Name: Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende a cuantificar la quimiotaxis bacteriana en gradientes estables usando un dispositivo microfluídico con E. coli RP 4 37. Este método permite estudiar el movimiento dirigido de bacterias hacia atrayentes o repelentes.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0846453).

1. Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía 1 (no se muestra en este video). <ol><li> El uso estándar de SU-8 métodos de fotolitografía para crear un SU-8 "maestro" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) para la fabricación del molde PDMS que contiene la red de microfluidos y cámara de quimiotaxis. Moldes como maestro se pueden fabricar en cualquier centro de microfabricación (por ejemplo, Stanford microfluídica de fundición; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Antes de la replicación PDMS, exponer el SU-8 amo a fluorosilane vapor en un desecador conectado a una fuente de vacío para facilitar la liberación fácil de PDMS del maestro. Añadir una gota de fluorosilane a una toalla de papel y aplicar vacío durante un minuto. Retire el vacío y dejar 30 minutos para la deposición de fluorosilane. Mantenga el SU-8 maestro en un recipiente cerrado para su uso futuro. </li></ol> 2. Moldeo réplica de PDMS de SU-8 master: La capa de fluido y la capa de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestro. <ol><li> Mezclar el PDMS pre-polímero y la cruz enlazador en un peso de 10:01. relación y desgasificar en un desecador durante 1 hora (o hasta que las burbujas de aire de la mezcla de PDMS). </li><li> Coloque el SU-8 maestro en una placa de Petri y con cuidado vierta la mezcla de PDMS en la parte superior de la SU-8 amo hasta el grosor deseado. </li><li> Calentar la cápsula de Petri que contiene el PDMS y el SU-8 molde maestro a 80 ° C durante dos horas para curar el PDMS. </li><li> Quite la cubierta de curado PDMS SU-8 maestros de la placa y la cáscara del molde PDMS de la SU-8 maestro. La estructura deseada se integrará en el molde de PDMS. </li><li> Haga agujeros en el molde de PDMS para la tubería del generador de gradiente y la entrada de la celda con un calibre 20 de extremo romo de la aguja. </li></ol> 3. La vinculación de los dispositivos de PDMS: <ol><li> Limpiar un portaobjetos de vidrio con isopropanol y se seca con nitrógeno o una corriente de aire. </li><li> Exponer el PDMS y portaobjetos de vidrio de plasma de oxígeno en un incinerador de plasma. </li><li> Lleva el molde de PDMS en contacto con la lámina de vidrio. El calor de la diapositiva en contacto con el moho y PDMS a 65 ° C durante 15 min. </li></ol> 4. Montaje del dispositivo de PDMS <ol><li> Usando una hoja de afeitar, cortar los tubos en un ángulo de 45 ° a la longitud correcta requerida para el dispositivo. </li><li> Inserte un extremo del tubo en los agujeros perforados en el dispositivo (por ejemplo, de salida) el uso de fórceps. </li><li> Con unas pinzas, inserte un objeto contundente de calibre 30 aguja en el otro extremo de la tubería. </li><li> Repita el paso 4.2 para todos los hoyos restantes. </li><li> Recoger 1 ml de buffer de la quimiotaxis (CB) en una jeringa de 3 ml, teniendo cuidado de eliminar las burbujas de aire de la jeringa. </li><li> Fijar una base de la aguja en un extremo de la tubería de salida. </li><li> Añadir CB a la base de la aguja, y toque en el pabellón de la aguja para eliminar cualquier burbuja de aire. </li><li> Empujar un poco más de CB de la punta de la jeringa y conectar la jeringa 3 ml a la base de la aguja sin atrapamiento de aire. </li><li> Push CB a través del dispositivo hasta que todos los centros de aguja restantes se rellenan con con el CB. Esto debería eliminar la mayoría de las burbujas de aire. </li><li> Llenar dos jeringas con 500μL CB contienen las concentraciones adecuadas de la chemoeffector se está probando. Eliminar la formación de burbujas de aire, empujando un pequeño descenso del contenido de la jeringa y tocar la gota del líquido en la base de la aguja y colocar. </li><li> Del mismo modo, conectar una jeringa que contiene CB a la entrada de bacterias. Esto se quitará cuando las bacterias se introducen en el dispositivo. </li></ol> 5. Crecimiento de la gran movilidad E. coli <ol><li> Crecer cultivos de una noche de E. coli RP437 con una expresión de plásmido GFP en 20 ml de caldo de triptona (TB) a 32 ° C con agitación. Añadir las concentraciones adecuadas de antibióticos para mantener el plásmido. En nuestro protocolo, se utiliza un plásmido pCM182 bajos copia para la detección de las bacterias sobre la base de la fluorescencia en el dispositivo. Para E. coli, cultivos en crecimiento a 32 ° C se recomienda para la movilidad de alta, como la movilidad es menor a temperaturas más altas. </li><li> Utilice el cultivo de una noche para inocular un cultivo de 20 ml de la