Name: Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a medir la actividad de calpaínas en células fijas y vivas mediante citometría de flujo usando el sustrato fluorescente BUC-LMC-MAC. Este método permite estudiar procesos celulares y enfermedades como leucemia.

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Apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la leucemia y el linfoma de la Sociedad de Canadá y la Fundación Linfoma de Canadá.

Preparar los reactivos Nota: Todas las PBS contiene Ca 2 + y Mg 2 + <ol><li> Detección de los reactivos Añadir 20μM 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensión de células se requieren reactivos de detección de 2 ml. </li><li> Paraformaldehído al 1% (células fijas) Diluir al 4% de paraformaldehído en solución de reserva temperatura ambiente PBS. Alícuota de 1 ml de paraformaldehído al 1% a cada tubo FACS. Tres tubos de FACS se requieren para cada condición experimental (por ejemplo, 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necesitan 9 tubos FACS) </li><li> PD150606 (inhibidor de la calpaína) Reconstituir PD150606 en DMSO a una concentración final de 100 mm. Proteja el reactivo y todas las células tratadas con ella de la luz durante la duración de este experimento. </li><li> PD98059 (inhibidor de MEK1) Reconstituir PD98059 en DMSO a una concentración final de 50 mm. </li></ol> Prepare las células <ol><li> Se cultivan las células 32Dkit a 5 x 10 5 a 1 x 10 6 células por ml de Opti-MEM suplementado con los medios de comunicación fetal al 5% de suero bovino, WEHI-3 sobrenadante como fuente de IL-3 (o cualquier otra fuente de IL-3 como como proteína recombinante), el 0,1% de 2-mercaptoetanol y antibióticos. </li><li> Tomar 12 x 10 6 células 32Dkit en tres tubos Falcon de 15 ml (4 x 10 6 células por tubo). </li><li> Que sedimenten las células a 1000 rpm durante 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 2 ml de PBS a temperatura ambiente. </li><li> El tratamiento de una suspensión celular con 50 micras PD150606. Asegurar que la muestra está protegido de la luz por la que cubre el tubo Falcon con papel de aluminio. Vortex brevemente y luego se incuba durante veinte a treinta minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> El tratamiento de la suspensión celular en segundo lugar con 20μM PD98059. Placa de las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm y se incuba durante 2 horas a 37 º C. </li></ol> Calpaína ensayo en células fijas <ol><li> Mientras que las muestras se incuban con PD150606, comenzará el ensayo de la calpaína en las muestras no tratadas. Comience por la adición de reactivos de detección de 2 ml de cada suspensión celular. Inmediatamente agrega 1 ml de la suspensión celular / mezcla de detección reactivos a los tubos previamente preparado FACS con paraformaldehído al 1% (0 puntos minutos de tiempo). </li><li> Incubar las suspensiones de células con el reactivo de detección durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de la suspensión celular a un tubo con 1 mL FACS paraformaldehído al 1%. </li><li> Continuar la incubación de las suspensiones celulares con la mezcla de detección por otros 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de la suspensión celular a un tubo con 1 mL FACS paraformaldehído al 1%. </li><li> Repita el ensayo de calpaína en células 32Dkit que han sido tratados con inhibidores. </li><li> Fijar las células durante la noche en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, que sedimenten las células a 1800 rpm durante 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en PBS 750uL. Colocar las células en hielo y mantener en la oscuridad. </li></ol> Adquisición de datos para las células fijas <ol><li> Analizar las células utilizando un LSR II (BD Bioscience). Los filtros se establecen para el Xcyte Lightwave (UV) con láser, la excitación línea 355nm y el láser de 25mW de potencia, emisión de 405 y 450 nm para el sustrato y producto, respectivamente. Filtros de paso de banda de sustrato y de producto son 405/20 y 450/50. Filtros de paso largo por el sustrato y productos son 405 y 450. El voltaje de PMT fue creada en el 350-375 de sustrato y 325-350 para el producto. </li><li> Puesta en marcha un experimento BD FACSDiVa con los siguientes parámetros: dispersión frontal, dispersión lateral; Indo-1 Blue (log), Indo-1 Violeta (log). En la hoja de establecer los siguientes gráficos: dispersión frontal versus dispersión lateral gráfico de puntos con una puerta en las células vivas (Figura 1a), Indo-1 histograma azul, Indo-1 histograma violeta, Indo-1 Azul vs Indo-1 Violeta gráfico de puntos. </li><li> Calibrar el II LSR con AlignFlow y AlignFlow más perlas