Name: Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Aprende hibridación in situ para localizar transcritos de ARN en tejidos vegetales embebidos en parafina. Este protocolo de alta sensibilidad permite visualizar patrones de expresión génica a nivel celular en plantas.

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Investigación en el laboratorio de MT es apoyado por becas de la National Science Foundation (DBI-0820610 y IOS 1022102) y el Departamento de Salud de Nueva York (NYSTEM-C024308). CM recibió becas postdoctorales del Ministerio español de Educación y Ciencia (2007-0937) y la Fundación Rafael del Pino, España.

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<li>Galbraith, D. W., Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+studies+of+cell+type-specific+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global studies of cell type-specific gene expression in plants.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).</li>
<li>Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+shoot+apical+meristem+of+maize+%28Zea+mays+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.).</a> Plant. J. 52, 391-404 (2007).</li>
<li>Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-mediated+repression+of+rolled+leaf1+specifies+maize+leaf+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity.</a> Nature. 428, 84-88 (2004).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
<li>Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+meristem+maintenance+is+controlled+by+a+GRAS-gene+mediated+signal+from+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells.</a> Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).</li>
<li>Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+domain+of+PHANTASTICA+determines+leaflet+placement+in+compound+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves.</a> Nature. 424, 438-443 (2003).</li>
<li>Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li>
<li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li>
<li>Kidner, C., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+as+a+tool+to+study+the+role+of+microRNAs+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development.</a> Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).</li>
<li>Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+of+KNOTTED1+mRNA+and+protein+reveals+multiple+potential+sites+of+protein+trafficking+in+the+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot.</a> 129, 1423-1429 (2002).</li>
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<li>Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+via+small+RNA+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation via small RNA mobility.</a> Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).</li>
<li>Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+procedure+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+mouse+embryos+and+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies.</a> Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+phyllotaxy+in+maize+by+the+abphyl1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene.</a> Development. , 126-315 (1999).</li>
<li>Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+SBP-box+transcription+factor+encoded+by+tasselsheath4+regulates+bract+development+and+the+establishment+of+meristem+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries.</a> Development. 137, 1243-1250 (2010).</li>
<li>Long, J. A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de hibridación in situ descrito aquí permite la visualización directa del patrón de expresión espacio-temporal de cualquier gen de interés con gran resolución celular, alta sensibilidad y especificidad. El protocolo no permite una comparación cuantitativa de los niveles de expresión entre los genes. Sin embargo, la alta sensibilidad del método y la resolución puede revelar los gradientes de expresión de los genes dentro de un tejido 8, 18, ​​que no es posible con la mayoría de los otros métodos de análisis de expresión génica. El protocolo incluye varios pasos, que pueden hacer que la solución de problemas problemática. Los pasos más críticos del protocolo son la fijación de los tejidos y la selección y el etiquetado de la sonda. Tejidos poco infiltrada y las sondas con la incorporación de DIG baja dará señales muy débiles que podrían ser difíciles de detectar por encima del fondo. Para cada nuevo gen de interés, es recomendable intentar unas cuantas sondas diferentes derivados de difealquiler regiones de la transcripción. Ocasionalmente, dos o tres sondas dirigidas a diferentes regiones más pequeñas del gen puede ser necesario combinar para obtener una señal de hibridación fuerte y específica. Además, las condiciones de hibridación, tales como la temperatura y la composición del tampón de hibridación, se puede optimizar para cada gen o tejidos para disminuir o aumentar el rigor de la hibridación. También la etapa de tratamiento de la proteasa es una variable y se puede cambiar para adaptar el protocolo de diferentes especies de plantas o para la detección de las transcripciones con muy escasa. La inclusión de las dos sondas de control positivo y negativo será útil para identificar los puntos