secuenciales de cada carpeta. Importe todas las imágenes secuenciales como marcos y cambie su tamaño a 800 por 600 píxeles para acelerar el procesamiento de imágenes.

A continuación, utilice marcas en una nueva capa introducida, que sea visible en todos los fotogramas y utilice los puntos GFP seleccionados en la referencia de la imagen. Alinee manualmente cada imagen una vez completada la alineación, elimine la capa utilizada como referencia y guarde el archivo como un único archivo PSD. Además, exporta todos los fotogramas como un solo archivo MOV utilizando la resolución más alta.

Los archivos ya están listos para iniciar la cuantificación de GFP. Utilice la imagen J para abrir el archivo MOV y recortar un área de 400 por 300 píxeles. A continuación, separe las imágenes secuenciales en canales rojo, azul y verde con la herramienta de división RGB para los canales rojo y verde.

Reste la fluorescencia de fondo utilizando la herramienta de complemento de restar el ROI medido para cada corte. Calcule la expresión de GFP ajustando los niveles de umbral y utilizando un complemento diseñado para medir el valor medio de la escala de grises por píxel y el número total de píxeles que expresan GFP. Copie los valores de salida en la imagen J.Finalmente, pegue los valores de salida para los canales verde y rojo en Microsoft Office.

Excel para una mayor manipulación de datos para darle una idea de los resultados de la alineación de imágenes. Esta primera animación muestra la inexactitud del reposicionamiento de la plataforma robótica durante el experimento de 100 horas. El movimiento puntual es un artefacto que resulta de la incapacidad de la plataforma robótica para volver exactamente a la misma posición en cada punto de tiempo después de la alineación manual de la imagen, las células que expresan GFP se pueden observar fácilmente y las características únicas de este sistema de seguimiento se visualizan fácilmente.

Como se repite en esta animación, la célula que expresa GFP en las células que están encerradas en un círculo, la célula que está encerrada en un círculo rojo muestra una disminución muy rápida de la expresión entre 18 y 20 horas después del bombardeo, mientras que la célula que está encerrada en un círculo blanco muestra un inicio tardío de la expresión de GFP. Además de las animaciones, este procedimiento permite una cuantificación rápida de la expresión de GFP a lo largo del tiempo en el tejido objetivo del frijol lima. Estos resultados representativos muestran la cuantificación comparativa de la intensidad del promotor utilizando el promotor CAMV 35 S y cuatro promotores diferentes de soja.

Acabamos de mostrarte cómo introducir el ADN en la catalina de germinar. Las semillas de la vena de Lima colocan la catalina en el robot, recolectan imágenes para el análisis de imágenes y analizan esas imágenes. Utilizamos este procedimiento de forma rutinaria en nuestro laboratorio para validar los promotores de plantas clonadas.

Se puede generar una gran cantidad de datos a partir de la introducción de diferentes promotores de plantas. Sin embargo, este procedimiento es complicado con muchos pasos que pueden salir mal al hacer este procedimiento es importante comenzar con semilla fresca de frijol o al menos usar semilla de alta calidad que se haya almacenado correctamente. También es importante conseguir que la tapa cortada por la bomba se instale rápidamente en el robot y utilizar la tapa gruesa del plato para mascotas para minimizar los problemas de condensación.

Y por último, ten en cuenta que el GFP que utilizamos es otra versión llamada SGFP, front Gen HIN Lab de la Universidad de Harvard. Esta GFP no es muy estable y puede ser mejor para rastrear cambios rápidos en la expresión génica. Y eso es itra nosotros por mirarnos.

Y buena suerte con tus experimentos.