tuberculosis en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a una densidad óptica a 600 nm de ~ 0,05. Mantener el cultivo con agitación a 32 ° C. </li><li> Recoger las células en un 600 OD de 0.35 ~ 0.45 por centrifugación a baja velocidad a 400 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender las células a un OD 600 de ~ 0,35 en CB contiene el chemoeffector en la concentración prevista en el medio del canal. </li><li> Añadir RFP marcado con las células muertas con un diámetro exterior de 600 ~ 0,35 a las células que expresan GFP-vivir. Los muertos (rojo), las células se utilizan como un control interno para garantizar que cualquier migración no es debido a los efectos de flujo. </li></ol> 6. Quimiotaxis de vigilancia <ol><li> Eliminar algunos de los CB de la aguja de entrada de la celdacentro. Rellenar con la suspensión celular. </li><li> Llenar la jeringa con suavidad 50μL con las células resuspendidas. Este paso se debe hacer lentamente a medida que los flagelos puede ser cortado y reduce la motilidad. </li><li> Conecte la jeringa 50μL a la entrada del centro con aguja como se describe en el paso pasos 4.10. </li><li> Colocar el dispositivo en el escenario de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la adquisición de imágenes. Las jeringas de entrada (tanto en el gradiente de 500 jeringas de l y la jeringa de 50 células l) en la bomba de jeringa e iniciar el flujo de tal manera que el gradiente se forma de las células y circula por la tubería. </li><li> Una vez que las células entran en la cámara de quimiotaxis, espere aproximadamente 20 minutos para que el sistema se estabilice antes de la imagen. </li><li> Recoger verde (en vivo) y rojo (muertos) imágenes de fluorescencia en diferentes lugares a lo largo de la longitud de la cámara (que corresponden a diferentes tiempos de exposición). Típicamente, recopilamos 100 imágenes en cada lugar en intervalos de 3 segundos. </li></ol> 7. Análisis de datos: Los siguientes pasos se pueden realizar utilizando cualquier programa de análisis de imagen disponibles en el mercado (por ejemplo, ImageJ, Metamorph) o el uso de códigos simples en Matlab. <ol><li> Eliminar los píxeles de fondo en la imagen (es decir, la intensidad de establecer el umbral de píxeles y eliminar todos los píxeles que tienen menos intensidad que el umbral). Esto minimiza el ruido en el análisis. </li><li> Use la posición de las células muertas (fluorescencia roja) para determinar el centro de la imagen. Dado que las células muertas no muestran quimiotaxis, lo que representa la posición en células entraron en la cámara de quimiotaxis y se detecta en la ausencia de migración. </li><li> Localizar las células vivas (fluorescencia verde) en la imagen. </li><li> Dividir la imagen en canales y determinar el número de células vivas en cada canal. En nuestro trabajo previo 3, la cámara de 1.050 m de ancho quimiotaxis se divide en 64 canales que son cada uno a 16 micras de ancho. </li><li> Repita los pasos 7,1 7,3 para todas las imágenes y la suma total de células para cada canal a través de todas las imágenes. Esto le da al número total de células detectadas en cada canal durante la duración del experimento. </li><li> Calcular el coeficiente de partición quimiotaxis (CPC), que representa la dirección de la migración, de la siguiente manera: Cada celda ubicada en la alta concentración (derecha) y baja concentración (izquierda) partes de las células muertas se le asigna un multiplicador de 1 y -1 , respectivamente. Es decir, una célula que migra hacia un gradiente se multiplica por 1, mientras que las células en movimiento a favor del gradiente se multiplican por -1. Todos los valores multiplicados se suman y se normalizaron con el número total de células detectadas. Por ejemplo, un valor de CPC de 0,40 indica que el 40% más del total de bacterias se trasladó a la parte alta concentración de la parte baja concentración (es decir, el chemoeffector es un atractivo a medida que más se detectaron bacterias subiendo la pendiente). </li><li> Calcular el coeficiente de migración quimiotaxis (CMC), que pesa la migración de las células por la distancia recorrida, de la siguiente manera: Peso contar las células en cada canal por un factor que es proporcional a la distancia que las células migran. Una célula que se mueve hasta el más alejado de la alta concentración de la posición (canal 64) se da un factor de ponderación de 1, mientras que uno que se mueve a medio camino en el lado de mayor concentración se da un factor de ponderación de 0,5, y una célula de trasladarse a la más lejana baja concentración posición ponderada por -1. Resumiendo todos los recuentos de células ponderada y normalizar el número de células para generar el CMC. </li></ol> Los resultados representativos 3,4: Hemos utilizado el dispositivo de microfluidos (Figura 1) se describe