problemáticos del protocolo. El procedimiento ha sido optimizado para parafina secciones de tejidos de plantas, pero con pequeñas modificaciones se puede utilizar también para todo el montaje hibridación in situ. Aunque se utiliza mucho en la investigación con animales, 19 de monte se hibridación in situ se limited a los tejidos vegetales que pueden ser fácilmente infiltrados, como los embriones, las raíces o los jóvenes tejidos meristemáticos 20,21. El protocolo también se puede modificar fácilmente para detectar simultáneamente dos ARNm diferentes transcripciones o localizar junto a las proteínas 15,22,23. Finalmente, es posible extender la aplicación de este método para la visualización de patrones de expresión de ARN pequeños en plantas. los patrones de expresión de miRNA se han determinado utilizando este protocolo, tanto en maíz y Arabidopsis 8,14. Más recientemente, el de las sondas in vitro transcritas han sido sustituidos por comercialmente disponibles marcada con DIG ácido nucleico cerrado (LNA) sondas oligo que aumentan la sensibilidad de la señal 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Producto </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4 oz </td><td> Pescador </td><td> 23-244-256 </td><td> A base de tolueno 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Pescador </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Ruta de los tejidos Paraplast Plus </td><td> Pescador </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + membrana de nylon Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNasa OUT; 40 U / l </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNasa libre de DNasa, 1 U / l </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-etiquetados control ARN </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA etiquetado mezcla </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimerasa 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNA polimerasa 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasa 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> se disuelven en 50% de glicerol 100 mM Tris pH 8,0 </td></tr><tr><td> El bloqueo de los reactivos </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Calentar a 70 º C en tampón TBS </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP, fragmentos Fab de oveja 150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP de la solución madre </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> Un paseo rápido mini-ARN Columnas </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA de E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida desionizada </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasa de Streptomyces griseus Tipo XIV </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Diluir en agua y milliQ predigieren 4 horas a 37 ° C </td></tr><tr><td> Trietanolamina </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Diluir en agua, llevar a pH 8,0 con HCl </td></tr><tr><td> El anhídrido acético </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de dextrano sal de sodio de Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Sulfato de dextrano se debe calentar a 80 º C para disolver. </td></tr><tr><td> Solución de Denhardt 50x Concentrate </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina sal disódica </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Se disuelven en 96 a 100% de etanol hasta saturación </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol absoluto prueba 200 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fenol / cloroformo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base de los moldes </td><td> Electrónica Microsocpy Ciencia </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Incorporación de los anillos </td><td> Pescador </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> Viales de centelleo de 20 ml desechables, con tapas </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda en más de diapositivas </td><td> Pescador </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Micro cubreobjetos 24x50 mm </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Papel Whatman 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Tres platos de cristal y un staialvo bastidor de acero de diapositivas </td><td> Electrónica Microsocpy Ciencia </td><td> 71420-25 </td><td> Dos de vidrio cóncavo son necesarios para el tratamiento histoclear y el último se utiliza para el tratamiento de anhídrido acético </td></tr><tr><td> 18 recipientes limpios de plástico </td><td> Electrónica Microsocpy Ciencia </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 o 3 grandes cajas planas de plástico con tapa precintable </td><td></td><td></td><td> necesarios para los pasos de hibridación y de anticuerpos </td></tr><tr><td> Pinceles finos </td><td></td><td></td><td> Ayudar a entregar cintas de cera </td></tr><tr><td> Micrótomo </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Sistema de autolimpieza de vacío en seco </td><td> Welch </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Deslice más cálido </td><td> Pescador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El bloque de calentamiento </td><td></td><td></td><td> necesarios a los 60 ° C y 85 ° C</td></tr><tr><td> Incubadora a 58-60 ° C </td><td> Pescador </td><td></td><td> Para ver los pasos con Paraplast fundido </td></tr><tr><td> Hornos o baños de agua de 55 ° C y 37 ° C </td><td> Pescador </td><td></td><td> Debido a la necesidad de un cambio rápido de temperatura entre dos </td></tr><tr><td> Centrífuga (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Campana extractora de humos </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Con los avances en la investigación genómica de la década pasada, la biología vegetal ha sido testigo de la presentación de numerosos estudios a gran escala análisis cuantitativo de la expresión génica. Microarrays y la próxima generación de métodos de secuenciación se utilizan para investigar los procesos de respuesta de desarrollo, fisiología y el estrés, diseccionar las vías de ARN epigenético y pequeños, y construir grandes redes de genes reguladores 1.3. Si bien estas técnicas facilitan el análisis simultáneo de grandes conjuntos de genes, por lo general ofrecen una resolución espacio-temporal muy limitado de cambios de expresión génica. Esta limitación puede superarse parcialmente usando perfiles método junto con lasermicrodissection o fluorescencia de células activadas por la clasificación 7.4. Sin embargo, para comprender plenamente el papel biológico de un gen, el conocimiento de su patrón espacio-temporal de la expresión a una resolución celular es esencial. En particular, cuando se estudia el desarrollo o los efectos ambientales de las ITSmuli y mutantes pueden el análisis detallado del patrón de expresión de un gen es esencial. Por ejemplo, sutiles diferencias cuantitativas en los niveles de expresión de los genes reguladores clave puede dar lugar a fenotipos dramática cuando se asocia con la pérdida o ganancia de expresión en tipos celulares específicos. Varios métodos se utilizan habitualmente para el examen detallado de los patrones de expresión génica. Una de ellas es a través del análisis de las líneas transgénicas reportero. Este análisis puede, sin embargo, se convierten en mucho tiempo en el análisis de múltiples genes o de trabajo en las plantas recalcitrantes a la transformación. Por otra parte, una validación independiente para asegurarse de que el patrón de expresión de los transgenes imita a la de los genes endógenos que normalmente se requiere. Localización de la proteína del ARNm inmunohistoquímica o hibridación in situ presentar alternativas relativamente rápido para la visualización directa de la expresión génica en las células y tejidos. Este último tiene la ventaja de que puede ser fácilmente used en cualquier gen de interés. La hibridación in situ permite la detección de ARNm diana en las células por hibridación con una etiqueta anti-sentido sonda de ARN obtenido mediante transcripción in vitro del gen de interés. Aquí resumimos un protocolo para la localización in situ de la expresión génica en las plantas que es altamente específica y sensibilidad. Está optimizado para su uso con paraformaldehído fijo, incluidos en parafina secciones, que dan una excelente conservación de la histología, y las sondas DIG-etiquetados que se visualizan por inmuno-detección y fosfatasa alcalina reacción colorimétrica. Este protocolo se ha aplicado con éxito a una serie de tejidos a partir de una amplia gama de especies de plantas, y puede ser utilizado para analizar la expresión de ARNm y ARN pequeños 8-14.

La<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridación aquí descrito permite una localización directa de los ARNm y la expresión de ARN pequeños en el nivel celular con alta sensibilidad y especificidad. El procedimiento ha sido optimizado para parafina secciones de tejidos vegetales, es aplicable a una amplia gama de plantas y tejidos, y puede ser completado dentro de los diez días.

Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

Con los avances en la investigación genómica de la última década, la biología vegetal ha sido testigo de numerosos estudios que presentan análisis cuantitativos a gran escala de genes...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los patrones de expresión de ARNm a nivel celular con alta sensibilidad y especificidad. Para lograrlo, primero se someten cortes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina a una serie de soluciones para eliminar la parafina, permeabilizar los tejidos y bloquear los grupos menores con carga positiva en los tejidos, los cuales pueden generar una señal de fondo. Posteriormente, se infiltra en los cortes de tejido una sonda de ARN marcada con DIG específica para el gen de interés y se realiza la hibridación de las laminillas durante la noche.A continuación, se tratan los portaobjetos con ARN. A para eliminar la sonda unida no específicamente de las secciones y luego se incuban con anticuerpo anti-DIG. Esto permite la visualización de la sonda hibridada mediante una reacción química colorimétrica.Los resultados muestran una señal azul oscuro detectable por microscopía óptica específicamente en aquellas células del tejido en las que se expresa el gen de interés. La principal ventaja de esta técnica frente a otros análisis de expresión, como la R-T-P-C-R, los micromatrices