fluorescentes (Invitrogen). El voltaje de PMT debe ser ajustada para colocar el pico del histograma de fluorescencia de cuentas en el mismo canal antes de cada experimento. </li><li> El proceso de adquisición de datos utilizando las células 32Dkit en el punto 0 minutos de tiempo. Ajustar los voltajes de parámetros según sea necesario. Adquirir y registrar 10.000 eventos por muestra. </li><li> Repetir la adquisición de cada muestra, el enjuague de la máquina con tampón FACS entre cada tubo. </li><li> Exportar los datos. Asegúrese de LSR II se limpia de acuerdo a las directrices del Instituto. </li></ol> Calpaína ensayo en células vivas <ol><li> Preparar las suspensiones de células que el anterior, sin PD150606. Llevar las muestras a la II LSR y establecer filtros y parámetros que el anterior. Establecer la hoja de trabajo que el anterior. Incluya un diagrama de puntos que muestra gran Indo-1 azul en función del tiempo. Configurar el programa para adquirir el numero máximonúmero de eventos (no hay puerta de parada). </li><li> Añadir 50 micras PD150606 a una suspensión celular de las células 32Dkit. Mantener la muestra en la oscuridad y se incuban a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. </li><li> Proceso de adquisición de datos sobre la suspensión de células 32Dkit sin PD150606. Use un caudal bajo de 200 a 300 eventos por segundo. Después de 30 segundos a 1 minuto retirar el tubo de la máquina. Añadir 20μM BOC-LM-CMAC a las células. Vortex brevemente y luego continuar la adquisición de los datos. </li><li> Adquirir datos durante 10-20 minutos o hasta que la actividad de la calpaina mesetas. </li><li> Repita los pasos 3 y 4 con las células tratadas con 32Dkit PD150606. </li><li> Exportar los datos. Asegúrese de LSR II se limpia de acuerdo a las directrices del Instituto. </li></ol> Calpaína ensayo en el complejo de las poblaciones de células (Mixto) * Este experimento identificar las células 32Dkit en una suspensión de células recolectadas a partir de un bazo de ratón. <ol><li> Cosecha del bazo de cada ratón. Lisis de los glóbulos rojos con NH 4 Cl durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Preparar suspensiones de células individuales en 2 ml de PBS. </li><li> Dividir cada suspensión de células en dos. El tratamiento de una suspensión celular con 50 micras PD150606 durante 20-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Siga el procedimiento anterior para el ensayo de calpaína en células fijas (pasos 1-6) </li><li> Aspirar el sobrenadante. Lavar las células en 500μL de PBS. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en un tampón de tinción de 200μL con 2% de BSA. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Prepare el anticuerpo primario (FITC anti-ratón CD117). El anticuerpo se utilizó en una dilución 1:200 en buffer de tinción. Asegúrese de que el anticuerpo se mantiene en la oscuridad. </li><li> Añadir el anticuerpo primario 200μL a las células. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Añadir 400μL de PBS para aumentar el volumen de citometría de flujo. Lugar de las células en hielo y mantener en la oscuridad. </li><li> Proceda como se describe en obtener datos para las células fijas. Añadir FITC a los parámetros e incluyen un histograma para FITC en la hoja. </li></ol> Análisis y Resultados Representante <ol><li> Analizar los datos utilizando FlowJo (Treestar). Puerta de las células en vivo basado en el perfil de dispersión frontal y lateral (Figura 1a). Determinar la media de fluorescencia para Indo-azul de la puerta de células viables (Figura 1b). </li><li> a) Para la población de células mixtas <ul><li> el uso de fluorescencia FITC en las parcelas de histogramas y un punto para identificar la población 32Dkit </li><li> Determinar la media de fluorescencia para Indo-Blue de la población 32Dkit </li></ul></li><li> Utilice Microsoft Excel para representar gráficamente la media de fluorescencia (Figura 2a). Calcular la pendiente de la línea entre el 5 y 10 minutos. Gráfico de la pendiente en forma de gráfico de barras para determinar la actividad de la calpaína en las células (Figura 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> Figura 1a. Determinación de células en vivo basado en el perfil de dispersión frontal y lateral. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1b. El cambio promedio de fluorescencia más de 10 minutos de tiempo por supuesto. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> Figura 2a. Representante gráfico de la media de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> Figura 2b. Calpaína actividad en las células con inhibidores de la 32Dkit.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

