Name: Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a medir la actividad de calpaínas en células fijas y vivas mediante citometría de flujo usando el sustrato fluorescente BUC-LMC-MAC. Este método permite estudiar procesos celulares y enfermedades como leucemia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la leucemia y el linfoma de la Sociedad de Canadá y la Fundación Linfoma de Canadá.

Preparar los reactivos Nota: Todas las PBS contiene Ca 2 + y Mg 2 + <ol><li> Detección de los reactivos Añadir 20μM 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensión de células se requieren reactivos de detección de 2 ml. </li><li> Paraformaldehído al 1% (células fijas) Diluir al 4% de paraformaldehído en solución de reserva temperatura ambiente PBS. Alícuota de 1 ml de paraformaldehído al 1% a cada tubo FACS. Tres tubos de FACS se requieren para cada condición experimental (por ejemplo, 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necesitan 9 tubos FACS) </li><li> PD150606 (inhibidor de la calpaína) Reconstituir PD150606 en DMSO a una concentración final de 100 mm. Proteja el reactivo y todas las células tratadas con ella de la luz durante la duración de este experimento. </li><li> PD98059 (inhibidor de MEK1) Reconstituir PD98059 en DMSO a una concentración final de 50 mm. </li></ol> Prepare las células <ol><li> Se cultivan las células 32Dkit a 5 x 10 5 a 1 x 10 6 células por ml de Opti-MEM suplementado con los medios de comunicación fetal al 5% de suero bovino, WEHI-3 sobrenadante como fuente de IL-3 (o cualquier otra fuente de IL-3 como como proteína recombinante), el 0,1% de 2-mercaptoetanol y antibióticos. </li><li> Tomar 12 x 10 6 células 32Dkit en tres tubos Falcon de 15 ml (4 x 10 6 células por tubo). </li><li> Que sedimenten las células a 1000 rpm durante 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 2 ml de PBS a temperatura ambiente. </li><li> El tratamiento de una suspensión celular con 50 micras PD150606. Asegurar que la muestra está protegido de la luz por la que cubre el tubo Falcon con papel de aluminio. Vortex brevemente y luego se incuba durante veinte a treinta minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> El tratamiento de la suspensión celular en segundo lugar con 20μM PD98059. Placa de las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm y se incuba durante 2 horas a 37 º C. </li></ol> Calpaína ensayo en células fijas <ol><li> Mientras que las muestras se incuban con PD150606, comenzará el ensayo de la calpaína en las muestras no tratadas. Comience por la adición de reactivos de detección de 2 ml de cada suspensión celular. Inmediatamente agrega 1 ml de la suspensión celular / mezcla de detección reactivos a los tubos previamente preparado FACS con paraformaldehído al 1% (0 puntos minutos de tiempo). </li><li> Incubar las suspensiones de células con el reactivo de detección durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de la suspensión celular a un tubo con 1 mL FACS paraformaldehído al 1%. </li><li> Continuar la incubación de las suspensiones celulares con la mezcla de detección por otros 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de la suspensión celular a un tubo con 1 mL FACS paraformaldehído al 1%. </li><li> Repita el ensayo de calpaína en células 32Dkit que han sido tratados con inhibidores. </li><li> Fijar las células durante la noche en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, que sedimenten las células a 1800 rpm durante 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en PBS 750uL. Colocar las células en hielo y mantener en la oscuridad. </li></ol> Adquisición de datos para las células fijas <ol><li> Analizar las células utilizando un LSR II (BD Bioscience). Los filtros se establecen para el Xcyte Lightwave (UV) con láser, la excitación línea 355nm y el láser de 25mW de potencia, emisión de 405 y 450 nm para el sustrato y producto, respectivamente. Filtros de paso de banda de sustrato y de producto son 405/20 y 450/50. Filtros de paso largo por el sustrato y productos son 405 y 450. El voltaje de PMT fue creada en el 350-375 de sustrato y 325-350 para el producto. </li><li> Puesta en marcha un experimento BD FACSDiVa con los siguientes parámetros: dispersión frontal, dispersión lateral; Indo-1 Blue (log), Indo-1 Violeta (log). En la hoja de establecer los siguientes gráficos: dispersión frontal versus dispersión lateral gráfico de puntos con una puerta en las células vivas (Figura 1a), Indo-1 histograma azul, Indo-1 histograma violeta, Indo-1 Azul vs Indo-1 Violeta gráfico de puntos. </li><li> Calibrar el II LSR con AlignFlow y AlignFlow más perlas fluorescentes (Invitrogen). El voltaje de PMT debe ser ajustada para colocar el pico del histograma de fluorescencia de cuentas en el mismo canal antes de cada experimento. </li><li> El proceso de adquisición de datos utilizando las células 32Dkit en el punto 0 minutos de tiempo. Ajustar los voltajes de parámetros según sea necesario. Adquirir y registrar 10.000 eventos por muestra. </li><li> Repetir la adquisición de cada muestra, el enjuague de la máquina con tampón FACS entre cada tubo. </li><li> Exportar los datos. Asegúrese de LSR II se limpia de acuerdo a las directrices del Instituto. </li></ol> Calpaína ensayo en células vivas <ol><li> Preparar las suspensiones de células que el anterior, sin PD150606. Llevar las muestras a la II LSR y establecer filtros y parámetros que el anterior. Establecer la hoja de trabajo que el anterior. Incluya un diagrama de puntos que muestra gran Indo-1 azul en función del tiempo. Configurar el programa para adquirir el numero máximonúmero de eventos (no hay puerta de parada). </li><li> Añadir 50 micras PD150606 a una suspensión celular de las células 32Dkit. Mantener la muestra en la oscuridad y se incuban a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. </li><li> Proceso de adquisición de datos sobre la suspensión de células 32Dkit sin PD150606. Use un caudal bajo de 200 a 300 eventos por segundo. Después de 30 segundos a 1 minuto retirar el tubo de la máquina. Añadir 20μM BOC-LM-CMAC a las células. Vortex brevemente y luego continuar la adquisición de los datos. </li><li> Adquirir datos durante 10-20 minutos o hasta que la actividad de la calpaina mesetas. </li><li> Repita los pasos 3 y 4 con las células tratadas con 32Dkit PD150606. </li><li> Exportar los datos. Asegúrese de LSR II se limpia de acuerdo a las directrices del Instituto. </li></ol> Calpaína ensayo en el complejo de las poblaciones de células (Mixto) * Este experimento identificar las células 32Dkit en una suspensión de células recolectadas a partir de un bazo de ratón. <ol><li> Cosecha del bazo de cada ratón. Lisis de los glóbulos rojos con NH 4 Cl durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Preparar suspensiones de células individuales en 2 ml de PBS. </li><li> Dividir cada suspensión de células en dos. El tratamiento de una suspensión celular con 50 micras PD150606 durante 20-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Siga el procedimiento anterior para el ensayo de calpaína en células fijas (pasos 1-6) </li><li> Aspirar el sobrenadante. Lavar las células en 500μL de PBS. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en un tampón de tinción de 200μL con 2% de BSA. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Prepare el anticuerpo primario (FITC anti-ratón CD117). El anticuerpo se utilizó en una dilución 1:200 en buffer de tinción. Asegúrese de que el anticuerpo se mantiene en la oscuridad. </li><li> Añadir el anticuerpo primario 200μL a las células. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Añadir 400μL de PBS para aumentar el volumen de citometría de flujo. Lugar de las células en hielo y mantener en la oscuridad. </li><li> Proceda como se describe en obtener datos para las células fijas. Añadir FITC a los parámetros e incluyen un histograma para FITC en la hoja. </li></ol> Análisis y Resultados Representante <ol><li> Analizar los datos utilizando FlowJo (Treestar). Puerta de las células en vivo basado en el perfil de dispersión frontal y lateral (Figura 1a). Determinar la media de fluorescencia para Indo-azul de la puerta de células viables (Figura 1b). </li><li> a) Para la población de células mixtas <ul><li> el uso de fluorescencia FITC en las parcelas de histogramas y un punto para identificar la población 32Dkit </li><li> Determinar la media de fluorescencia para Indo-Blue de la población 32Dkit </li></ul></li><li> Utilice Microsoft Excel para representar gráficamente la media de fluorescencia (Figura 2a). Calcular la pendiente de la línea entre el 5 y 10 minutos. Gráfico de la pendiente en forma de gráfico de barras para determinar la actividad de la calpaína en las células (Figura 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> Figura 1a. Determinación de células en vivo basado en el perfil de dispersión frontal y lateral. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1b. El cambio promedio de fluorescencia más de 10 minutos de tiempo por supuesto. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> Figura 2a. Representante gráfico de la media de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> Figura 2b. Calpaína actividad en las células con inhibidores de la 32Dkit.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

