Medición de Ca intracelular ^{2 +} Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

El objetivo general de este procedimiento es medir las fluctuaciones de calcio intracelular en el esperma humano con tintes fluorescentes. Esto se logra preparando primero la muestra de esperma por el método de swim up y, si es necesario, promoviendo la capacitación. El segundo paso es cargar los espermatozoides con un tinte fluorescente de calcio.

A continuación, utilizando fluorometría convencional de flujo detenido, citometría de flujo o imágenes de una sola célula, realice el experimento y registre las mediciones de calcio. En última instancia, los resultados se analizan para determinar los cambios en las concentraciones de calcio intracelular desencadenados por la progesterona o durante el proceso de capacitación. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los que implican radiactividad, es que se trata de un procedimiento muy sensible.

Es seguro y fácil de realizar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización del calcio SPR, como la identificación de compuestos que inducen calcio intracelular, aumentos con alta resolución espacial y temporal y la identificación de diferentes subpoblaciones celulares en una muestra de siemen. Las implicaciones del uso, por ejemplo, de la técnica de citometría de flujo se extienden hacia el diagnóstico de problemas de fertilidad a través del análisis del estado fisiológico de las gamas masculinas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el estudio de la movilización de calcio de los espermatozoides humanos, también se puede aplicar a otros tipos de células, como gamas masculinas de otras especies o diferentes tipos de células, como neuronas o células musculares. Generalmente, las personas que usan este método tendrán dificultades porque el manejo de los espermatozoides no es fácil y es importante mantener las condiciones adecuadas para obtener células viables y motoras a través del experimento. Implementamos el uso de estas técnicas mediante la combinación de estrategias utilizando diferentes campos.

La demostración visual de este método es importante, ya que la preparación y el manejo de la muestra, así como la adición de los compuestos, son difíciles de aprender porque los espermatozoides pueden dañarse durante el procedimiento y se pueden obtener artefactos en las respuestas durante la edición de los compuestos. Para preparar la muestra de semen, se debe colocar cuidadosamente un mililitro de medio jamón F 10 sobre cada semen licuado de 500 microlitros. Eloqua, toque la pared del tubo con la punta de la micropipeta y dispense suavemente el medio por encima de la muestra.

Es crucial hacerlo lentamente para evitar mezclar la muestra y las capas medias. El medio se complementa con dos milimolares de cloruro de calcio y cinco miligramos por mililitro de BSA. Para promover la capacitación in vitro, incline cuidadosamente los tubos hasta un ángulo de aproximadamente 30 grados.

Esto aumentará el área de superficie entre los dos líquidos, mejorando así el desplazamiento o la natación de los espermatozoides desde la muestra hasta el medio durante la incubación. A continuación, coloque los tubos de ensayo magros dentro de una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. 95%aire durante una hora después de una hora.

Utilice una micropipeta para extraer cuidadosamente de cada tubo los 700 microlitros superiores del medio jamón F 10 que ahora contiene espermatozoides motil. Agrupe todas las muestras recolectadas en un solo tubo de vidrio limpio, evitando la formación de burbujas. Coloque 10 microlitros de muestra agrupada en el vidrio plano óptico de una base de cámara de recuento macular y coloque el cubreobjetos.

Asegúrese de evitar la formación de burbujas dentro de la cámara, ya que esto daría lugar a un recuento de células inexacto. Observar bajo un microscopio compuesto equipado con un objetivo de 20 aumentos. El cubreobjetos de la cámara de conteo macular tiene un gran cuadrado compuesto por 100 cuadrados más pequeños.

Cuenta las celdas en cualquier tira de 10 cuadrados. Este número representa la concentración celular en millones de células por mililitro. Repita el conteo en dos tiras cuadradas adicionales de 10 y calcule la media de los tres conteos para cargar las celdas con un tinte fluorescente.

Combine en un tubo de fuga de 1,5 mililitros, el volumen requerido de suspensión de esperma con suficiente solución madre de un milimolar para obtener una concentración final de dos micromolares incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados y proteger de la luz centrifugar el tubo a 750 G durante cinco minutos. La formación de una nube en lugar de una bolita indica que las células están en buenas condiciones, aspire y deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la bolita en el volumen apropiado de medio de esperma humano o HSM. Para comenzar este experimento, combine en un tubo de vidrio de fondo plano, 570 microlitros de HSM y 30 microlitros de suspensión de espermatozoides previamente cargados con gripe a las 3:00 AM y resuspendidos en HSM para obtener una vez 10 a la octava célula por mililitro.

Coloque una barra agitadora magnética dentro del tubo de vidrio e inserte el tubo en la cámara de lectura del espectrómetro precalentado a 37 grados centígrados. La muestra debe agitarse durante todo el tiempo de adquisición. Inicie el experimento utilizando el software oli y proceda a adquirir valores de fluorescencia a una frecuencia de 0,5 hercios durante 300 segundos.

