Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los patrones de expresión de ARNm a nivel celular con alta sensibilidad y especificidad. Para lograrlo, primero se someten cortes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina a una serie de soluciones para eliminar la parafina, permeabilizar los tejidos y bloquear los grupos menores con carga positiva en los tejidos, los cuales pueden generar una señal de fondo. Posteriormente, se infiltra en los cortes de tejido una sonda de ARN marcada con DIG específica para el gen de interés y se realiza la hibridación de las laminillas durante la noche.

A continuación, se tratan los portaobjetos con ARN. A para eliminar la sonda unida no específicamente de las secciones y luego se incuban con anticuerpo anti-DIG. Esto permite la visualización de la sonda hibridada mediante una reacción química colorimétrica.

Los resultados muestran una señal azul oscuro detectable por microscopía óptica específicamente en aquellas células del tejido en las que se expresa el gen de interés. La principal ventaja de esta técnica frente a otros análisis de expresión, como la R-T-P-C-R, los micromatrices o los enfoques de secuenciación de nueva generación, es que el protocolo de hibridación in situ mostrado aquí revela el patrón de expresión de un gen de interés en su contexto tisular. Estos métodos incluyen muchos pasos que se aprenden mejor mediante demostraciones visuales.

Mostraremos cómo seccionar e incluir tejidos, así como los pasos clave del protocolo de hibridación Al Hybridization que resultan difíciles de dominar por cuenta propia. El método de inclusión de tejidos fijados con paraformaldehído variará según el tipo de tejido que se analice. El punto más importante aquí es asegurar que las muestras estén correctamente orientadas para su posterior seccionado.

Un método de inclusión consiste en utilizar moldes y anillos de plástico. Para comenzar este procedimiento, caliente los moldes en una placa calefactora a 60 grados Celsius y luego vierta parafina fundida en los moldes. A continuación, utilice pinzas calentadas para transferir una muestra de tejido a cada molde y colóquela en la posición deseada.

Mueva cuidadosamente el molde desde la placa hasta la bancada y coloque el anillo blanco sobre el molde. Añada más mol y cera. Deje que la cera se enfríe y endurezca gradualmente antes de proceder al corte.

Caliente los bloques a temperatura ambiente, luego corte cada bloque en forma de trapecio, dejando aproximadamente un milímetro de parafina alrededor de la muestra. Coloque el bloque recortado en el micrótomo de modo que la cara más larga de las dos caras paralelas quede en la parte inferior. Acérquese cuidadosamente con el bloque hacia la cuchilla y asegúrese de que la superficie del bloque esté paralela al corte de la cuchilla.

Con un espesor de ocho a 10 micrones. Alinee las cintas de parafina sobre una superficie antiadherente, como papel de aluminio, y seleccione las secciones de interés bajo un microscopio de disección. A continuación, marque las laminillas prob bon plus con un lápiz.

No utilice bolígrafos para marcar porque se borrarán durante el protocolo de hibridación INI. Distribuya un mililitro de agua millicuadra limpia sobre cada portaobjetos. Flote cuidadosamente las secciones de interés sobre la superficie del agua a temperatura ambiente.

Asegúrese de que el lado brillante quede frente al agua. Transfiera la laminilla lentamente a una placa calefactora para portaobjetos. Ajuste la temperatura entre 35 y 37 grados Celsius.

Este rango de temperatura, en contraste con los 42 grados Celsius comúnmente utilizados, evita la formación de burbujas bajo las secciones. Después de cinco minutos, vierta cuidadosamente el agua, pero en un solo movimiento suave, de modo que la tira se deposite sobre el portaobjetos. Deje secar los portaobjetos durante al menos varias horas o durante la noche a 37 grados Celsius para que el tejido se adhiera y quede preparado para las secciones de tejido.

Para la hibridación in situ, primero se desparafinan y se rehidratan para la finalización de la desparafinización. Incube los portaobjetos en dos cambios de solución limpiadora de tejidos durante 10 minutos cada uno. Para rehidratar las secciones de tejido, pase los portaobjetos a través de una serie de concentraciones decrecientes de etanol durante 30 segundos cada una.

Durante el tratamiento con proteasa, que no se muestra en este video, prepare un recipiente de vidrio con una solución de trietanolamina 0,1 molar y colóquelo sobre una placa agitadora en una campana extractora. Inmediatamente antes de colocar el portapocillos metálico en la solución, añada 1,25 mililitros de anhídrido acético a la trietanolamina, tampón y estante. Además, prepare el sistema de sujeción con abrazadera y el soporte para sostener el portapocillos.

Reduzca la velocidad del agitador, sujete la rejilla de portaobjetos al soporte y baje la rejilla dentro de la solución, manteniéndola elevada por encima del agitador magnético. Continúe agitando lentamente durante 10 minutos después de enjuagar con PBS y deshidratar nuevamente mediante una serie de etanol. Las secciones de tejido están listas para la hibridación.

Coloque los portaobjetos sobre una superficie limpia y deje secar al aire completamente durante cinco a diez minutos. Prepare la mezcla de tampón de hibridación de la sonda añadiendo la sonda desnaturalizada a 80 microlitros de tampón de hibridación. Para cada portaobjetos, mezcle bien mediante pipeteo, evitando formar burbujas.

Coloque el tampón de hibridación de la sonda con una pipeta. Mézclelo en el borde derecho del portaobjetos. Baje gradualmente una cubreobjetos sobre el portaobjetos, asegurándose de que la solución de hibridación cubra todas las secciones sin formar burbujas.