La actividad de la calpaína en células 32Dkit fijos y la vida se ha determinado en este protocolo de vídeo. El tratamiento de la línea de células con el inhibidor de la calpaína PD150606 dio lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. Además, el tratamiento con el inhibidor de MEK1 PD98059 dado lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. ERK es un importante activador de la calpaína-2 3. Estos resultados sugieren que la calpaína-2 la activi...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehído</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Disuelva 4 g de paraformaldehído en 100 mL de PBS. En cabina de flujo laminar, caliente la muestra con agitación hasta que quede transparente.&lt;br/&gt;Deje enfriar y luego almacene a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Utilice PD150606 recién reconstituido para lograr una inhibición máxima de la calpaína.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow más perlas fluorescentes, tubos FACS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;El sobrenadante de células WEHI-3 se utiliza como fuente de IL-3 en estos experimentos. Cada colección de sobrenadante de WEHI-3 se titula para determinar la concentración óptima empleada para el crecimiento de células 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpaínas son omnipresentes intracelular, sensible calcio, cisteína proteasas neutras<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas juegan un papel crucial en muchos procesos fisiológicos, incluida la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas han sido implicados en muchas patologías como distrofias musculares, cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaína regulación es compleja y no completamente entendido. los niveles de ARNm y proteínas se correlacionan poco con la actividad, lo que limita el uso de las técnicas de la expresión de genes o proteínas para medir la actividad de la calpaína. Esta detalles del protocolo de vídeo un ensayo de citometría de flujo desarrollado en nuestro laboratorio para medir la actividad de la calpaína en células fijadas y de vida. Este método utiliza el sustrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que se escinde específicamente por la calpaína, para medir la actividad de calpaína.<sup&gt; 2</sup&gt; En este video, la actividad de la calpaína en fijo y que viven las células murinas 32Dkit leucemia, solo o como parte de una población de esplenocitos se mide utilizando un LSRII (BD Bioscience). 32Dkit células han demostrado tener actividad elevada en comparación con esplenocitos normales.

Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Las calpaínas son proteasas de cisteína neutras, sensibles al calcio e intracelulares, presentes en todas partes 1. Las calpaínas desempeñan funciones cruciales en numerosos procesos fisiológicos, ...

