Montaje en agar: un método básico de montaje de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo

- Comience agregando agarosa de punto de fusión medio a bajo E3 y calentando hasta que la agarosa se disuelva por completo. Enfríe la agarosa a 37 grados centígrados y agregue la solución de tricaína. A continuación, anestesiar los embriones añadiendo tricaína a una placa de Petri que contenga embriones en medio E3. Gira la placa de Petri para recoger los embriones en el medio.

Con una pipeta de transferencia, extraiga un embrión con una cantidad mínima de medio. Sostenga la pipeta en posición vertical y haga rebotar el embrión para colocarlo en la punta de la pipeta. Ahora coloque el embrión en la solución de agarosa sin agregar ningún exceso de medio, lo que diluiría la agarosa y evitaría la gelificación. Mezcle suavemente el embrión dentro de la agarosa y transfiera la solución al pocillo de una placa de imagen con la pipeta.

Coloque la placa bajo un microscopio y use una punta de pipeta para colocar el embrión en la orientación deseada. Una vez que la agarosa se solidifique, vierta el medio E3 que contiene tricaína encima para mantener el agar hidratado y obtener imágenes del embrión. En un protocolo de ejemplo, montaremos embriones de pez cebra parabióticos para obtener imágenes y análisis.

Para obtener imágenes de los embriones fusionados, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,8%. Mientras aún está caliente, alícuota un mililitro de la agarosa en tubos de microfuga de 1,5 mililitros colocados en un bloque calefactor a 37 grados centígrados. Anestesiar los embriones parabióticos añadiendo 1 mililitro de 4 miligramos por mililitro de tricaña pH 7.0 a los 25 mililitros de medio E3 que contienen los embriones. Agita suavemente el plato para que los embriones se acumulen en el medio.

A continuación, con una pipeta de transferencia de plástico de punta ancha, extraiga los embriones en la menor cantidad de líquido posible. A continuación, gire la pipeta en posición vertical y haga rebotar suavemente los embriones para que se asienten en el fondo de la pipeta. A continuación, transfiera los embriones a una alícuota de 1 mililitro de agarosa de bajo punto de fusión tocando ligeramente la punta de la pipeta en la superficie de la agarosa. Deseche el exceso de líquido de la pipeta y utilice la pipeta para mezclar suavemente los embriones con la agarosa.

Luego, con la pipeta, transfiera la agarosa y los embriones al pocillo de una placa de seis pocillos con fondo de vidrio. Bajo un microscopio estereoscópico, use una punta de carga de gel fijada al extremo de una aguja de burla para colocar los embriones cerca del cubreobjetos y en la orientación deseada para la obtención de imágenes. Después de que la agarosa se haya endurecido y se haya agregado un medio con tricaína a los pocillos, use un microscopio confocal de escaneo láser de epifluorescencia de campo amplio invertido o un microscopio confocal de disco giratorio para adquirir imágenes.

Para un campo de visión de todo el embrión, utilice un subjetivo 4x. Utilice un objetivo de 20x para obtener imágenes de un tejido específico. Procese las imágenes de acuerdo con el protocolo de texto.