Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los patrones de expresión de ARNm a nivel celular con alta sensibilidad y especificidad. Esto se logra tomando primero secciones de tejido formales y fijas e incrustadas en parafina a través de una serie de soluciones para eliminar la cera, la permeabilidad de los tejidos y el bloqueo de grupos menores cargados positivamente en los tejidos que pueden producir una señal de fondo. Posteriormente, se infiltra en las secciones de tejido una sonda de ARN marcada con DIG específica para el gen de interés y los portaobjetos se hibridan durante la noche.

A continuación, los portaobjetos se tratan con ARN. A para eliminar la sonda no unida específicamente de las secciones y luego incubarla con el anticuerpo anti DIG. Eso permite la visualización de la sonda hibridada mediante una reacción química métrica de color.

Los resultados muestran una señal de color azul oscuro detectable por microscopía óptica específicamente en aquellas células dentro del tejido en las que se expresa el gen de interés. La principal ventaja de esta técnica respecto a nuestros otros análisis de expresión, como los enfoques R-T-P-C-R, microrrayos o Next Generation Sequencing, es que el protocolo de hibridación I que se muestra aquí revela el patrón de expresión de un gen de interés en su contexto tisular. Estos métodos incluyen muchos pasos que se aprenden mejor mediante demostraciones visuales.

Mostraremos cómo seccionar e incrustar tejido, así como los pasos clave en el protocolo profesional de hibridación de Al que son difíciles de dominar por su cuenta. El método de inclusión de los tejidos fijados en paraldehído variará en función del tipo de tejido a analizar. El punto más importante aquí es asegurarse de que las muestras estén orientadas correctamente para seccionarlas posteriormente.

Un método de incrustación es usar moldes y anillos de plástico. Para comenzar este procedimiento, caliente los moldes en una placa de calentamiento a 60 grados centígrados y luego vierta parafina fundida en los moldes. A continuación, utilice pinzas calentadas para transferir una muestra de tejido a cada molde y oriéntela en la posición deseada.

Mueva con cuidado el molde de la placa al banco y coloque el anillo blanco en el molde. Agregue mol y cera adicionales. Deje que la cera se enfríe y se endurezca gradualmente antes de cortar.

Calienta los bloques a temperatura ambiente, luego recorta cada bloque en forma de trapecio, dejando aproximadamente un milímetro de cera alrededor de la muestra. Coloque el bloque recortado en el micrótomo de manera que la más larga de las dos caras paralelas quede en la parte inferior. Lleve con cuidado el bloque hacia la cuchilla y asegúrese de que la superficie del bloque sea paralela a la sección de la cuchilla.

Como un espesor de ocho a 10 micras. Alinee las cintas de cera sobre una superficie antiadherente, como papel de aluminio, y seleccione las secciones de interés bajo un endoscopio de disección. A continuación, marque las diapositivas prob bon plus con un lápiz.

No utilice bolígrafos en los rotuladores porque se borrarán durante el protocolo de hibridación INI dos. Distribuya un mililitro de agua limpia mili Q en cada portaobjetos. Flote con cuidado las secciones de interés en la superficie del agua a temperatura ambiente.

Asegúrate de que el lado brillante mire hacia el agua. Transfiera el portaobjetos lentamente a un calentador de portaobjetos. Ajuste de 35 a 37 grados centígrados.

Este rango de temperatura, a diferencia de los 42 grados centígrados comúnmente utilizados, evita la formación de burbujas debajo de las secciones. Después de cinco minutos, vierta el agua con cuidado pero con un movimiento suave para que la cinta se baje sobre el tobogán. Deje que los portaobjetos se sequen durante al menos varias horas o toda la noche a 37 grados centígrados para que el tejido se adhiera a las secciones de tejido preparadas.

Para la hibridación in situ, primero se depa y se rehidratan para la finalización de la depa. Incubar los portaobjetos en dos cambios de solución clara durante 10 minutos cada uno. Para rehidratar las secciones de tejido, pase los portaobjetos a través de una serie de concentraciones decrecientes de etanol durante 30 segundos cada uno.

Durante el tratamiento con proteasa, que no se muestra en este vídeo, prepare un plato de vidrio con una solución de amina de triatlón 0,1 molar y colóquelo en una placa de agitación en una campana extractora. Inmediatamente antes de colocar la rejilla deslizante metálica en la solución, agregue 1,25 mililitros de anhídrido acético en la amina de triatlón, el tampón y el hueco de la escalera. Además, configure el sistema de sujeción y el soporte para sujetar el bastidor deslizante.

Reduzca la velocidad de la abrazadera Starr, sujete la rejilla deslizante al soporte y baje la rejilla a la solución, manteniéndola elevada por encima de la barra de agitación. Continúe revolviendo lentamente durante 10 minutos después de enjuagar en PBS y deshidratar nuevamente a través de una serie de etanol. Las secciones de tejido están listas para la hibridación.

Coloque los portaobjetos sobre una superficie limpia y deje que el aire se seque completamente durante cinco a 10 minutos. Prepare la mezcla de tampón de hibridación de la sonda añadiendo la sonda desnaturalizada a 80 microlitros de tampón de hibridación. Para cada portaobjetos, mezcle bien pipeteando más, evite hacer burbujas.

Pipetear el tampón de hibridación de la sonda. Mezcle en el borde derecho del portaobjetos. Baje gradualmente un cubreobjetos sobre el portaobjetos, asegurándose de que la solución de hibridación cubra todas las secciones sin burbujas.