Las calpaines son proteasas intracelulares, sensibles al calcio, de tipo cisteína y de naturaleza neutra, que desempeñan funciones cruciales en muchos procesos fisiológicos, incluyendo la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular. Para medir la actividad de las calpaines en células fijadas y vivas, se añade el sustrato fluorescente BUC, LMC MAC. Buc LMC MAC es escindido específicamente por la calpaína, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia. El cambio en la fluorescencia se monitorea mediante citometría de flujo, lo que revela un incremento en la actividad de la calpaína en células 30 2D kit en comparación con citoes normales.Hola, soy Christina Farr del laboratorio del Dr. Stewart Berger en la Universidad de Toronto, en el Departamento de Inmunología y la Red de Salud Universitaria. Hoy les mostraré cómo medir la actividad de la calpaína en células fijadas y vivas utilizando un ensayo basado en citometría de flujo. Utilizamos este ensayo en nuestro laboratorio para analizar la actividad de la calpaína en células de leucemia y linfoma.Así que comencemos. Antes de iniciar los experimentos, prepare los reactivos necesarios, incluyendo el reactivo de detección 1%PARAFORM aldehído calpain inhibidor PD 1 50 0 6 0 6, y el inhibidor de MEC uno PD 9 8 0 5 9. Para obtener más detalles sobre la preparación de estos reactivos, consulte el protocolo escrito adjunto. Añada un mililitro de paraformaldehído al 1% a cada tubo fax.Se requieren tres tubos de fax para cada condición experimental de las células fijadas mostradas en este video. Se prueban tres condiciones, por lo que se necesitan nueve tubos de fax. Comience con 32 células dki a 0,5 o una vez 10 de las seis células por mililitro cultivadas en medio óptimo.Suplementado con suero bovino fetal, IL-3, etanol capto y antibióticos. Transfiera cuatro veces 10 a la seis células a cada uno de tres tubos cónicos de 15 mililitros. Coloque los tubos en la centrífuga y forme el precipitado mediante centrifugación a 225 ×g durante cinco minutos a 15 grados Celsius.Tras el agente centrífugo, aspire el sobrenadante y re suspenda las células en dos mililitros de PBS a temperatura ambiente. Trate una suspensión celular con 50 micromolar del inhibidor de calpain PD 150606. Asegúrese de que la muestra esté protegida de la luz cubriendo el tubo con papel de aluminio. Agite brevemente mediante vórtex y luego incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.Trate la segunda suspensión celular con 20 micromolar de un inhibidor de ME, PD 9 0 5 9. Siembre las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros e incúbelas durante dos horas a 37 grados Celsius mientras las muestras están en incubación. Comience el ensayo de calpaína en las muestras no tratadas.Comience añadiendo dos mililitros de reactivo de detección a la suspensión celular. Inmediatamente añada un mililitro de la mezcla de suspensión celular y reactivo de detección a los tubos fax previamente preparados para generar la muestra de T igual a cero. Incube las suspensiones celulares con el reactivo de detección durante cinco minutos.A temperatura ambiente, agregue un mililitro de la mezcla de reactivo de detección de suspensión celular al tubo fax previamente preparado con un mililitro de paraformaldehído al 1 % para generar la muestra T igual a cinco. Continúe incubando las suspensiones celulares restantes con la mezcla de detección durante cinco minutos adicionales a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, transfiera otro mililitro de la suspensión celular a un tubo fax preparado con un mililitro de paraformaldehído al 1 %.Este es el punto temporal de T igual a 10 minutos. A continuación, repita el ensayo de calpain en 30 células 2D kit tratadas con inhibidores. Cubra el soporte con papel de aluminio.Fije las células durante la noche en la oscuridad a cuatro grados Celsius al día siguiente. Pelotee las células centrifugándolas a 725 Gs durante cinco minutos a 15 grados Celsius. Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y luego resuspenda las células en 750 microlitros de PBS.Coloque las células en hielo y manténgalas en la oscuridad hasta el momento de realizar la citometría de flujo. Aquí se muestra la adquisición de datos para células fijadas. Realice la citometría de flujo utilizando un LSR dos.Configure los filtros para la onda de luz ex para excitación con láser UV a 355 nanómetros y la potencia del láser a 25 milivatios, con una emisión de 405 y 450 nanómetros para el sustrato y el producto, respectivamente. Los filtros pasa banda (BAM) utilizados para el sustrato y el producto deben ser 405/20 y 450/50. Los filtros pasa largos para el sustrato y el producto deben ser 405 y 450.Establezca un voltaje del PMT de 350 a 375 para el sustrato y de 325 a 350 para el producto. Configure un experimento BD FACS Diva con los siguientes parámetros. Dispersión frontal dispersión lateral Indo uno azul utilizando una escala logarítmica y uno violeta.Utilice también una escala logarítmica en la hoja de trabajo. Configure los siguientes gráficos. Un gráfico de dispersión frontal versus dispersión lateral con una compuerta en las células viables.Un histograma