aquí para investigar la quimiotaxis de los E. coli en los gradientes de atrayentes (ácido aspártico, autoinductor-2) y repelentes (NiSO4, indol) 3,4. El prototipo de la quimiotaxis cepa 5 E. coli RP437 GFP expresión se utilizó, junto con la kanamicina mató E. coli TG1 células que expresan la proteína fluorescente de color rojo para vigilar los efectos de flujo. El gradiente de concentración formado en el dispositivo μFlow se muestra en la Figura 1B. La entrada de la celda era máximo, de forma que no hay flujo a través de ella y un gradiente estable de 0 a 100 ng / mL de fluoresscein se estableció en el dispositivo. La intensidad de los píxeles a través del dispositivo se utilizó para determinar el perfil de concentración de fluoresceína. Los datos muestran que las bacterias encuentran un gradiente lineal cuando entran en la cámara de quimiotaxis. Figura 2A y B muestra imágenes de fluorescencia de E. coli RP437 migrar en respuesta a gradientes de ácido aspártico (0 100 mM) y NiSO4 (0 225 M). Las respuestas observadas a estos atrayente y repelente canónicos son como se predijo. Figura 3A muestra la distribución cuantificada de E. coli RP437 en ausencia de un gradiente de concentración (es decir, la pendiente nula de ácido aspártico), mientras queFiguras 3B y C muestran la distribución de los gradientes de ácido aspártico y NiSO4. La especificidad de estas respuestas (es decir, el sesgo en la migración) es evidente, como E. coli cepa RP437 Δ tar (es decir, que carecen de la cepa quimiorreceptores alquitrán que se utiliza en E. coli para detectar el ácido aspártico y níquel), no demuestra la tendencia de la migración en la presencia de un gradiente de concentración de ácido aspártico o NiSO4. Las tendencias observadas en los perfiles de distribución espacial son también consistentes con los valores calculados CPC y CMC. Los valores de CPC para la migración de E. coli RP437 en los gradientes de ácido aspártico o NiSO4 son 0,33 y -0,33, respectivamente. Los correspondientes valores de CMC son 0,13 y -0,14, respectivamente. Por el contrario, la CPC y CMC valores con el E. RP437 Δ coli cepa de alquitrán en los gradientes de ácido aspártico o NiSO4 son insignificantes. Además, el CPC y CMC en un gradiente nulo de ácido aspártico son 0,03 y 0,02, respectivamente, e indican la ausencia de sesgos en la migración en la ausencia de un gradiente. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1. Dispositivo esquemático y un gradiente de concentración. (A) Representación esquemática del dispositivo de la quimiotaxis de microfluidos. El dispositivo consta de un módulo de gradiente de mezcla (20 x 100 x 18 750 m) y un módulo de observación de la quimiotaxis (20 x 1050 x 11500 mm). El ancho de los dos canales gradiente entren en el dispositivo es de 500 micras y el ancho de la entrada de las bacterias es de 50 micras. El recuadro muestra un gradiente de moléculas de señalización (gris) y las bacterias que migran en respuesta a la misma. Bacterias vivas son representados como óvalos sólido, mientras que las bacterias muertas se muestran como óvalos abiertos. (B) un gradiente de concentración entre 0 y 100 ng / mL de fluoresceína fue generada en el dispositivo y utilizando imágenes de microscopía de fluorescencia. Imágenes de fluorescencia fueron adquiridas después de 30 minutos y se cuantificó mediante análisis de imágenes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Quimiotaxis de los E. coli RP437 en el dispositivo de microfluidos. E. coli RP437 fue expuesto a un gradiente de (A) 000 a 100 M de L-aspartato, o (B) 0-225 NiSO4 M en el dispositivo y la migración de bacterias vivas (verde) sobre la L-aspartato o fuera de níquel imágenes cada segundo 2,5 durante 30 minutos. Las bacterias muertas (rojo) sirvió como control para los efectos de flujo en el dispositivo. Las imágenes fueron cuantificados usando un in-house desarrollado análisis programa3. Los datos mostrados son pseudo-color imágenes de tres experimentos independientes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figura 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figura 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3c"> Figura 3: Cuantificación de los perfiles de la migración a un atrayente y repelente canónica. Distribución espacial de la RP437 en el dispositivo de microfluidos en respuesta a (A) uniforme de 100 mM L-aspartato (es decir, sin gradiente), (B) un gradiente de 0 100 M de aspartato, y (C) un gradiente de 0 225 M de NiSO4 . La distribución de las células muertas se muestra como una línea continua, la distribución de células RP437 se muestra como una línea discontinua, y la distribución de células RP437 eda + Δ alquitrán se muestra como una línea de puntos. Los datos mostrados son en promedio de tres experimentos independientes.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