o los enfoques de secuenciación de nueva generación, es que el protocolo de hibridación in situ mostrado aquí revela el patrón de expresión de un gen de interés en su contexto tisular. Estos métodos incluyen muchos pasos que se aprenden mejor mediante demostraciones visuales.Mostraremos cómo seccionar e incluir tejidos, así como los pasos clave del protocolo de hibridación Al Hybridization que resultan difíciles de dominar por cuenta propia. El método de inclusión de tejidos fijados con paraformaldehído variará según el tipo de tejido que se analice. El punto más importante aquí es asegurar que las muestras estén correctamente orientadas para su posterior seccionado.Un método de inclusión consiste en utilizar moldes y anillos de plástico. Para comenzar este procedimiento, caliente los moldes en una placa calefactora a 60 grados Celsius y luego vierta parafina fundida en los moldes. A continuación, utilice pinzas calentadas para transferir una muestra de tejido a cada molde y colóquela en la posición deseada.Mueva cuidadosamente el molde desde la placa hasta la bancada y coloque el anillo blanco sobre el molde. Añada más mol y cera. Deje que la cera se enfríe y endurezca gradualmente antes de proceder al corte.Caliente los bloques a temperatura ambiente, luego corte cada bloque en forma de trapecio, dejando aproximadamente un milímetro de parafina alrededor de la muestra. Coloque el bloque recortado en el micrótomo de modo que la cara más larga de las dos caras paralelas quede en la parte inferior. Acérquese cuidadosamente con el bloque hacia la cuchilla y asegúrese de que la superficie del bloque esté paralela al corte de la cuchilla.Con un espesor de ocho a 10 micrones. Alinee las cintas de parafina sobre una superficie antiadherente, como papel de aluminio, y seleccione las secciones de interés bajo un microscopio de disección. A continuación, marque las laminillas prob bon plus con un lápiz.No utilice bolígrafos para marcar porque se borrarán durante el protocolo de hibridación INI. Distribuya un mililitro de agua millicuadra limpia sobre cada portaobjetos. Flote cuidadosamente las secciones de interés sobre la superficie del agua a temperatura ambiente.Asegúrese de que el lado brillante quede frente al agua. Transfiera la laminilla lentamente a una placa calefactora para portaobjetos. Ajuste la temperatura entre 35 y 37 grados Celsius.Este rango de temperatura, en contraste con los 42 grados Celsius comúnmente utilizados, evita la formación de burbujas bajo las secciones. Después de cinco minutos, vierta cuidadosamente el agua, pero en un solo movimiento suave, de modo que la tira se deposite sobre el portaobjetos. Deje secar los portaobjetos durante al menos varias horas o durante la noche a 37 grados Celsius para que el tejido se adhiera y quede preparado para las secciones de tejido.Para la hibridación in situ, primero se desparafinan y se rehidratan para la finalización de la desparafinización. Incube los portaobjetos en dos cambios de solución limpiadora de tejidos durante 10 minutos cada uno. Para rehidratar las secciones de tejido, pase los portaobjetos a través de una serie de concentraciones decrecientes de etanol durante 30 segundos cada una.Durante el tratamiento con proteasa, que no se muestra en este video, prepare un recipiente de vidrio con una solución de trietanolamina 0,1 molar y colóquelo sobre una placa agitadora en una campana extractora. Inmediatamente antes de colocar el portapocillos metálico en la solución, añada 1,25 mililitros de anhídrido acético a la trietanolamina, tampón y estante. Además, prepare el sistema de sujeción con abrazadera y el soporte para sostener el portapocillos.Reduzca la velocidad del agitador, sujete la rejilla de portaobjetos al soporte y baje la rejilla dentro de la solución, manteniéndola elevada por encima del agitador magnético. Continúe agitando lentamente durante 10 minutos después de enjuagar con PBS y deshidratar nuevamente mediante una serie de etanol. Las secciones de tejido están listas para la hibridación.Coloque los portaobjetos sobre una superficie limpia y deje secar al aire completamente durante cinco a diez minutos. Prepare la mezcla de tampón de hibridación de la sonda añadiendo la sonda desnaturalizada a 80 microlitros de tampón de hibridación. Para cada portaobjetos, mezcle bien mediante pipeteo, evitando formar burbujas.Coloque el tampón de hibridación de la sonda con una pipeta. Mézclelo en el borde derecho del portaobjetos. Baje gradualmente una cubreobjetos sobre el portaobjetos, asegurándose de que la solución de hibridación cubra todas las secciones sin formar burbujas.Toque ligeramente la cubierta con los dedos en los lugares donde se forman burbujas para desplazarlas de todas las secciones de tejido. No retire la cubierta, ya que esto dañaría las secciones. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad que contenga papel Watman humedecido con agua UE y cubierto en gran parte con parafina.Cierre herméticamente la caja e incube las laminillas a la temperatura deseada de hibridación, típicamente entre 50 y 55 grados Celsius durante 16 a 20 horas. Al finalizar el protocolo de hibridación, retire cuidadosamente las cubreobjetos de las laminillas. La cubreobjetos puede desprenderse simplemente al colocar la laminilla en posición vertical, pero si no es así, no tire de ella ya que esto dañaría las secciones.En cambio, sumerja el portaobjetos en SSC al 0,2 veces tibio durante uno o dos minutos para lavar la cubierta después de retirar las cubiertas, coloque los portaobjetos en una gradilla y lávelos varias veces en SSC al 0,2 veces a 55 grados Celsius. Tras el tratamiento con RNAsa, transfiera los portaobjetos desde la gradilla hasta el fondo de una caja de plástico plana y cúbralos con un volumen mínimo de solución bloqueante. Bloquee los portaobjetos durante 45 minutos a temperatura ambiente en una plataforma que se mueva lentamente. A continuación, aplique un volumen mínimo de solución de anticuerpo directamente sobre cada portaobjetos. Incube los portaobjetos a oscuras durante dos o tres horas a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, transfiera los portaobjetos a una caja plana limpia y lávelos cuatro veces con un volumen mínimo de tampón de lavado en una plataforma agitadora a temperatura ambiente.Lave las laminillas una vez con TBS y dos veces con tampón TN antes de aplicar la solución de tinción recién preparada. Primero, vierta la solución de tinción en un pequeño recipiente plástico para pesar. Luego, coloque dos laminillas juntas con las secciones enfrentadas entre sí.Sumerja el portaobjetos en sandwich en la solución, permitiendo que la acción capilar impulse la solución hacia arriba. Seque los portaobjetos sobre una toalla absorbente. Llene los portaobjetos con la solución de tinción.Nuevamente, puede ser necesario golpear ligeramente las laminillas mientras fluye la solución para evitar burbujas; coloque las laminillas en una caja de plástico y almacénelas a temperatura ambiente en la oscuridad. Aquí se muestran resultados representativos obtenidos con diferentes sondas y tejidos de Arabidopsis. La señal púrpura proporciona una visualización directa, con resolución celular, del patrón de expresión del gen de interés.El panel A muestra la localización de los transcritos de Meli en el ápice caulinar vegetativo. Observe la presencia de señal azul púrpura en la zona indeterminada del meristemo y la ausencia de señal en las hojas circundantes. Los paneles B a 2D son secciones de embriones de Arabidopsis en estadio torpedo, donde el panel B muestra la expresión de covata tres en las pocas células madre embrionarias.C muestra una expresión de T ML uno en la capa epidérmica, y D muestra la ausencia de señal en secciones analizadas con un ARN de control negativo aleatorio. Estas siguientes imágenes mostraron resultados obtenidos con diferentes sondas en tejidos de mazorca. El panel E muestra la localización de STM Humalog knotted uno en el embrión de mazorca en desarrollo.Observe la señal intensa específicamente en el meristemo embrionario y en secciones longitudinales de la raíz a través del ápice del embolsón vegetativo, que muestran que ARF tres A se expresa en la superficie axial inferior de la hoja en el panel F y que el homólogo A T ML uno OCL cuatro se expresa específicamente en la epidermis en el panel G. Como era de esperar, no se observó señal de hibridación para la sonda de control negativo en el panel H. Aquí se muestran los resultados esperados de los diferentes puntos de control durante la transcripción in vitro de las sondas. Las sondas de hibridación in situ se analizan en un gel ARAZ estándar tras la transcripción in vitro, tras el tratamiento con DNA'sas y la subsiguiente purificación de la reacción de transcripción in vitro, y tras la hidrólisis con carbonato. Cuando están listas para su uso, las sondas de más de 250 pares de bases de longitud, como la sonda uno, la hidrólisis con carbonato producirá una variedad de fragmentos más pequeños de la sonda.Esta figura muestra los resultados de la calificación cromática y métrica de sondas mediante análisis de dot blot con diluciones que van desde 10 a la menos uno hasta 10 a la menos cinco de una sonda control de 100 nanogramos por microlitro, así como de tres sondas marcadas recientemente con DIG. Las sondas se depositaron sobre una membrana de transferencia, que se incubó con anticuerpo anti-DIG y se analizó. El análisis sugiere una concentración estimada de 100 nanogramos por microlitro para la sonda dos, 10 nanogramos por microlitro para la sonda tres y 1 nanogramo por microlitro para la sonda cuatro, lo que indica que es poco probable que la sonda cuatro produzca una buena señal de hibridación. Finalmente, estas secciones longitudinales a través del ápice del brote vegetativo de Mace proporcionan una comparación entre una señal de fondo no específica y un panel de sondas que funciona adecuadamente.El panel A muestra una señal de fondo no específica, mientras que el panel B muestra una señal específica de hibridación in situ de doble marca para la sonda OC cinco en la capa celular externa. Después de ver esto, debería tener una buena idea de cómo realizar muchos de los pasos complicados en los protocolos de hibridación in situ, de manera que pueda determinar los patrones precisos de expresión espacial y temporal de sus genes de interés.

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