azul Indo uno, un histograma violeta Indo uno y un diagrama de puntos azul Indo uno versus violeta Indo uno calibran el LSR dos con un flujo de línea y un flujo de línea más perlas fluorescentes. El voltaje del PMT debe ajustarse para colocar el pico del histograma fluorescente de las perlas en el mismo canal antes de cada experimento. Comience a adquirir datos utilizando las células del kit 30 2D en el punto de tiempo cero minutos.Ajuste los voltajes de los parámetros según sea necesario. Adquiera y registre 10.000 eventos por muestra. Enjuague la máquina con tampón fax y repita la adquisición para cada muestra.Exporte los datos tras la adquisición de datos. Asegúrese de que el LSR two se limpie según las directrices del instituto. Prepare las suspensiones celulares como antes, sin agregar el reactivo de detección ni el inhibidor de calpain.Lleve las muestras al LSR dos y configure los filtros y parámetros como antes. Configure la hoja de trabajo como antes. Incluya un gráfico de puntos grande que muestre Indo uno azul frente al tiempo.Configure el programa para adquirir el número máximo de eventos. Sin compuerta de detención. Añada 50 micromolar de inhibidor de calpainas a una suspensión celular de células del kit 32 G.Mantenga la muestra en la oscuridad e incúbela a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos mientras las células están incubando. Comience a adquirir datos en la suspensión celular del kit 2D 30 sin el inhibidor de calpainas. Utilice un flujo bajo de 200 a 300 eventos por segundo.Después de 30 segundos a un minuto, retire el tubo de la máquina. Añada 20 micromolar de Bach LMC mac a las células. Este es el reactivo de detección.Es escindido específicamente por la calpaina y esta escisión provoca un aumento en el vórtice de fluorescencia del sustrato. A continuación, continúe adquiriendo los datos. Adquiera datos durante 10 a 20 minutos o hasta que la actividad de la calpaína alcance una meseta.A continuación, repita la adquisición con 32 células gki tratadas con inhibidor de calpaína. Cuando finalice, exporte los datos para su análisis. Comience el ensayo de células mixtas con una suspensión celular generada a partir de bazo de ratón.Divida cada suspensión celular en dos. Trate una suspensión celular con 50 micromolar de inhibidor de calpaína, cúbrala con papel de aluminio e incube de 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de realizar el ensayo de calpaína como se describió previamente para células fijadas, cubra los tubos con papel de aluminio e incube las células durante la noche a cuatro grados Celsius en la oscuridad.Al día siguiente, centrifugar a 725 G durante cinco minutos a 15 grados Celsius. Aspirar el sobrenadante, lavar las células con 500 microlitros de PBS y volver a aspirar el sobrenadante; resuspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción con 2 %BSA e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, preparar el anticuerpo primario aquí, ZI anti-US.El CD uno 17 se prepara en tampón de tinción de manera que la dilución final sea de uno a 200. Asegúrese de que el anticuerpo se mantenga en la oscuridad. Añada 200 microlitros del anticuerpo primario a las células, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.A continuación, agregue 400 microlitros de PBS para aumentar el volumen para citometría de flujo. Coloque las células en hielo y manténgalas en la oscuridad. Adquiera los datos utilizando el mismo procedimiento de citometría de flujo mostrado para células fijadas.Agregue ZI a los parámetros e incluya un histograma para ZI en la hoja de trabajo tras la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Analice utilizando el gating de FlowJo en células viables basado en el perfil de dispersión hacia adelante y dispersión interna. Determine la fluorescencia media de Indo Blue a partir de la puerta de células viables.En este gráfico, la línea roja indica la fluorescencia media del sustrato en cero minutos, y las líneas azul y verde indican la fluorescencia media del sustrato a los cinco y diez minutos. Para la población celular mixta, utilice la fluorescencia FXI en histogramas y gráficos de puntos para identificar la población 30 2D kip. Determine la fluorescencia media de endo azul de la población 30 2D kip.Finalmente, utilice Microsoft Excel para graficar la fluorescencia media. Calcule la pendiente de la línea entre cinco y diez minutos. Represente la pendiente en un gráfico de barras para determinar la actividad de calpainas en las células.Los datos mostrados aquí indican que 30 células 2D tienen altos niveles de actividad de cal pain y que la actividad de cal pain puede ser inhibida por inhibidores de MEK. Acabamos de mostrarle cómo medir la actividad de cal pain en células fijadas y vivas. Al realizar esta técnica, es importante configurar correctamente el LSR dos y calibrar el equipo utilizando perlas fluorescentes.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el marcaje de células neuronales con anticuerpos para complejos de cadenas respiratorias mitocondriales, proteínas asociadas al ADN mitocondrial y proteínas de la membrana externa mitocondrial, seguido de citometría de flujo para cuantificar sus niveles.