El coeficiente de partición de la quimiotaxis (CPC) y el coeficiente de migración de la quimiotaxis (CMC) se puede calcular como se describe en Mao et al 5. Si una célula se detecta en el lado de alta concentración, se le da un valor de 1, mientras que una célula detecta en la parte baja concentración se da un valor de -1. Los valores se suman y se dividen entre el número total de células para generar el CPC. El signo de la CPC (positivo o negativo) de la dirección de la migración (hacia o lejos de ...

un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Quimiotaxis permite que las bacterias de acercarse a las fuentes de sustancias atrayentes o para evitar las fuentes de productos químicos repelentes. Las bacterias controlan constantemente la concentración de chemoeffectors específicos mediante la comparación de la concentración actual de la concentración detectada unos segundos antes. Esta comparación determina la dirección neta de movimiento. A pesar de múltiples gradientes, que compiten a menudo coexisten en la naturaleza, los enfoques convencionales para la investigación de la quimiotaxis bacteriana son óptimas para la cuantificación de la migración en respuesta a los gradientes de concentración de atrayentes y repelentes. Aquí se describe el desarrollo de un modelo de quimiotaxis de microfluidos para la presentación de los gradientes de concentración precisa y estable de chemoeffectors a las bacterias y cuantitativamente la investigación de su respuesta al gradiente aplicado. El dispositivo es muy versátil en el que los gradientes de concentración de cualquier concentración deseada absoluta y la fuerza del gradiente puede ser fácilmente generados por la mezcla difusiva. El dispositivo se demuestra mediante la respuesta de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 a los gradientes de los aminoácidos y iones de níquel.

Este protocolo describe el desarrollo de un dispositivo de microfluidos para la investigación de la quimiotaxis bacteriana en los gradientes de concentración estable de chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

La quimiotaxis permite que las bacterias se aproximen a fuentes de sustancias químicas atractoras o eviten fuentes de sustancias químicas repelentes. Las bacterias monitorizan constantemente el...

