Medición de Ca intracelular

El objetivo general de este procedimiento es medir las fluctuaciones de calcio intracelular en espermatozoides humanos mediante colorantes fluorescentes. Esto se logra primero preparando la muestra de espermatozoides mediante el método de ascenso y, si es necesario, promoviendo la capacitación. El segundo paso consiste en cargar los espermatozoides con un colorante fluorescente de calcio.

A continuación, utilizando fluorometría convencional, fluorometría de flujo interrumpido, citometría de flujo o imágenes de célula individual, realice el experimento y registre las mediciones de calcio. Finalmente, se analizan los resultados para determinar los cambios en las concentraciones intracelulares de calcio inducidos por la progesterona o durante el proceso de capacitación. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los que implican radioactividad, es que se trata de un procedimiento muy sensible.

Es seguro y fácil de realizar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de calcio mediante SPR, como la identificación de compuestos que inducen calcio intracelular, aumentos con alta resolución espacial y temporal, y la identificación de diferentes subpoblaciones celulares en una muestra de semen. Las implicaciones del uso, por ejemplo, de la técnica de citometría de flujo se extienden hacia el diagnóstico de problemas de fertilidad mediante el análisis del estado fisiológico de los gametos masculinos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el estudio de la movilización de calcio en espermatozoides humanos, también puede aplicarse a otros tipos de células, como gametos masculinos de otras especies o diferentes tipos de células, tales como neuronas o células musculares. En general, las personas que utilicen este método podrían tener dificultades, ya que el manejo de los espermatozoides no es sencillo y es fundamental mantener condiciones adecuadas para obtener células viables y móviles durante todo el experimento. Hemos implementado el uso de estas técnicas combinando estrategias que emplean diferentes campos.

La demostración visual de este método es importante, ya que la preparación y manipulación de la muestra, así como la adición de los compuestos, son difíciles de aprender porque las células espermáticas pueden dañarse durante el procedimiento y podrían obtenerse artefactos en las respuestas durante la adición de los compuestos. Para preparar la muestra de espermatozoides, se debe superponer cuidadosamente un mililitro de medio hams F 10 sobre cada muestra de semen licuado de 500 microlitros. Eloqua, toque la pared del tubo con la punta de la micropipeta y desprenda suavemente el medio por encima de la muestra.

Es fundamental hacerlo lentamente para evitar mezclar las capas de la muestra y del medio. El medio se suplementa con dos milimolares de cloruro de calcio y cinco miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina (BSA). Para favorecer la capacitación in vitro, incline cuidadosamente los tubos hasta un ángulo aproximado de 30 grados.

Esto aumentará el área de superficie entre los dos líquidos, mejorando así el desplazamiento o ascenso de los espermatozoides desde la muestra hacia el medio durante la incubación. A continuación, coloque los tubos de ensayo inclinados dentro de una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, 95% de aire durante una hora tras transcurrida una hora.

Utilice una micropipeta para retirar cuidadosamente de cada tubo los 700 microlitros superiores del medio Hams F-10 que ahora contiene espermatozoides móviles. Reúna todas las muestras recolectadas en un solo tubo de vidrio limpio, evitando la formación de burbujas. Coloque 10 microlitros de la muestra agrupada sobre el vidrio ópticamente plano de la base de una cámara de conteo macular y coloque el cubreobjetos.

Asegúrese de evitar la formación de burbujas dentro de la cámara, ya que esto daría lugar a un conteo celular inexacto. Observe bajo un microscopio compuesto equipado con un objetivo de 20 x. El cubreobjetos de la cámara de conteo macular tiene un cuadrado grande compuesto por 100 cuadrados más pequeños.

Cuente las células en cualquier tira de 10 cuadros. Este número representa la concentración celular en millones de células por mililitro. Repita el conteo en otras dos tiras adicionales de 10 cuadros y calcule la media de los tres conteos para cargar las células con un colorante fluorescente.

Combine en un tubo fuge de 1,5 mililitros el volumen requerido de suspensión de espermatozoides con suficiente solución stock de flu oh 3:00 AM a un milimolar para obtener una concentración final de dos micromolar de flu oh 3:00 AM. Incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius y protegido de la luz. Centrifugue el tubo a 750 G durante cinco minutos. La formación de una nube en lugar de un botón indica que las células se encuentran en buenas condiciones. Aspire y deseche el sobrenadante y resuspenda el botón en el volumen adecuado de medio para espermatozoides humanos o HSM. Para comenzar este experimento, combine en un tubo de vidrio de fondo plano 570 microlitros de HSM y 30 microlitros de suspensión de células espermáticas previamente cargadas con flu oh 3:00 AM y resuspendidas en HSM para obtener uno por diez a la octava células por mililitro.

Coloque una barra magnética de agitación dentro del tubo de vidrio e inserte el tubo en la cámara de lectura del espectrómetro precalentado a 37 grados Celsius. La muestra debe agitarse durante todo el tiempo de adquisición. Inicie el experimento utilizando el software oli y proceda a adquirir valores de fluorescencia a una frecuencia de 0.5 hercios durante 300 segundos.

