Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

El objetivo general de este método in vitro es generar los esferoides de cultivo celular tridimensional que permitan probar los regímenes de terapia estándar o experimentales actuales para el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Este método nos ayuda a comprender el crecimiento tumoral tridimensional de las células cancerosas de cabeza y cuello cuando se exponen a radiación o tratamiento de quimioterapia. Queda por decir que el manejo de las células tumorales primarias es difícil y no siempre conduce a la formación confiable de esferoides tridimensionales.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Sabina Schwenk-Zieger, técnica de nuestro laboratorio. Mientras utiliza células primarias de una muestra tumoral, coloque la muestra sobre una superficie adecuada y estéril y córtela bien con un bisturí estéril de un solo uso en trozos muy pequeños. Después de una separación mecánica suficiente del tejido primario, transfiéralo a un vial que contenga colagenasa 1 y 2 e incube durante una hora a 37 grados centígrados.

A continuación, tamice la mezcla a través de un colador de celdas Falcon de 70 micrómetros y lave la suspensión con HBSS. Después de una separación exitosa y el lavado posterior, transfiera la suspensión que contiene de uno a dos millones de células a un matraz de cultivo celular T75 para que crezca hasta la subconfluencia a 37 grados centígrados durante un máximo de diez días. Bajo un microscopio, confirme el crecimiento de las células tumorales.

Cuente las células en cultivo. Utilizando una placa de 96 pocillos de adhesión ultra baja con fondos redondos cóncavos, siembre 5.000 células tumorales primarias, o 1.000 a 2.000 células de línea celular intermedia, en 200 a 300 microlitros de medio en los pocillos. A continuación, cultive las células a 37 grados centígrados.

Realice cambios de medios cada dos días. Preste atención a no aspirar el esferoide con la pipeta durante los cambios de soporte. Cultive los esferoides hasta que se observen los conglomerados celulares tridimensionales en forma de esferoide.

Tenga en cuenta que debe excluir los pozos con formación irregular o múltiple de esferoides de una investigación adicional. Posteriormente, cambie los medios por medios con quimioterapia y/o anticuerpos monoclonales en las concentraciones deseadas. Agregue cisplatino a las concentraciones de 2.5, cinco o 10 micromolares o 5-fluorouracilo a 30 micromolares.

En este procedimiento, mida el tamaño del esferoide después de la documentación fotográfica digital en el día seis, el día 10 y el día 16 con un software gráfico. Después de centrifugar la placa a 520 g durante 2,5 minutos, retire el sobrenadante. A continuación, lave las células con 1x PBS y vuelva a centrifugar la placa, a continuación, retire el sobrenadante.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución de desprendimiento de células enzimáticas a cada vial para permitir que los esferoides se disuelvan. Posteriormente, incubar la placa durante ocho minutos a 37 grados centígrados. Verifique la disolución exitosa de los esferoides bajo el microscopio.

Añade 100 microlitros de DMEM. A continuación, centrifuga la placa a 520 g durante 2,5 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y suspenda las células en 100 microlitros de DMEM.

Posteriormente, si es necesario, realice un ensayo de proliferación colorimétrica disponible en el mercado y lea el ensayo en un lector ELISA. Todas las líneas celulares podrían generar esferoides fiables con diferencias de tamaño y tiempo de lectura. Las células primarias formaron esferoides reproducibles en placas de unión ultrabajas.

La tinción con Ki-67 revela que la periferia del cultivo muestra tasas de proliferación mucho más altas que las células centrales, imitando la distribución de nutrientes en tumores de mucosa sólida que a menudo muestran núcleos necróticos. Aquí, el efecto de varias quimioterapias terapéuticas y radiación sobre el tamaño de los esferoides. La radiación con dos gray antes del tratamiento con cisplatino, conduce a una disminución significativa en el tamaño del esferoide en comparación con el cisplatino solo.

Con el establecimiento adicional de la generación de esferoides a partir de células humanas primarias, así es como se podría implementar el concepto de pruebas terapéuticas. Los esferoides se generarían después de la biopsia del tumor y luego se analizarían para determinar las características moleculares y la susceptibilidad a la terapia. Pudimos establecer un protocolo para generar esferoides reproducibles a partir de suspensiones celulares tanto para líneas celulares como para células tumorales humanas primarias.

Este ensayo multimodal es lo suficientemente sensible como para identificar pequeñas diferencias entre los grupos. En el futuro, el ensayo podría utilizarse para, en primer lugar, evaluar la respuesta individual a los protocolos de tratamiento estándar y experimental. En segundo lugar, caracterizar aún más las células tumorales a partir de muestras frescas.

Y tercero, correlacionar la respuesta de la terapia a los patrones moleculares. El uso de células primarias y la generación de esferoides permitirían la preservación de tantas características de crecimiento tumoral in vivo como sea posible en combinación con un ensayo rentable para estudiar la respuesta terapéutica individual.