Golpee ligeramente la tapa con el dedo donde se forman las burbujas para desplazarlas de todas las secciones de tejido. No tire del recorte de la cubierta, ya que esto dañará las secciones. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad que contenga papel watman humedecido con agua UE y cubierto en gran parte con param.

Selle herméticamente la caja e incube los portaobjetos a la temperatura de hibridación deseada, generalmente de 50 a 55 grados Celsius durante 16 a 20 horas. Al finalizar el protocolo de hibridación, retire con cuidado los cubreobjetos de las portaobjetos. Es posible que el cubreobjetos simplemente se caiga cuando la corredera se coloca en posición vertical, pero si no, no tire del cubreobjetos, ya que esto dañará las secciones.

En su lugar, sumerja el portaobjetos en SSC tibio 0,2 veces durante uno o dos minutos para lavar el deslizamiento de la cubierta después de quitar los cubreobjetos, coloque los portaobjetos en una rejilla y lave varias veces en 0,2 SSC a 55 grados centígrados. Después de un tratamiento con ARN, transfiera los portaobjetos de la rejilla a la parte inferior de una caja de plástico plana y cúbralos con un volumen mínimo de solución de bloqueo. Bloquee los portaobjetos durante 45 minutos a temperatura ambiente en una plataforma que se agite lentamente.

A continuación, aplique un volumen mínimo de solución de anticuerpos directamente sobre cada portaobjetos. Incuba los portaobjetos en la oscuridad durante dos o tres horas a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, transfiera los portaobjetos a una caja plana limpia y lave los portaobjetos cuatro veces con un volumen mínimo de tampón de lavado en una plataforma de agitación a temperatura ambiente.

Enjuague los portaobjetos una vez en TBS y dos veces en tampón TN para aplicar la solución de tinción recién preparada a los portaobjetos. Primero, vierta la solución de tinción en un pequeño plato de pesaje de plástico. A continuación, coloque dos diapositivas juntas con las secciones una frente a la otra.

Sumerge el sándwich en la solución, permitiendo que la acción capilar levante la solución. Escurre los portaobjetos con una toallita kim. Llene los portaobjetos con solución para manchar.

Una vez más, es posible que sea necesario golpear los portaobjetos a medida que la solución fluye para evitar burbujas, coloque los portaobjetos en una caja de plástico y almacene la temperatura ambiente en la oscuridad. Aquí se muestran los resultados representativos obtenidos con diferentes sondas y tejidos de arabidopsis. La señal púrpura proporciona una visualización directa a resolución celular del patrón de expresión del gen de interés.

El panel A muestra la localización de las transcripciones de Meli one en el ápice vegetativo. Nótese la presencia de señal azul púrpura en el indeterminado del meristemo y la falta de señal en las hojas circundantes. Los paneles B 2D son secciones de embriones en estadio de arabidopsis torpedo donde B muestra la expresión de covata tres en las pocas células madre embrionarias.

C muestra una expresión de T ML uno en la capa epidérmica, y D muestra la falta de señal en secciones sondeadas con un ARN de control negativo aleatorio. Las siguientes imágenes mostraron los resultados obtenidos con diferentes sondas en tejidos de laberinto. El panel E muestra la localización del STM Humalog anudado en el embrión laberíntico en desarrollo.

Obsérvese que la señal fuerte específicamente en las secciones longitudinales del tallo y la raíz del mes embrionario a través del ápice de la manga vegetativa muestra que ARF tres A se expresa en la superficie axial de la hoja inferior en el panel F y el A T ML un homólogo OCL cuatro se expresa específicamente en la epidermis. En el panel G.As se esperaba, no se observó ninguna señal de hibridación para la sonda de control negativo en el panel H. Aquí se muestran los resultados esperados de los diferentes puntos de control durante la transcripción in vitro de las sondas. Las sondas de hibridación in situ se comprueban en un gel ARAZ estándar después de la transcripción in vitro después del tratamiento con ADN y la posterior purificación de la reacción de transcripción in vitro Después de la hidrólisis de carbonatos y cuando están listas para su uso para sondas de más de 250 pares de bases de longitud, como la sonda uno, la hidrólisis de carbonato producirá una gama de fragmentos de sonda más pequeños.

Esta figura muestra los resultados de la calificación del color y la métrica de las sondas mediante diluciones de análisis de transferencia de puntos que van desde 10 a menos uno a 10 a menos cinco de una sonda de control de 100 nanogramos por microlitro y de tres, las sondas marcadas con DIG recién marcadas se detectan en una membrana de transferencia incubada con anticuerpo anti DIG y ensayo. El análisis sugiere una concentración estimada de 100 nanogramos por microlitro para la sonda dos, 10 nanogramos por microlitro para la sonda tres y un nanogramo por microlitro para la sonda cuatro, lo que indica que es poco probable que la sonda cuatro produzca una buena señal de inea a la hibridación. Por último, estas secciones longitudinales a través del vértice de la tolva vegetativa de Mace proporcionan una comparación entre una señal de fondo inespecífica y un panel de sonda que funciona bien.

A muestra una señal de fondo no específica, mientras que el panel B muestra una señal de hibridación in situ específica dos para la sonda OC cinco en la capa externa de la celda. Después de ver esto, deberías tener una buena idea de cómo realizar muchos de los pasos complicados en los protocolos de hibridación de inicio, de modo que puedas determinar los patrones precisos de expresión temporal de presión de tus adolescentes favoritos.