Después de adquirir la fluorescencia basal durante 30 segundos, utilice una jeringa microsiringa Hamilton para inyectar el volumen adecuado del compuesto de prueba, en este caso progesterona micromolar a los 100 segundos. A los 20 micromolar ionomicina como control positivo para obtener el valor máximo de fluorescencia. En este experimento, los cambios de calcio intracelular se miden con alta resolución temporal.

Utilizando un mezclador de flujo detenido SFM 20 acoplado a un sistema óptico de cinética rápida, llene una de las jeringas del instrumento con un mililitro de células espermáticas cargadas con flu. y la segunda jeringa con un mililitro del compuesto que se va a probar: 20 micromolar de progesterona disuelta en HSM.

En este ejemplo, es fundamental evitar la formación de burbujas al aspirar los líquidos en las jeringas. Eleve ambos pistones del instrumento hasta que toquen la punta de los émbolos de las jeringas. Establezca el tiempo total de muestreo en este caso en 50 segundos y la frecuencia en 10 milisegundos para minimizar el daño celular; configure la velocidad de flujo al valor mínimo que proporcione un disparador de respuesta medible.

La mezcla de reactivos y el trazado de la fluorescencia cruda frente al tiempo se mostrarán en la pantalla del ordenador. Repita este procedimiento sustituyendo la progesterona por HSM como control negativo y la ionomicina 10 micromolar como control positivo antes de la citometría de flujo. Prepare las muestras experimentales colocando 500 microlitros de suspensión celular por tubo de citómetro bajo cada condición que se vaya a probar.

Configure un experimento utilizando el software del equipo. Primero, cree una nueva carpeta, especímenes de experimento y número de tubos. Luego, seleccione la configuración adecuada del citómetro para flu O 3:00 AM. Utilice los filtros de isotiocianato de fluoresceína y yoduro de propidio.

Analice los tubos de control sin teñir uno y dos en el citómetro. Recolecte datos de dispersión directa y lateral para verificar que los ajustes de umbral sean adecuados y para crear la compuerta correspondiente con el fin de discriminar los restos celulares de las células. Analice los tubos experimentales y recolecte datos de fluorescencia de 10.000 eventos por muestra.

Al final. Exporte todos los datos al software disponible para su análisis. Prepare las laminillas redondas necesarias para este procedimiento aplicando una gota de cinco microlitros de solución de poli-L-lisina en el centro de cada laminilla.

Deje reposar durante al menos una hora antes de usar; enjuague la zona tratada con agua. Esto eliminará el exceso de polilisina y permitirá que las células espermáticas se adhieran al cubreobjetos por su cabeza, mientras que sus flagelos aún pueden moverse. Monte el cubreobjetos dentro de la cámara de registro.

Coloque 10 microlitros de células cargadas con flu oh 3:00 AM a una concentración de uno por 10 a la séptima células por mililitro en el centro del cubreobjetos. Cubra las células con 200 microlitros de HSM previamente calentado.

Coloque la cámara sobre la platina del microscopio, precalentado a 37 grados Celsius, y observe las células utilizando contraste de fase. Seleccione un área donde la densidad celular sea adecuada para la obtención de imágenes. Un exceso de células dificulta el análisis debido a la superposición de señales.

Las células deben estar firmemente adheridas al cubreobjetos por su cabeza, pero deben exhibir movimiento de los flagelos, lo que confirma su viabilidad. Inicie el experimento activando el software de adquisición de imágenes en serie temporal. Normalmente se requieren cuatro imágenes por segundo con una iluminación de dos milisegundos por imagen.

Adquiera imágenes de fluorescencia en modo en vivo. Para ajustar el enfoque y el brillo. Utilice una micropipeta para agregar cuidadosamente gota a gota el compuesto de prueba, progesterona en este caso, y continúe la adquisición de imágenes según sea necesario.

Realice dos adiciones control secuenciales en la misma cámara: 20 micromolar de ionomicina para obtener fluorescencia máxima y cinco milimolar de cloruro de manganeso para obtener fluorescencia mínima. Realice el análisis de imágenes fuera de línea utilizando el software IQ.

Dibuje las regiones de interés o ROI alrededor de cada célula o parte de una célula. Además, seleccione un área libre de células para la sustracción automática del fondo por parte del software. Luego, se obtiene una serie de intensidad de fluorescencia en el tiempo para cada ROI, y estos datos pueden exportarse a Microsoft Excel para su posterior análisis.

La progesterona es uno de los inductores conocidos de la reacción acrosomal y, como era de esperar, provoca un aumento transitorio de la concentración intracelular de calcio en espermatozoides humanos, medido mediante fluorometría convencional. El trazo de fluorescencia roja frente al tiempo muestra los cambios en la concentración intracelular de calcio provocados por la adición de cuatro micromolar de progesterona; como control negativo, se añadió HSM, lo que no causó ningún cambio en los niveles de concentración intracelular de calcio, tal como indica el trazo de fluorescencia azul. Como control positivo, se muestra el cambio inducido por ionomicina 10 micromolar en cada trazo.