Se introducen E Coli RP 4 37 en un dispositivo de quimiotaxis en el que se exponen a una concentración espacial definida. Los gradientes a los que las células se enfrentan al entrar en la cámara encuentran el punto medio del gradiente de concentración. Dependiendo de si la señal se percibe como un atrayente o un repelente, las bacterias se desplazan rápidamente hacia arriba o hacia abajo según el gradiente de concentración.Hola, soy Derek Engler del Laboratorio de Biotecnología Molecular de Sistemas y del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para investigar la quimiotaxis bacteriana en un dispositivo microfluídico. Utilizamos este procedimiento en nuestros laboratorios para estudiar cómo E. coli RP437 migra en un gradiente de concentración de sulfato de níquel.Así que comencemos. La capa fluidica y la capa de control se fabrican mediante moldeo por réplica de Polymethyl SUBOXANE o PDMS a partir del molde maestro SU ocho. Para iniciar este procedimiento, mezcle el prepolímero de PDMS y el agente de reticulación en una proporción de 10 a 1 en peso.Degase la mezcla en un desecador durante una hora hasta que se eliminen las burbujas de aire. Cuando la mezcla de PDMS esté lista, coloque el molde maestro SU-8 en una placa de Petri y vierta cuidadosamente la mezcla sobre el molde maestro SU-8 hasta alcanzar el grosor deseado. Incube la placa de Petri que contiene el PDMS y el molde maestro SU-8 a 80 grados Celsius durante dos horas para curar el PDMS.Después de dos horas, retire el PDMS curado cubierto con el molde maestro SU-8 de la placa calefactora y despegue el molde de PDMS del molde maestro SU-8. La estructura deseada quedará incrustada en el molde de PDMS; utilice una aguja romo de calibre 20 para perforar cuatro orificios en el molde de PDMS para conectar los tubos al generador de gradientes, la entrada celular y la salida celular. Ahora estamos listos para ensamblar el dispositivo de PDMS y unirlo.Primero, limpie una placa de microscopio de vidrio con isopropanol y séquela con una corriente de aire. A continuación, exponga el molde de PDMS y la placa de vidrio al plasma de oxígeno en un grabador de plasma durante aproximadamente 30 segundos. Ponga en contacto el molde de PDMS con la placa de vidrio. Caliente la placa y el molde de PDMS en contacto sobre una placa calefactora a 65 grados Celsius durante 15 minutos.Para ensamblar el dispositivo de PDMS, use una cuchilla para cortar el tubo en un ángulo de 45 grados a la longitud correcta necesaria según el equipo del microscopio. Luego, usando pinzas, inserte un extremo del tubo en uno de los cuatro orificios perforados en el dispositivo.Inserte el casquillo de una aguja roma de calibre 30 en el otro extremo del tubo. Repita la inserción del tubo y el casquillo de la aguja en todos los orificios restantes. Cargue un mililitro de quimiotácticos, tampón o CB en una jeringa de tres mililitros.Teniendo cuidado de eliminar el aire de la jeringa. Añada CB al conector de la aguja de salida mediante una pipeta y golpee suavemente el conector para eliminar cualquier burbuja de aire. Exprese un poco de CB desde la punta de la jeringa de tres mililitros y conecte la jeringa al conector de la aguja sin atrapar aire.Empuje el CB a través del dispositivo hasta que todas las conexiones restantes de la aguja estén llenas de CB. Esto debería eliminar la mayor parte de las burbujas de aire. A continuación, llene dos jeringas de 500 microlitros con CB que contenga las concentraciones adecuadas del efector químico que se está probando.Elimine la formación de burbujas de aire expulsando una pequeña gota del contenido de la jeringa y tocando las gotas del líquido en el cono de la aguja, y luego fije la jeringa para preparar bacterias altamente móviles. Para el experimento de quimiotaxis, cultive una cultura nocturna de Escherichia coli RP437 con expresión de GFP, con plásmido en caldo triptona o TB a 32 grados Celsius con agitación. Al día siguiente, utilice la cultura nocturna para inocular un cultivo de 20 mililitros de TB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente 0,05.Cultive la muestra a 32 grados Celsius con agitación cuando las células tengan una DO 600 de aproximadamente 0,35 a 0,45. Recójalas mediante centrifugación a baja velocidad y resuspenda las células hasta una DO 600 de aproximadamente 0,35 en CB que contenga el efecto químico a la concentración esperada en el centro del canal. Finalmente, agregue células muertas marcadas con RFP a una DO 600 de aproximadamente 0,35 a las células vivas que expresan GFP.Estas células muertas servirán como control interno para asegurar que cualquier migración no se deba a efectos de flujo. La suspensión celular ya está lista para cargarse en el dispositivo microfluídico para el experimento de quimiotaxis. Para comenzar el experimento de quimiotaxis, retire algo del CB del conector de la aguja de