Toque ligeramente la cubierta con los dedos en los lugares donde se forman burbujas para desplazarlas de todas las secciones de tejido. No retire la cubierta, ya que esto dañaría las secciones. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad que contenga papel Watman humedecido con agua UE y cubierto en gran parte con parafina.

Cierre herméticamente la caja e incube las laminillas a la temperatura deseada de hibridación, típicamente entre 50 y 55 grados Celsius durante 16 a 20 horas. Al finalizar el protocolo de hibridación, retire cuidadosamente las cubreobjetos de las laminillas. La cubreobjetos puede desprenderse simplemente al colocar la laminilla en posición vertical, pero si no es así, no tire de ella ya que esto dañaría las secciones.

En cambio, sumerja el portaobjetos en SSC al 0,2 veces tibio durante uno o dos minutos para lavar la cubierta después de retirar las cubiertas, coloque los portaobjetos en una gradilla y lávelos varias veces en SSC al 0,2 veces a 55 grados Celsius. Tras el tratamiento con RNAsa, transfiera los portaobjetos desde la gradilla hasta el fondo de una caja de plástico plana y cúbralos con un volumen mínimo de solución bloqueante. Bloquee los portaobjetos durante 45 minutos a temperatura ambiente en una plataforma que se mueva lentamente.

A continuación, aplique un volumen mínimo de solución de anticuerpo directamente sobre cada portaobjetos. Incube los portaobjetos a oscuras durante dos o tres horas a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, transfiera los portaobjetos a una caja plana limpia y lávelos cuatro veces con un volumen mínimo de tampón de lavado en una plataforma agitadora a temperatura ambiente.

Lave las laminillas una vez con TBS y dos veces con tampón TN antes de aplicar la solución de tinción recién preparada. Primero, vierta la solución de tinción en un pequeño recipiente plástico para pesar. Luego, coloque dos laminillas juntas con las secciones enfrentadas entre sí.

Sumerja el portaobjetos en sandwich en la solución, permitiendo que la acción capilar impulse la solución hacia arriba. Seque los portaobjetos sobre una toalla absorbente. Llene los portaobjetos con la solución de tinción.

Nuevamente, puede ser necesario golpear ligeramente las laminillas mientras fluye la solución para evitar burbujas; coloque las laminillas en una caja de plástico y almacénelas a temperatura ambiente en la oscuridad. Aquí se muestran resultados representativos obtenidos con diferentes sondas y tejidos de Arabidopsis. La señal púrpura proporciona una visualización directa, con resolución celular, del patrón de expresión del gen de interés.

El panel A muestra la localización de los transcritos de Meli en el ápice caulinar vegetativo. Observe la presencia de señal azul púrpura en la zona indeterminada del meristemo y la ausencia de señal en las hojas circundantes. Los paneles B a 2D son secciones de embriones de Arabidopsis en estadio torpedo, donde el panel B muestra la expresión de covata tres en las pocas células madre embrionarias.

C muestra una expresión de T ML uno en la capa epidérmica, y D muestra la ausencia de señal en secciones analizadas con un ARN de control negativo aleatorio. Estas siguientes imágenes mostraron resultados obtenidos con diferentes sondas en tejidos de mazorca. El panel E muestra la localización de STM Humalog knotted uno en el embrión de mazorca en desarrollo.

Observe la señal intensa específicamente en el meristemo embrionario y en secciones longitudinales de la raíz a través del ápice del embolsón vegetativo, que muestran que ARF tres A se expresa en la superficie axial inferior de la hoja en el panel F y que el homólogo A T ML uno OCL cuatro se expresa específicamente en la epidermis en el panel G. Como era de esperar, no se observó señal de hibridación para la sonda de control negativo en el panel H. Aquí se muestran los resultados esperados de los diferentes puntos de control durante la transcripción in vitro de las sondas. Las sondas de hibridación in situ se analizan en un gel ARAZ estándar tras la transcripción in vitro, tras el tratamiento con DNA'sas y la subsiguiente purificación de la reacción de transcripción in vitro, y tras la hidrólisis con carbonato. Cuando están listas para su uso, las sondas de más de 250 pares de bases de longitud, como la sonda uno, la hidrólisis con carbonato producirá una variedad de fragmentos más pequeños de la sonda.

Esta figura muestra los resultados de la calificación cromática y métrica de sondas mediante análisis de dot blot con diluciones que van desde 10 a la menos uno hasta 10 a la menos cinco de una sonda control de 100 nanogramos por microlitro, así como de tres sondas marcadas recientemente con DIG. Las sondas se depositaron sobre una membrana de transferencia, que se incubó con anticuerpo anti-DIG y se analizó. El análisis sugiere una concentración estimada de 100 nanogramos por microlitro para la sonda dos, 10 nanogramos por microlitro para la sonda tres y 1 nanogramo por microlitro para la sonda cuatro, lo que indica que es poco probable que la sonda cuatro produzca una buena señal de hibridación. Finalmente, estas secciones longitudinales a través del ápice del brote vegetativo de Mace proporcionan una comparación entre una señal de fondo no específica y un panel de sondas que funciona adecuadamente.

El panel A muestra una señal de fondo no específica, mientras que el panel B muestra una señal específica de hibridación in situ de doble marca para la sonda OC cinco en la capa celular externa. Después de ver esto, debería tener una buena idea de cómo realizar muchos de los pasos complicados en los protocolos de hibridación in situ, de manera que pueda determinar los patrones precisos de expresión espacial y temporal de sus genes de interés.