La adición de este ionóforo de calcio provoca el aumento máximo de la concentración intracelular de calcio en las células RA, que no vuelve a los niveles basales. Este gráfico de barras muestra el cambio promedio en la fluorescencia delta F para cada condición, más o menos el error estándar, donde N es igual a tres y el asterisco indica un valor de P menor a 0,001 en comparación con el control. El aumento de la concentración intracelular de calcio inducido por la progesterona se midió con mayor resolución temporal mediante fluorometría de flujo detenido y aquí se muestran resultados representativos.

Los trazos brutos se muestran en el panel A; tanto la progesterona, representada por la línea roja, como el ionomicina, representado por la línea azul, provocaron un aumento rápido en la concentración intracelular de calcio. El trazo verde corresponde al control negativo, en el que las células se mezclaron con HSM. El panel B muestra los trazos corregidos para las señales inducidas con progesterona o con ionomicina, obtenidos restando la señal del control de sus señales brutas correspondientes.

La progesterona provocó un aumento muy rápido y transitorio en la concentración intracelular de calcio, con un valor máximo de fluorescencia que se produjo 2,7 segundos después de la adición del inductor. Por otro lado, la CIN provocó un aumento rápido y sostenido en la concentración intracelular de calcio durante 50 segundos. El recuadro en el panel B muestra una vista ampliada de los primeros 500 milisegundos de cada respuesta.

La ausencia de un retraso en el aumento de la concentración intracelular de calcio inducido por progesterona es consistente con informes previos que sugieren que la progesterona activa directamente el canal de calcio cat sperr sin señalización intermedia. La concentración intracelular de calcio también se midió en espermatozoides humanos capacitados y no capacitados mediante citometría de flujo. En estos representativos gráficos de dispersión directa y lateral.

Las células capacitadas aparecen en azul y las no capacitadas en rojo. La puerta seleccionada se indica con la línea azul, y solo se utilizaron para el análisis posterior las células dentro de esa área. El panel B muestra el histograma de fluorescencia en el canal Fitzy de los espermatozoides no teñidos, y el panel D muestra el histograma de fluorescencia en el canal FZ de los espermatozoides teñidos con flu oh 3:00 AM, como se observa en el panel D. La distribución de los valores de fluorescencia para los espermatozoides capacitados, representada por la traza azul, se desplaza hacia valores más altos en comparación con los espermatozoides no capacitados, representados por la traza roja.

El panel C muestra el histograma de fluorescencia en el canal de PI proveniente de células no teñidas y el panel E muestra el histograma de fluorescencia en el canal de PI proveniente de células muertas. Los valores de fluorescencia de cada célula individual pueden observarse en los diagramas de puntos de fluorescencia bidimensionales mostrados aquí. Para las células no teñidas y las células doblemente teñidas con flu oh 3:00 AM y PI, el porcentaje de células registradas en cada cuadrante se indica mediante el número rojo.

Es importante destacar que la señal procedente de células muertas puede eliminarse. Por último, se midió el cambio en la concentración intracelular de calcio inducido por la progesterona en células espermáticas individuales mediante imágenes; estas imágenes representativas en pseudocolor muestran células visualizadas al inicio y tras la adición de progesterona, CIN y cloruro de manganeso. La adición de progesterona provoca un incremento en la concentración intracelular de calcio, tanto en la cabeza espermática como en la cola; el cloruro de manganeso se utiliza para disminuir la flu.

En esta figura se muestra la fluorescencia a las 3:00 AM mediante el apagado de trazas de fluorescencia normalizadas representativas de nueve células individuales del experimento. Como se observó en los experimentos con poblaciones, el análisis de células individuales reveló un aumento transitorio y un aumento sostenido para la progesterona y la ionomicina, respectivamente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro horas si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar verificar la viabilidad de las células y llevar a cabo los controles apropiados tras seguir este protocolo. Podrían realizarse otros métodos, como la electrofisiología, para responder preguntas adicionales, tales como la identificación de canales iónicos específicos implicados en los aumentos de calcio, mediante el uso de soluciones apropiadas y protocolos de simulación tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología celular exploraran la dinámica del calcio en células vivas con alta resolución espacial y temporal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seleccionar la técnica más adecuada para medir los aumentos de calcio intracelular utilizando colorantes fluorescentes en cualquier tipo de célula, dependiendo de la pregunta específica que desee responder. No olvide que trabajar con muestras de semen humano puede ser peligroso y que deben tomarse precauciones, como el uso de donantes de salud comprobada. El uso de guantes de látex durante el procedimiento y la eliminación adecuada de soluciones y materiales siempre deben considerarse al realizar este procedimiento.