Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Los dolores de Cal son proteasas de cisteína neutra, ubicuas, sensibles al calcio intracelular que desempeñan un papel crucial en muchos procesos fisiológicos, incluida la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular para medir la actividad de la calpaína en células fijas y vivas, se agrega el sustrato fluorescente BUC, LMC MAC. Buc LMC MAC es escindido específicamente por la calpaína, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia. El cambio en la fluorescencia se monitorea mediante citometría de flujo, que revela un aumento de la actividad del dolor cal en 30 células kit 2D en comparación con los citos normales.

Hola, soy Christina Farr del laboratorio del Dr. Stewart Berger en la Universidad de Toronto en el Departamento de Inmunología y la Red de Salud Universitaria. Hoy voy a mostrarte cómo medir la actividad del dolor de cal en células fijas y vivas utilizando un ensayo basado en citometría de flujo. Utilizamos este ensayo en nuestro laboratorio para observar la actividad del dolor cal en las células de leucemia y linfoma.

Así que comencemos. Antes de comenzar los experimentos, prepare los reactivos necesarios, incluido el reactivo de detección 1%PARAFORM aldehído cal inhibidor del dolor PD 1 50 0 6 0 6 y MEC un inhibidor PD 9 8 0 5 9. Para obtener más información sobre la preparación de estos reactivos, consulte el protocolo escrito adjunto Eloqua un mililitro de formaldehído al 1% para cada tubo de fax.

Se requieren tres tubos de fax para cada condición experimental para las celdas fijas que se muestran en este video. Se prueban tres condiciones, por lo que se necesitan nueve tubos de fax. Comience con 32 células dki a 0,5 a una veces 10 de las seis células por mililitro cultivadas en medios óptimos.

Suplementado con suero fetal bovino, IL, tres tumores, capto etanol y antibióticos. Transfiera cuatro veces 10 a las seis celdas en cada uno de los tres tubos de halcón de 15 mililitros. Coloque los tubos en la centrífuga y pelételos girando a 225 Gs durante cinco minutos a 15 grados centígrados.

Después del agente centrífugo, aspire el snat, resuspenda las células en dos mililitros de PBS a temperatura ambiente, trate una suspensión celular con 50 micromolares cal inhibidor del dolor PD 1 50 0 6 0 6. Asegúrese de que la muestra esté protegida de la luz cubriendo el tubo con papel de aluminio. Vórtice: Brevemente, luego incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Tratar la suspensión de la segunda célula con 20 micromolares me un inhibidor PD 9 0 5 9. Coloque las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros e incube durante dos horas a 37 grados centígrados mientras se incuban las muestras. Comience el ensayo de cal Calpain en las muestras no tratadas.

Comience agregando dos mililitros de reactivo de detección a la suspensión celular. Añada inmediatamente un mililitro de la mezcla de reactivos de detección de suspensión celular a los tubos de fax previamente preparados para generar la muestra T igual a cero. Incubar las suspensiones celulares con reactivo de detección durante cinco minutos.

A temperatura ambiente, agregue un mililitro de la mezcla de reactivo de detección de suspensión celular al tubo de fax previamente preparado con un mililitro de aldehído paraformado al 1% para generar la muestra T igual a cinco. Continúe incubando las suspensiones celulares restantes con la mezcla de detección durante cinco minutos adicionales a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, transfiera otro mililitro de la suspensión celular a un tubo de fax preparado con un mililitro de aldehído Paraform al 1%.

Esto es el T igual a 10 minutos. A continuación, repita el ensayo de dolor cal en 30 células kit 2D que hayan sido tratadas con inhibidores. Cubra la rejilla con papel de aluminio.

Fije las celdas durante la noche en la oscuridad a cuatro grados centígrados al día siguiente. Granular las células centrifugandolas a 725 Gs durante cinco minutos a 15 grados centígrados. Después del centrifugado, aspire el sobrenadante y luego vuelva a suspender las células en 750 microlitros de PBS.

Coloque las células en hielo y manténgalas en la oscuridad hasta que sea el momento de realizar la citometría de flujo. Aquí. Se demuestra la adquisición de datos para celdas fijas. Realice la citometría de flujo utilizando un LSR dos.

Ajuste los filtros para la línea de excitación de onda de luz o láser UV a 355 nanómetros y la potencia del láser a 25 milivatios con una emisión de 405 y 450 nanómetros para el sustrato y el producto, respectivamente. Los filtros de paso BAM utilizados para el sustrato y el producto deben ser 405 sobre 20 y 450. Más de 50 filtros de paso largo para sustrato y producto deben ser 405 y 450.

Ajuste el voltaje PMT a 350 a 375 para el sustrato y de 325 a 350 para el producto. Configure un experimento de diva de fax BD con los siguientes parámetros. Dispersión hacia adelante, dispersión lateral, Indo, una azul usando una escala logarítmica y una violeta.