Después de adquirir fluorescencia basal durante 30 segundos, utilice una jeringa Hamilton Micro para inyectar el volumen adecuado de compuesto de prueba, en este caso para progesterona micromolar, a los 100 segundos. A 20 micina de iones micromolares como control positivo para obtener el máximo valor de fluorescencia. En este experimento, los cambios de calcio intracelular se miden con alta resolución temporal.

Usando un mezclador de flujo detenido SFM 20 acoplado a un sistema óptico de cinética rabiosa, llene una de las jeringas del instrumento con un mililitro de gripe. 3:00 AM Cargamos los espermatozoides y la segunda jeringa con un mililitro del compuesto a analizar. 20 micromolares de progesterona disueltos en HSM.

En este ejemplo, es crucial evitar la formación de burbujas mientras se introducen los líquidos en las jeringas. Levante ambos pistones del instrumento hasta que toquen la punta de los émbolos de la jeringa. Establezca el tiempo total de muestreo en este caso en 50 segundos y la frecuencia en 10 milisegundos para minimizar el daño a la celda, establezca el caudal en el valor mínimo que proporcionará un desencadenante de respuesta medible.

La mezcla de reactivos, el rastro de fluorescencia cruda frente al tomillo se mostrará en la pantalla de la computadora. Repita este procedimiento reemplazando la progesterona con HSM como control negativo y micina de iones 10 micromolares como control positivo antes de la citometría de flujo. Preparar las muestras experimentales colocando 500 microlitros de suspensión celular por tubo de citómetro en cada condición a ensayar.

Configure un experimento utilizando el software del equipo. En primer lugar, cree una nueva carpeta, una muestra de experimento y un número de tubos. A continuación, seleccione la configuración adecuada del citómetro para la gripe O 3:00 a.m. Utilice los filtros de isotiocianato de fluoresceína y yoduro de propidio.

Coloque los tubos de control uno y dos sin manchar en el citómetro. Recopile datos de dispersión frontal y lateral para verificar que la configuración del umbral sea adecuada y para crear la puerta correspondiente con el fin de discriminar los desechos de las celdas. Ejecute los tubos experimentales y recopile datos de fluorescencia de 10.000 eventos por muestra.

Al final. Exporte todos los datos al software disponible para su análisis. Prepare los cubreobjetos redondos necesarios para este procedimiento aplicando una gota de cinco microlitros de solución de poli L lisina en el centro de cada cubreobjetos.

Dejar actuar durante al menos una hora, antes de usar enjuague el área tratada con agua. Esto eliminará el exceso de polilisina y permitirá que los espermatozoides se adhieran a la cubierta de su cabeza mientras sus flagelos aún pueden moverse. Ensamble el cubreobjetos dentro de la cámara de grabación.

Coloque 10 microlitros de células cargadas de gripe a las 3:00 a.m. a una concentración de una por 10 a la séptima célula por mililitro. En el centro de la cubreobjetos. Cubra las celdas con 200 microlitros de HSM precalentado.

Coloque la cámara en la platina del microscopio, precalentada a 37 grados centígrados, y observe las células mediante contraste de fase. Seleccione un área donde la densidad celular sea apropiada para la obtención de imágenes. Demasiadas celdas dificultan el análisis debido a la superposición de señales.

Las células deben estar firmemente unidas al cubreobjetos por la cabeza, pero exhibir movimiento de flagelos, lo que confirma la viabilidad. Inicie el experimento activando el software de adquisición de imágenes de series temporales. Por lo general, se requieren cuatro imágenes por segundo con una iluminación de dos milisegundos por imagen.

Adquiera imágenes de fluorescencia en modo en vivo. Para ajustar el enfoque y el brillo. En este caso, utilice una micropipeta para añadir con cuidado el compuesto de prueba progesterona y continúe con la adquisición de imágenes según sea necesario.

Realice dos adiciones de control secuenciales en la misma cámara. 20 micina de iones micromolares para obtener la máxima fluorescencia y cinco milimolares de cloruro de manganeso para obtener la mínima fluorescencia. Realice análisis de imágenes sin conexión con el software IQ.

Dibuje las regiones de interés o ROI alrededor de cada celda o parte de una celda. Además, seleccione un área libre de celdas para la sustracción automática del fondo por parte del software. A continuación, se obtiene una serie de intensidad de fluorescencia temporal para cada ROI y estos datos pueden exportarse a Microsoft Excel para su posterior análisis.