Medición de Múltiples Parámetros Mitocondriales en Neuronas mediante Citometría de Flujo

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Mitofagia, la degradación selectiva de las mitocondrias, se ha implicado en la homeostasis mitocondrial y desregulado en varias enfermedades humanas. Sin embargo, convenientes métodos experimentales para medir la actividad de la mitofagia son muy limitados. Presentamos un ensayo sensible para medir la actividad de la mitofagia mediante citometría de flujo.

Medida sensible de la mitofagia por reportero fluorescente flujo Cytometry usando el pH-dependiente mt-Keima

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Proporcionar sensibilidad unicelular, citometría de flujo en tiempo real está especialmente preparado para cuantificar las funciones de receptor multimodal de cultivos vivos. Con células progenitoras neurales adultas, la función del receptor P2X7 se evaluó mediante la afluencia de calcio detectado por colorante indicador de calcio, formación de poros transmembrana por absorción de bromuro de etidio y fagocitosis usando gotas de látex fluorescentes.

Citometría de flujo en tiempo real de células vivas para investigar la afluencia del calcio, formación de poro y fagocitosis por los receptores P2X7 en células progenitoras neurales adultas

Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.

Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la supervivencia post-estrés en muestras de levadura. El ensayo emplea dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y yoduro de propidio (PI), para cuantificar la integridad de la membrana plasmática. Utiliza la citometría de flujo para proporcionar estimaciones cuantitativas y reproducibles de las fracciones de células vivas, muertas y dañadas para muestras de estrés postoxidativo.

Un ensayo VIVO/MUERTO optimizado junto con citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en células de levadura

Aprende a medir la actividad de calpaínas en células fijas y vivas mediante citometría de flujo usando el sustrato fluorescente BUC-LMC-MAC. Este método permite estudiar procesos celulares y enfermedades como leucemia.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Explorar más videos