Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

Me llamo Jiang. Soy becario postdoctoral en Harvard y en el MIT, Ciencias de la Salud y Tecnología. Y mi nombre es Amir Manchi y soy estudiante universitario en el laboratorio del profesor ha SANE en Harvard, MIT, división de Ciencias de la Salud y Tecnología.

Esta diapositiva muestra el proceso esquemático de cómo fabricar el dispositivo: primero se aplica SUA 50 mediante centrifugación sobre el vapor de silicona, luego se coloca una máscara encima del vapor de silicona, seguido de exposición UV y revelado. Finalmente, se pueden colocar estas almohadillas sobre el vapor de silicona. Después, se vierte el PDMS, se deja curar y se hornea; luego se realiza un pequeño punzonado y finalmente se une el dispositivo de PDMS a un vidrio de borosilicato mediante plasma de oxígeno.

Vale, ahora estamos en la sala de microfabricación dentro del laboratorio y vamos a comenzar fabricando algunas capas de PDMS. Por PDMS me refiero a que el término científico real es polidimetilsiloxano, y es un polímero orgánico. Es el polímero orgánico basado en silicio más ampliamente utilizado.

En realidad, se trata de una mezcla de dos componentes diferentes: una base de elastómero de silicona y un agente de curado de elastómero de silicona. La proporción es de 10 partes de base por 1 parte de agente de curado. Necesitamos aproximadamente 10 gramos de base y, en consecuencia, alrededor de 1 gramo de agente de curado de elastómero, y procederé a mezclar bien la base con el agente de curado.

Utilizaré pipetas. Ahora que la mezcla está lista, voy a verterla encima de la oblea de silicio. La idea es que estas obleas de silicio tienen algunos patrones en su superficie.

En realidad, ayudan a que este polímero de PDMS obtenga el patrón, y utilizamos esos patrones para crear canales, surcos o cualquier otro patrón que necesitemos en esos polímeros. Por lo tanto, el siguiente paso consiste en colocar la mezcla dentro de un vacío para eliminar las burbujas presentes en ella, ya que tenemos muchas burbujas en la mezcla. Voy a colocar los geles de PDMS sobre la oblea de silicio dentro de la cámara de vacío.

Voy a cerrar la cámara y voy a abrir el vacío. Después de que desaparezcan las burbujas, aproximadamente en un par de minutos, colocaremos la muestra dentro del horno durante la noche, a unos 70 grados Celsius, lo que hará que se solidifiquen. El patrón al que quiero que presten atención son estas tres cámaras de reserva diferentes, con el fin de crear gradientes, de modo que tengamos una concentración cero en un extremo y una cantidad específica de concentración en este otro extremo, avanzando de forma uniforme hacia allí, y haremos un pequeño orificio en el extremo opuesto, que en este caso será nuestra salida.

El siguiente paso consiste en cortar uno de estos patrones y transferirlo a una placa petri, colocando las superficies del patrón hacia arriba. Espero que puedan ver las tres entradas y una salida que les expliqué en estos patrones. Utilizaremos perforadores pequeños para nuestras entradas, a fin de poder usar tubos de polietileno, y voy a usar perforadores grandes para mi salida con el fin de tener un reservorio de paso.

Así que comenzaremos con la primera entrada. Voy a hacer un orificio, lo mismo con la segunda y también otro orificio pequeño para la tercera. El último paso es hacer un orificio grande en la salida.

Entonces, una vez que hayamos terminado, tendremos la capa A-P-D-M-S, que es la capa superior, y voy a utilizar otra capa de vidrio en la parte inferior. Estos portaobjetos microscópicos serán mi capa inferior en los dispositivos microfoliculares. Ahora estamos en la sala de microfabricación y tengo una capa de vidrio y una de PDMS, y quiero unirlas entre sí.