entrada celular y rellene con la suspensión celular.Llene suavemente una jeringa de 50 microlitros con las células resuspendidas. Hágalo lentamente, ya que los flagelos pueden romperse, lo que reducirá la motilidad. Conecte la jeringa de 50 microlitros al conector de entrada de la aguja como se mostró anteriormente, expulsando una pequeña gota del contenido de la jeringa y tocando con ella el líquido dentro del conector de la aguja; luego, fije la jeringa y coloque el dispositivo sobre la platina de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la adquisición de imágenes.Coloque ambas las jeringas de entrada en la bomba de jeringas e inicie el flujo de manera que se forme el gradiente y las células fluyan a través del tubo. Una vez que las células entren en la cámara de quimiotaxis, espere aproximadamente 20 minutos para que el sistema se estabilice. Antes de la adquisición de imágenes, obtenga imágenes de fluorescencia en vivo en color verde e imágenes de muerte celular en color rojo en diferentes ubicaciones a lo largo de la longitud de la cámara.Típicamente recolectamos 100 imágenes en cada ubicación a intervalos de tres segundos. Las imágenes de fluorescencia adquiridas pueden analizarse utilizando cualquier programa comercial de análisis de imágenes, como Image J o Metamorph, o mediante códigos sencillos escritos en MATLAB. En este ejemplo, utilizaremos códigos de MATLAB.Comience por eliminar los píxeles de fondo en la imagen mediante este umbral establecido de intensidad de píxeles, y elimine todos los píxeles que tengan una intensidad menor que el umbral. Esto minimiza el ruido. En el análisis, utilice la posición de las células muertas para determinar el centro de la imagen.Esta es la posición en la que las células ingresaron a la cámara de quimiotaxis y en la que se detectarían en ausencia de cualquier migración. A continuación, localice las células vivas en la imagen, divida la imagen en canales y determine el número de células vivas en cada canal. En nuestros trabajos previos, la cámara de quimiotaxis de 10 a 50 micrómetros de ancho se dividió en 64 canales, cada uno con aproximadamente 16 micrómetros de ancho.Después de repetir estos pasos para todas las imágenes, se obtienen algunos de los recuentos totales de células para cada canal en todas las imágenes. Esto proporciona el recuento total de células detectadas en cada canal durante la duración del experimento. Calcule las quimiotaxis, el coeficiente de partición o CPC, que representa la dirección de la migración.Al realizar los siguientes pasos, asigne un multiplicador de más uno y menos uno a cada célula ubicada en el lado de alta concentración o derecho y en el lado de baja concentración o izquierdo de las células muertas, respectivamente. Sume todos los valores multiplicados y normalice según el número total de células detectadas. Calcule la quimiotaxis, el coeficiente de migración o CMC, que pondera la migración de las células según la distancia recorrida.Una célula que se desplaza al canal de la posición de mayor concentración más alejada, el 64, recibe un factor de ponderación de más uno, mientras que una célula que avanza hasta la mitad del lado de mayor concentración recibe un factor de ponderación de más 0,5. El movimiento hacia la posición de menor concentración más alejada se pondera con menos uno. La suma de todos los recuentos celulares ponderados se normaliza respecto al número de células para generar el CMC.Este gráfico muestra un gradiente de concentración lineal o perfil formado en el dispositivo microfluídico utilizando isotiocianato de fluoresceína. La formación de un gradiente de concentración se demuestra en esta figura usando colorantes azul y amarillo. La entrada celular fue CA para que no hubiera flujo a través de ella, y se puede observar que se forma una gama de colores entre azul y amarillo.A continuación se muestran imágenes en pseudocolor de un experimento representativo de quimiotaxis en el que E. coli RP437 fue expuesto a un gradiente de cero a 100 micromolares de L-aspartato o de cero a 225 micromolares de sulfato de níquel en el dispositivo. La migración de las bacterias verdes vivas hacia el L-aspartato o alejándose del níquel se registró cada 2,5 segundos durante 30 minutos. Las bacterias muertas, mostradas en rojo, sirvieron como control para los efectos de flujo en el dispositivo.La distribución espacial de RP 4 37 en el dispositivo microfluídico en ausencia de un gradiente se muestra en esta gráfica en comparación con su respuesta a un gradiente de aspartato y un gradiente de sulfato de níquel. Acabamos de mostrarle cómo monitorear las quimiotaxis de E. coli RP 4 37 en un gradiente de sulfato de níquel. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar el remolino de las células para poder utilizar una subpoblación con alta movilidad.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biology