También usando una escala logarítmica en la hoja de cálculo. Configure los siguientes gráficos. Un diagrama de dispersión directa frente a dispersión lateral con una puerta en celdas vivas.

Un histograma Indo uno azul, un histograma Indo uno violeta y un diagrama de puntos Indo uno azul versus Indo un violeta calibran el LSR dos con un flujo lineal y un flujo lineal más perlas fluorescentes. El voltaje PMT debe ajustarse para colocar el pico del histograma fluorescente de perlas en el mismo canal antes de cada experimento. Comience a adquirir datos utilizando las 30 celdas del kit 2D en el punto de tiempo de minuto cero.

Ajuste los voltajes de los parámetros según sea necesario. A adquirir y registrar 10.000 eventos por muestra. Enjuague la máquina con tampón de fax y repita la adquisición para cada muestra.

Exporte los datos después de la adquisición de datos. Asegúrese de que el LSR dos se limpie de acuerdo con las pautas del instituto. Prepare las suspensiones celulares como antes sin agregar el reactivo de detección o el inhibidor del dolor cal.

Lleve las muestras al LSR dos y configure los filtros y parámetros como antes. Configure la hoja de trabajo como antes. Incluya un diagrama de puntos grande que muestre Indo un azul frente al tiempo.

Configure el programa para adquirir el número máximo de eventos. No hay puerta de parada. Agregue 50 micromolares de inhibidor del dolor cal a una suspensión celular de 32 g de células del kit.

Mantenga la muestra en la oscuridad e incorpórela a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos mientras se incuban las células. Comience a adquirir datos sobre la suspensión celular del kit 30 2D sin el inhibidor del dolor cal. Utilice un caudal bajo de 200 a 300 eventos por segundo.

Después de 30 segundos a un minuto, retire el tubo de la máquina. Agregue 20 micromolares de Bach LMC mac a las células. Este es el reactivo de detección.

Es escindido específicamente por la calpaína y su escisión da lugar a un aumento del vórtice de fluorescencia del sustrato. Brevemente, luego continúe adquiriendo los datos. Adquiera datos durante 10 a 20 minutos o hasta que la actividad del dolor cal se estabilice.

A continuación, repita la adquisición con 32 células gki tratadas con un inhibidor del dolor cal. Cuando termine, exporte los datos para su análisis. Comience el ensayo de células mixtas con una suspensión celular generada a partir del bazo de un ratón.

Divida cada suspensión celular en dos. Trate la suspensión de una célula con 50 micromolares de cal que cubre el inhibidor del dolor con papel de aluminio e incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de realizar el ensayo de calpaína como se ha descrito anteriormente para las células fijas, cubra los tubos con papel de aluminio e incube las células durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad.

Al día siguiente, centrifugar a 725 Gs durante cinco minutos a 15 grados centígrados. Aspirar el sobrenadante, lavar las células en 500 microlitros de PBS y aspirar de nuevo el sobrenadante, resuspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción con 2%BSA incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, prepare el anticuerpo primario aquí, ZI anti-US.

CD one 17 se prepara en tampón de tinción de modo que la dilución final sea de uno a 200. Asegúrese de que el anticuerpo se mantenga en la oscuridad. Agregue 200 microlitros de anticuerpo primario a las células, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

A continuación, agregue 400 microlitros de PBS para aumentar el volumen para la citometría de flujo. Coloque las celdas en hielo y manténgalas en la oscuridad. Adquiera datos utilizando el mismo procedimiento de citometría de flujo que se muestra para las células fijas.

Agregue ZI a los parámetros e incluya un histograma para ZI en la hoja de trabajo después de la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Analice el uso de la marcha FlowJo en células vivas en función del perfil de dispersión hacia adelante y hacia adentro. Determine la fluorescencia media de Indo Blue a partir de la puerta de la célula viable.

En este gráfico, la línea roja indica la fluorescencia media del sustrato a los cero minutos y las líneas azul y verde indican la fluorescencia media del sustrato a los cinco y 10 minutos. Para la población de células mixtas, utilice la fluorescencia FXI en histogramas y diagramas de puntos para identificar la población kip 2D de 30 dimensiones. Determine la fluorescencia media del azul endo de la población de 30 kip 2D.

Por último, utilice Microsoft Excel para graficar la fluorescencia media. Calcula la pendiente de la línea entre cinco y 10 minutos. Grafica la pendiente como un gráfico de barras para determinar la actividad del dolor en las celdas.

Los datos que se muestran aquí indican que 30 células 2D tienen altos niveles de actividad cal pain y que la actividad cal pain puede ser inhibida por inhibidores de MEK. Acabamos de mostrarte cómo medir la actividad del dolor cal en células fijas y vivas. Al realizar esta técnica, es importante configurar correctamente el LSR dos y calibrar la máquina con perlas fluorescentes.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.