La actividad de la calpaína en células 32Dkit fijos y la vida se ha determinado en este protocolo de vídeo. El tratamiento de la línea de células con el inhibidor de la calpaína PD150606 dio lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. Además, el tratamiento con el inhibidor de MEK1 PD98059 dado lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. ERK es un importante activador de la calpaína-2 3. Estos resultados sugieren que la calpaína-2 la activi...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehído</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Disuelva 4 g de paraformaldehído en 100 mL de PBS. En cabina de flujo laminar, caliente la muestra con agitación hasta que quede transparente.&lt;br/&gt;Deje enfriar y luego almacene a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Utilice PD150606 recién reconstituido para lograr una inhibición máxima de la calpaína.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow más perlas fluorescentes, tubos FACS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;El sobrenadante de células WEHI-3 se utiliza como fuente de IL-3 en estos experimentos. Cada colección de sobrenadante de WEHI-3 se titula para determinar la concentración óptima empleada para el crecimiento de células 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpaínas son omnipresentes intracelular, sensible calcio, cisteína proteasas neutras<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas juegan un papel crucial en muchos procesos fisiológicos, incluida la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas han sido implicados en muchas patologías como distrofias musculares, cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaína regulación es compleja y no completamente entendido. los niveles de ARNm y proteínas se correlacionan poco con la actividad, lo que limita el uso de las técnicas de la expresión de genes o proteínas para medir la actividad de la calpaína. Esta detalles del protocolo de vídeo un ensayo de citometría de flujo desarrollado en nuestro laboratorio para medir la actividad de la calpaína en células fijadas y de vida. Este método utiliza el sustrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que se escinde específicamente por la calpaína, para medir la actividad de calpaína.<sup&gt; 2</sup&gt; En este video, la actividad de la calpaína en fijo y que viven las células murinas 32Dkit leucemia, solo o como parte de una población de esplenocitos se mide utilizando un LSRII (BD Bioscience). 32Dkit células han demostrado tener actividad elevada en comparación con esplenocitos normales.

Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Las calpaínas son proteasas de cisteína neutras, sensibles al calcio e intracelulares, presentes en todas partes 1. Las calpaínas desempeñan funciones cruciales en numerosos procesos fisiológicos, ...

Las calpaines son proteasas intracelulares, sensibles al calcio, de tipo cisteína y de naturaleza neutra, que desempeñan funciones cruciales en muchos procesos fisiológicos, incluyendo la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular. Para medir la actividad de las calpaines en células fijadas y vivas, se añade el sustrato fluorescente BUC, LMC MAC. Buc LMC MAC es escindido específicamente por la calpaína, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia. El cambio en la fluorescencia se monitorea mediante citometría de flujo, lo que revela un incremento en la actividad de la calpaína en células 30 2D kit en comparación con citoes normales.Hola, soy Christina Farr del laboratorio del Dr. Stewart Berger en la Universidad de Toronto, en el Departamento de Inmunología y la Red de Salud Universitaria. Hoy les mostraré cómo medir la actividad de la calpaína en células fijadas y vivas utilizando un ensayo basado en citometría de flujo. Utilizamos este ensayo en nuestro laboratorio para analizar la actividad de la calpaína en células de leucemia y linfoma.Así que comencemos. Antes de iniciar los experi

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