Lo que vamos a utilizar ahora es una máquina llamada limpiador de plasma. Lo que sucederá dentro de la cámara es que el plasma ayudará a romper el equilibrio débil de la superficie y lo reemplazará con grupos químicos altamente reactivos, y además la superficie pasará a ser hidrofílica. Lo que sucederá ahora es que tomaré el molde de PDMS, que era la capa superior y tenía unos canales en su interior, y retiraré la cinta que puse anteriormente para evitar que se adhiera polvo a nuestro molde.

Voy a colocarlo dentro de la cámara. Lo siguiente que haré es colocar una capa de vidrio, que es un portaobjetos de microscopio, y esta será nuestra capa inferior dentro del dispositivo. Así que voy a colocar esta también dentro de la cámara.

Y cierro completamente la cámara una vez que está cerrada, primero la energía y luego la bomba, y entonces tenemos que regresar a esta máquina aproximadamente dentro de cinco minutos. Lo que haré es apagar la máquina. Así que apago primero la bomba y luego la energía, y abriré la cámara.

Este sonido se debe en realidad a la presión negativa que se ha aplicado durante el proceso dentro de la cámara. Así que retiraré las diferentes capas y deseo unirlas. Dado que el vidrio es la capa inferior, lo tomaré con la mano izquierda y lo mantendré fijo, y luego tomaré la capa de PDMS y la colocaré encima de la capa de vidrio.

Pero dado que, en realidad, los patrones están orientados hacia arriba en este momento, voy a invertir de alguna manera la capa de PDMS. La colocaré sobre el vidrio después de presionarlas juntas. Se adhieren muy fácilmente, y parte de la ventaja de este proceso de tratamiento con plasma es la resistencia adhesiva y la permanencia.

Así es como se ve al final. Entonces, nuevamente, estas son nuestras entradas y esta es mi salida, y estamos listos para pasar al siguiente paso. La cocción de la fibra dentro del dispositivo y luego incubar durante una hora; transcurrida una hora, retirar una muestra SIM del incubador, agregar el alimento para cultivo de peces y luego preparar la solución.

Para preparar la solución de EGF, simplemente agregamos dos mililitros de medio de cultivo como Azure, junto con 15 nanogramos por mililitro de EGF y 10 micromolares de 50 D; esta solución resulta muy difícil de visualizar para observar el gradiente de EGF a través del canal. Luego, tomamos dos mililitros de medio, medio virtual, y colocamos otros dos mililitros de medio aquí. Estas dos cámaras contienen únicamente cultivos normales, infusiones normales de cultivo en el dispositivo.

Así que retiro la burbuja, vuelvo a conectar, esta también es una burbuja móvil M que baja nuevamente. Luego uso simplemente 15 nanogramos de EGF y 10 micromolares de fi dextrano y dos mililitros de medio del material de reserva, la muestra hacia y coloco la jeringa, y luego ya sabe, la burbuja. Y entonces simplemente cambio la solución, vuelvo a cambiar.

La solución entra en la jeringa de gas y se pulsa SH varias veces para eliminar las burbujas; primero se recoge toda la solución de la jeringa de conmutación y luego se cambia la barra, haciendo pasar la solución a través de la válvula de tres vías, la conexión y la tubería, hasta que la solución salga por el extremo de la tubería. Una vez que comience a salir la mezcla de solución, se puede insertar simplemente la tubería en el dispositivo My Predict; las tres soluciones son idénticas. Puede conectar suavemente la entrada del canal de infusión.

Entonces, finalmente, dos es medio de cultivo normal. Uno es medio de cultivo con EGF y para confirmar el perfil del gradiente de EGF. Este es el cultivo celular, cultivo celular.

Esto será la salida celular, de modo que se genera el gradiente utilizando el canal de tres ejes y luego se genera el gradiente dentro del área celular. Normalmente, lo que quiero hacer es simplemente colocar las células, suspender las células, colocarlas en la salida, y luego podemos aspirar suavemente el medio, de forma que las células fluyan a través del área celular, se asienten automáticamente y se adhieran al recubrimiento, asegurándonos de que las células se extiendan completamente. Y tras verificar que las células se han extendido por completo, podemos comenzar simplemente a infundir y luego estudiar la migración celular utilizando el dispositivo generador de gradientes.