Encyclopedia of Experiments: Biology
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begin met het toevoegen van E3 medium tot laag smeltpunt agarose en verhitting totdat de agarose volledig is opgelost. Koel de agarose tot 37 graden Celsius en voeg tricaine-oplossing toe. Verdoof vervolgens de embryo's door tricaine toe te voegen aan een Petrischaal met embryo's in E3-medium. Wervel de Petrischaal om de embryo's in het midden te verzamelen.
Maak met behulp van een transferpipet één embryo met een minimale hoeveelheid medium. Houd de pipet rechtop en stuiter het embryo om het op de punt van de pipet te plaatsen. Plaats het embryo nu in de agarose-oplossing zonder een overtollig medium toe te voegen, waardoor de agarose wordt verdund en gelling wordt voorkomen. Meng het embryo voorzichtig in de agarose en breng de oplossing over in de put van een beeldplaat met behulp van de pipet.
Plaats de plaat onder een microscoop en gebruik een pipetpunt om het embryo in de gewenste oriëntatie te plaatsen. Zodra de agarose stolt, giet je er een E3-medium met tricaïne bovenop om de agar gehydrateerd te houden en het embryo in beeld te brengen. In een voorbeeldprotocol zullen we parabiotische zebravisembryo's monteren voor beeldvorming en analyse.
Om beelden van de gesmolten embryo's te verkrijgen, bereid 0,8% laag smeltpunt agarose. Terwijl nog steeds heet, aliquot een milliliter van de agarose in 1,5 milliliter microfuge buizen geplaatst in een 37 graden Celsius verwarmingsblok. Verdoof de parabiotische embryo's door het toevoegen van 1 milliliter van 4 milligram per milliliter pH 7,0 tricaine aan de 25 milliliter van E3.
Vervolgens met behulp van een breed getipte plastic transferpipet, trek de embryo's in zo min mogelijk vloeistof. Draai vervolgens de pipet rechtop en stuiter de embryo's voorzichtig zodat ze zich op de bodem van de pipet nestelen. Breng de embryo's vervolgens over naar een 1 milliliter aliquot laag smeltpunt agarose door de pipetpunt op het oppervlak van de agarose licht aan te raken. Gooi overtollige vloeistof uit de pipet en gebruik de pipet om de embryo's voorzichtig te mengen.
Breng vervolgens met de pipet de agarose en embryo's over naar de put van een zesputsplaat met glazen bodem. Gebruik onder een stereomicroscoop een gellaadtip die aan het einde van een plagende naald is bevestigd om de embryo's dicht bij het afdekglas en in de gewenste oriëntatie voor beeldvorming te plaatsen. Nadat de agarose is ingesteld en medium met tricaine aan de putten is toegevoegd, gebruikt u een omgekeerde breedveldeppifluorescentielaserscant confocale of draaiende schijfconocale microscoop.
Gebruik voor een heel embryo gezichtsveld een 4x subjectief. Gebruik een 20x objectief om een specifiek weefsel in beeld te brengen. Verwerk de beelden volgens het tekstprotocol.