Biología

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Se describe un protocolo para la microfabricación del dispositivo de generación de gradiente de microfluidos que puede generar gradientes espaciales y temporales bien definidos microambiente. En este enfoque, el dispositivo de microfluidos gradiente de generación se pueden utilizar para estudiar la migración celular dirigida, la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

Fuente: Scheidweiler, D., et al. Combinar dispositivos fluídicos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a escalas espaciales. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para cuantificar la motilidad bacteriana a través de una matriz porosa compuesta por pilares dispuestos aleatoriamente. Se introducen bacterias marcadas con fluorescencia en el dispositivo, se fotografían mediante microscopía a medida...

Evaluación de la motilidad bacteriana utilizando un dispositivo microfluídico

Este video muestra el ensayo de quimiotaxis de neutrófilos utilizando un método todo en chip. El método permite el aislamiento directo de neutrófilos de la sangre total mediante selección inmunomagnética negativa seguida de un ensayo de quimiotaxis en un chip microfluídico.

Un método basado en chips microfluídicos para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos utilizando sangre total

Este protocolo detalla un ensayo diseñado para medir la quimiotaxis de neutrófilos humanos a partir de una gotita de sangre entera con robusta reproducibilidad. Este enfoque evita la necesidad de la separación de neutrófilos y requiere sólo unos pocos minutos de ensayo de tiempo de preparación. El chip de microfluidos permite la medición repetida de la quimiotaxis de neutrófilos en el tiempo en los bebés o pequeños mamíferos, donde el volumen de la muestra es limitado.

Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Este artículo proporciona el método detallado de realizar un ensayo rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando el aislamiento de neutrófilos a bordo de la sangre entera y la prueba de quimiotaxis en un único chip microfluídico.

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

La migración celular colectiva en el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer a menudo se guía por los gradientes de los factores de crecimiento o moléculas de señalización. Aquí se describe un sistema experimental que combina la microscopía de tracción con un sistema microfluídico y una demostración de cómo cuantificar la mecánica de la migración colectiva bajo gradiente bioquímico.

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Se presenta un protocolo para la generación de paisajes químicos dinámicos por fotólisis dentro de configuraciones microfluídicas y milifluídicas. Esta metodología es adecuada para estudiar diversos procesos biológicos, incluyendo el comportamiento móvil, la acumulación de nutrientes o la adaptación a los productos químicos de los microorganismos, tanto a nivel de una sola célula como de población.

Generación de paisajes químicos controlados y dinámicos para estudiar el comportamiento microbiano

Aquí se presenta el protocolo para un ensayo de quimiotaxis in situ, un dispositivo microfluídico desarrollado recientemente que permite estudios de comportamiento microbiano directamente en el medio ambiente.

Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos

Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.

Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

Aprende a cuantificar la quimiotaxis bacteriana en gradientes estables usando un dispositivo microfluídico con E. coli RP 4 37. Este método permite estudiar el movimiento dirigido de bacterias hacia atrayentes o repelentes.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

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