Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

E. Coli RP 4 37 se introducen en un dispositivo de quimiotaxis donde se exponen a una concentración espacial definida. Las celdas de gradientes que ingresan a la cámara se encuentran con el punto medio del gradiente de concentración. Dependiendo de si la señal se percibe como atrayente o repelente, las bacterias se mueven rápidamente hacia arriba o hacia abajo en el gradiente de concentración.

Hola, soy Derek Engler del Laboratorio de Biotecnología de Sistemas Moleculares y del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Texas a y m. Hoy le mostraremos un procedimiento que investiga los impuestos de la quimioterapia bacteriana en un dispositivo microfluídico. Utilizamos este procedimiento en nuestros laboratorios para estudiar cómo la e. coli RP 4 37 migra en el gradiente de concentración de sulfato de níquel.

Así que comencemos. La capa fluida y la capa de control se fabrican mediante moldeo de réplica de polimetilsuboxano o PDMS del maestro SU ocho. Para comenzar este procedimiento, mezcle el prepolímero PDMS y el reticulante en una proporción de peso de 10 a uno.

Desgasificar la mezcla en un desecado durante una hora hasta que se eliminen las burbujas de aire. Cuando la mezcla PDMS esté lista, coloque el SU eight master en una placa de Petri y vierta con cuidado la mezcla encima del SU eight master hasta el espesor deseado. La placa de Petri que contiene el PDMS y el molde maestro SU ocho a 80 grados centígrados durante dos horas para curar el PDMS.

Después de dos horas, retire el maestro SSU ocho cubierto de PDMS curado de la placa calefactora y retire el molde de PDMS del maestro SU ocho. La estructura deseada se incrustará en el molde de PDMS utilizando un punzón de aguja de extremo romo de calibre 20 cuatro orificios en el molde de PDMS para la tubería al generador de gradiente, la entrada de la celda y la salida de la celda. Ahora estamos listos para ensamblar el dispositivo PDMS para unir el dispositivo PDMS.

Primero, limpie un portaobjetos de microscopio de vidrio con isopropanol y pruébelo con un Airstream. A continuación, exponga el molde de PDMS y el portaobjetos de vidrio al plasma de oxígeno en un grabador de plasma durante unos 30 segundos. Ponga el molde de PDMS en contacto con el portaobjetos de vidrio Caliente el portaobjetos en contacto y el molde de PDMS a 65 grados centígrados en una placa calefactora durante 15 minutos.

Para ensamblar el dispositivo PDMS, use una cuchilla de afeitar para cortar el tubo en un ángulo de 45 grados a la longitud correcta requerida según la configuración del microscopio. Luego, usando fórceps. Inserte un extremo del tubo en uno de los cuatro orificios perforados en el dispositivo.

Inserte un cubo de aguja romo de calibre 30 en el otro extremo del tubo. Repita la inserción del tubo y el cubo de la aguja para todos los orificios restantes. Cargue un mililitro de impuestos de quimioterapia, tampón o CB en una jeringa de tres mililitros.

Tenga cuidado de eliminar el aire de la jeringa. Añada CB al cubo de la aguja de salida con una pipeta y golpee el cubo de la aguja para eliminar las burbujas de aire. Empuje un poco de CB fuera de la punta de la jeringa de tres mililitros y conecte la jeringa al cubo de la aguja sin atrapar aire.

Empuje el CB a través del dispositivo hasta que todos los cubos de la aguja restantes estén llenos de cb. Esto debería eliminar la mayoría de las burbujas de aire. A continuación, llene dos jeringas de 500 microlitros con CB que contengan las concentraciones adecuadas del efector de quimioterapia que se está analizando.

Elimine la formación de burbujas de aire empujando una pequeña gota del contenido de la jeringa y tocando las gotas del líquido en el cubo de la aguja y colocando la jeringa para preparar bacterias altamente móviles. Para el experimento de quimiotaxis, cultive un cultivo nocturno de E. coli RP 4 37 con una expresión de GFP, plásmido en caldo de triptón o TB a 32 grados Celsius con agitación al día siguiente. Utilice el cultivo nocturno para inocular un cultivo de 20 mililitros de TB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros a una densidad óptica de 600 nanómetros de aproximadamente 0,05.

Cultive el cultivo a 32 grados Celsius con agitación cuando las células estén a un diámetro exterior de 600 de aproximadamente 0,35 a 0,45. Cosechéelas por centrifugación a baja velocidad y resus suspenda las células a un OD 600 de aproximadamente 0,35 en CB que contienen el efecto de quimioterapia a la concentración esperada en el centro del canal. Por último, agregue las células muertas marcadas con RFP en el número D 600 de aproximadamente 0,35 a las células vivas que expresan GFP.