La progesterona es uno de los conocidos inductores de la reacción acrosómica y, como era de esperar, provoca un aumento transitorio de la concentración de calcio intracelular en los espermatozoides humanos, medido por fluorometría convencional. El trazo de fluorescencia roja en función del tiempo muestra cambios en la concentración de calcio intracelular causados por la adición de cuatro micromolares de progesterona como control negativo Se añadió HSM, que no causó ningún cambio en los niveles de concentración de calcio intracelular como lo indica el trazo de fluorescencia azul como control positivo. El cambio inducido por la micina de iones 10 micromolares se muestra para cada traza.

La adición de este ionóforo de calcio provoca el aumento máximo de la concentración de calcio celular AR, que no vuelve a los niveles basales. Este gráfico de barras mostró el cambio promedio en la fluorescencia delta F de cada condición, más o menos error estándar donde N es igual a tres y el asterisco indica un valor de P de menos de 0,001 en comparación con el control. El aumento de la concentración de calcio intracelular inducido por progesterona se midió con mayor resolución temporal mediante fluorometría de flujo detenido y aquí se muestran los resultados representativos.

En el panel A se muestran trazas crudas, tanto la progesterona representada por la línea roja como el ion micina representado por la línea azul causaron un rápido aumento de la concentración de calcio intracelular. La traza verde es el control negativo donde las células se mezclaron con HSM. El panel B muestra las trazas corregidas de las señales inducidas con progesterona o con micina iónica obtenidas restando la señal de control de sus correspondientes señales brutas.

La progesterona provocó un aumento muy rápido y transitorio de la concentración de calcio intracelular con un valor máximo de fluorescencia que se produjo 2,7 segundos después de la adición del inductor. Por otro lado, la NIC provocó un aumento rápido y sostenido de la concentración de calcio intracelular a lo largo de 50 segundos. El recuadro del panel B muestra una vista ampliada de los primeros 500 milisegundos de cada respuesta.

La ausencia de un retraso en el aumento de la concentración de calcio intracelular inducido por la progesterona es consistente con informes previos que sugieren que la progesterona activa directamente el canal de calcio sin señalización intermedia. También se midió la concentración de calcio intracelular en espermatozoides humanos capacitados y no capacitados mediante citometría de flujo. En estos diagramas representativos de dispersión frontal y lateral.

Las celdas capacitadas están en azul y las celdas no capacitadas están en rojo. La puerta seleccionada se indica con la línea azul y solo se utilizaron las celdas dentro de esa área para un análisis más detallado. El panel B muestra el histograma de fluorescencia en el canal de Fitzy de espermatozoides sin teñir, y el panel D muestra el histograma de fluorescencia en el canal FZ de espermatozoides teñidos con gripe a las 3:00 a.m. como se observa en el panel D. La distribución de los valores de fluorescencia para los espermatozoides capacitados representados por la traza azul se desplaza a valores más altos en comparación con los espermatozoides no capacitados representados por la traza roja.

El panel C muestra el histograma de fluorescencia en el canal PI de células no teñidas y el panel E muestra el histograma de fluorescencia en el canal PI de células muertas. Los valores de fluorescencia para cada célula individual se pueden observar en los gráficos de puntos de fluorescencia bidimensionales que se muestran aquí. En el caso de las células no teñidas y las células teñidas dos veces con gripe a las 3:00 a. m. y pi, el porcentaje de células registradas en cada cuadrante se indica mediante el número rojo.

Es importante destacar que se puede eliminar la señal que surge de las células muertas. Por último, el cambio en la concentración de calcio intracelular inducido por progesterona se midió en espermatozoides individuales mediante imágenes: estas imágenes representativas en pseudocolor muestran células visualizadas al principio y después de las adiciones de progesterona, CIN y cloruro de manganeso. La adición de progesterona provoca un aumento en la concentración de calcio intracelular, tanto en la cabeza del espermatozoide como en el cloruro de manganeso lum que se utiliza para disminuir la gripe.

En esta figura se muestra la fluorescencia Oh 3:00 AM por extinción de trazas de fluorescencia normalizadas representativas de nueve células individuales del experimento. Como se observó en experimentos poblacionales, el análisis de células individuales reveló un aumento transitorio y sostenido de progesterona y micina iónica, respectivamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la viabilidad de las células y realizar los controles apropiados después de este procedimiento. Se podrían realizar otros métodos, como la electrofisiología, para responder a preguntas adicionales, como la identificación de canales iónicos específicos implicados en los aumentos de calcio mediante el uso de soluciones de proppe y protocolos de simulación posteriores a su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología celular exploraran la dinámica del calcio en células vivas con alta resolución espacial y temporal.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo seleccionar la técnica más adecuada para medir los aumentos de calcio intracelular utilizando dy fluorescente en cualquier tipo de célula, dependiendo de la pregunta específica que le gustaría responder. No olvide que trabajar con muestras humanas de siemen puede ser peligroso y precauciones como el uso de donantes de salud probada. Siempre se debe utilizar globos de látex durante el procedimiento y desechar adecuadamente la solución y los materiales mientras se realiza este procedimiento.