Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

Haga crecer la línea celular deseada como una monocapa 2D adherente. Retire el medio de cultivo y lávese con solución salina tamponada con fosfato o PBS. A continuación, se añade la tripsina y se incuba mientras las células se desprenden de la superficie del matraz y adquieren forma redonda. Agregue medios nuevos para neutralizar la tripsina y suspender las células. Transfiera la mezcla a un tubo cónico y use una centrífuga para granular las celdas.

Reemplace el sobrenadante con medios nuevos y vuelva a suspender el pellet de la célula. Use un hemocitómetro para contar el número de células y calcular una concentración de trabajo. Luego, transfiera la cantidad correcta de mezcla celular a una placa de pocillos de adherencia ultra baja de fondo redondo e incube. Las células se depositan en el fondo y se agregan. En última instancia, se unirán entre sí y formarán un conjunto compacto de celdas 3D, el esferoide.

En el protocolo de ejemplo, veremos cómo generar esferoides 3D a partir de una línea celular de cáncer de colon y cómo se aplican imágenes en vivo para rastrear su formación. Comience lavando la línea celular de cáncer colorrectal de interés con cinco mililitros de PBS y retire las células del fondo del matraz con 0,5 mililitros de tripsina durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de confirmar el desprendimiento bajo un microscopio, neutralice la enzima de disociación celular con 10 mililitros de medio completo y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio completo fresco para contar, y vuelva a suspender las celdas a una concentración de 1,5 veces 10 a la tercera celda por mililitro.

A continuación, siembre 20 microlitros de células en cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos y coloque la placa en un aparato de imagen automatizado dentro de una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2 y 95% de humedad. Inicie sesión en el software de adquisición del aparato y seleccione Programar para adquirir, Lanzar agregar embarcación, Escanear según programación y Crear embarcación, nueva. A continuación, seleccione Tipo de escaneo, Esferoide y seleccione los canales de campo claro y fluorescencia apropiados de interés. Ajuste el aumento a 10 veces y seleccione el modelo de placa y su posición dentro del cajón del aparato de imagen. Seleccione la posición de los pocillos de los que se van a obtener imágenes e introduzca la descripción del experimento, incluido el nombre, el tipo de células y el número de células.

Para la configuración del análisis, seleccione Aplazar análisis hasta más tarde, haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione Establecer intervalo de grupo de análisis seleccionado y establezca Agregar análisis cada cuatro horas y Por un total de hasta 24 horas. A continuación, ajuste la hora de inicio al menos una hora después de la incubación en el aparato de imagen automatizado. Para comprobar el progreso del crecimiento del esferoide, cada dos días, inicie sesión en el software de imágenes y seleccione Ver exploraciones recientes. Haga doble clic en el experimento de interés y seleccione Campo claro en el panel Canales de imagen. A continuación, utilice la herramienta Medir entidades de imagen para medir el diámetro de los esferoides. Agregar 50 microlitros de medio completo por pocillo en el cuarto día para limitar cualquier medio de efectos de aparición.