Estas células muertas serán un control interno para garantizar que cualquier migración no se deba a efectos de flujo. La suspensión celular ya está lista para ser cargada en el dispositivo microfluídico para el experimento de quimiotaxis. Para comenzar el experimento de quimiotaxis, retire parte del CB del rellenado del cubo de la aguja de entrada de la célula con la suspensión de la célula.

Llene suavemente una jeringa de 50 microlitros con las células resuspendidas. Hazlo lentamente, ya que los flagelos se pueden cortar, lo que reducirá la motilidad. Conecte la jeringa de 50 microlitros al cubo de la aguja de entrada como se muestra anteriormente empujando una pequeña gota del contenido de la jeringa y tocando la gota con el líquido en el cubo de la aguja y colocando la jeringa en la platina de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la adquisición de imágenes.

Coloque ambas jeringas de entrada en la bomba de jeringa e inicie el flujo de manera que se forme el gradiente y las células fluyan a través del tubo. Una vez que las células ingresan a la cámara de impuestos de quimioterapia, espere unos 20 minutos para que el sistema se estabilice. Antes de la obtención de imágenes, recoja imágenes de fluorescencia verde y roja muerta en diferentes lugares a lo largo de la cámara.

Por lo general, recopilamos 100 imágenes en cada ubicación a intervalos de tres segundos. Las imágenes de fluorescencia adquiridas se pueden analizar utilizando cualquier programa de análisis de imágenes disponible en el mercado, como Image J o metamorph, o utilizando códigos simples escritos en matlab. En este ejemplo, usaremos códigos de MATLAB.

Comience por eliminar los píxeles de fondo de la imagen a través de esta intensidad de píxel de umbral establecida y elimine todos los píxeles que tengan una intensidad inferior al umbral. Esto minimiza el ruido. En el análisis, utilice la posición de las células muertas para determinar el centro de la imagen.

Esto representa la posición donde las células entraron en la cámara de quimiotaxis y donde se detectarían en ausencia de cualquier migración. A continuación, ubique las células vivas en la imagen, divida la imagen en canales y determine el número de células vivas en cada canal. En nuestro trabajo anterior, la cámara de impuestos de quimioterapia de 10 50 micrómetros de ancho se dividió en 64 canales de aproximadamente 16 micrómetros de ancho cada uno.

Después de repetir estos pasos para todas las imágenes, algunos de los recuentos totales de celdas para cada canal en todas las imágenes. Esto da el recuento total de células detectadas en cada canal durante la duración del experimento. Calcular los impuestos de quimioterapia, el coeficiente de partición o CPC, que representa la dirección de la migración.

Al realizar los siguientes pasos, asigne un multiplicador de más uno y menos uno a cada celda ubicada en los lados de alta concentración o baja concentración o izquierda de las celdas muertas respectivamente. Suma todos los valores multiplicados y normaliza al número total de celdas detectadas. Calcule los impuestos de quimioterapia, el coeficiente de migración o CMC, que pondera la migración de células por la distancia recorrida.

A una célula que se desplaza al canal 64 de posición de alta concentración más alejada se le asigna un factor de ponderación de más uno, mientras que a una que se desplaza a mitad de camino hacia el lado de mayor concentración se le asigna un factor de ponderación de más 0,5 y una célula. Moverse a la posición de baja concentración más lejana se pondera en menos uno. Algunos de todos los recuentos de células ponderados y normalizados al número de células para generar el CMC.

Este gráfico muestra un gradiente o perfil de concentración lineal formado en el dispositivo microfluídico utilizando isotiocianato de fluoresceína. La formación de un gradiente de concentración se demuestra en esta figura utilizando tintes de color azul y amarillo. La entrada de la celda era CA por lo que no había flujo a través de ella, y se puede ver que se forma una gama de colores entre el azul y el amarillo.

A continuación, se muestran imágenes en pseudocolor de un experimento representativo de quimiotaxis en el que la E. coli RP 4 37 se expuso a un gradiente de cero a 100 micromolares de L aspartato o de cero a 225 micromolares de sulfato de níquel en el dispositivo. Se obtuvieron imágenes de la migración de bacterias verdes vivas hacia el aspartato o lejos del níquel cada 2,5 segundos durante 30 minutos. Las bacterias muertas que se muestran en rojo sirvieron como control de los efectos del flujo en el dispositivo.

En este gráfico se muestra la distribución espacial de RP 4 37 en el dispositivo microfluídico en ausencia de gradiente en comparación con su respuesta a un gradiente de aspartato y un gradiente de sulfato de níquel. Acabamos de mostrarle cómo controlar los impuestos de quimioterapia de la E. coli RP 4 37 en un gradiente de sulfato de níquel. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar el vórtice de las células para que se pueda utilizar una subpoblación de alta motilidad.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.