Name: Medición de Ca intracelular 2 + Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Aprende a medir fluctuaciones de calcio intracelular en esperma humano mediante fluorometría convencional, fluorometría de flujo detenido, citometría de flujo e imágenes de células individuales.

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Los autores agradecen a José Luis De la Vega, Erika Melchy y Dr. Takuya Nishigaki de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-México) (99.333 y 128.566 para CT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 de CT).

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<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li>
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<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
<li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Señalización intracelular es vital para la mayoría de las actividades celulares; Ca 2 + es un mensajero ubicuo que acompaña a las células de mamíferos a lo largo de toda su vida útil, desde su origen en la fecundación, hasta el final de su ciclo de vida. En respuesta a diferentes estímulos, [Ca 2 +] i, oscila aumenta y disminuye con codificación espacio-temporal, en consecuencia, se activan diversos procesos, moduladas o terminado por Ca 2 + mensajes codificados. Intracelular de Ca ...

Ca 2 + es un segundo mensajero universal de las vías de transducción de señales en las células eucariotas. Intracelular de Ca 2 + (Ca 2 + i) participa en la regulación de muchos procesos fisiológicos fundamentales tanto en células excitables y no excitables. La importancia y la universalidad de la Ca 2 + como segundo mensajero en la transducción de señales se deriva de su versatilidad espacio-temporal en la transmisión de información dentro de la célula. Mientras Ca 2 + no puede ser sintetizado de novo o degradada dentro de la célula, su concentración intracelular ([Ca2 +] i) se mantiene dentro de límites muy estrictos a través de diferentes mecanismos celulares que continuamente tampón, secuestrar, compartimentar, y / o acumular Ca 2 +. Los cambios en la concentración de este ión se producen en áreas muy localizadas dentro de la célula 1, y descifrar dichas fluctuaciones es esencial para la obtención de uncomprensión eper de (1) su papel en el mecanismo de señalización, (2) su importancia fisiológica, y (3) los mecanismos generales de la señalización celular. Ca 2 +-señalización mediada es de particular importancia en la fisiología de esperma 2. La motilidad del esperma es una de las funciones más importantes para el éxito de la fertilización, y de hecho, varios defectos de la motilidad del esperma puede causar esterilidad 3-5. La importancia de Ca 2 + en el movimiento flagelar se ha reconocido desde hace tiempo 6, sin embargo, el mecanismo de cómo Ca 2 + controla la forma específica de flagelar flexión no se entiende completamente. Antes de fusionarse con el óvulo, los espermatozoides deben someterse a la capacitación, un proceso complejo que depende de la residencia de los espermatozoides dentro del tracto femenino. Durante la capacitación, la arquitectura lipídica de la membrana de los espermatozoides y la organización se modifican, principalmente como resultado de la eliminación del colesterol de la membrana plasmática. Además, varias proteínas son tirosina-fósforoylated 7. Es importante destacar que, durante la capacitación hay un aumento en el pH intracelular (pH i) y de la [Ca2 +] i, y el potencial de membrana hiperpolariza en algunas especies 2. La capacitación se lleva a cabo sólo en una subpoblación de espermatozoides (20-40%), y los mecanismos implicados en estos cambios celulares están lejos de ser clara. Se acepta generalmente que sólo una subpoblación de espermatozoides capacitados se someten a la reacción acrosómica (AR) cuando se expone a los inductores fisiológicos. La AR es también un evento de 2 +-Ca regulada necesaria para la fertilización en todas las especies poseen un acrosoma (orgánulo especializado con membranas externa e interna). Durante este proceso los fusibles de membrana acrosomal exteriores con la membrana plasmática del espermatozoide, la liberación de enzimas hidrolíticas que permiten que la célula de esperma para penetrar la matriz de glico-proteico que rodea el huevo (zona pelúcida, o ZP). La AR también expone una nueva superficie de la célula de esperma fusogénico que interactúa conla membrana plasmática de huevo para la fusión final de los dos gametos. Hay varios ligandos celulares que inducen la AR, la progesterona es uno de los más estudiados entre ellos. En este trabajo se presentan cuatro técnicas diferentes que implican el uso de un colorante fluorescente sensible a Ca + 2 para medir la [Ca 2 +] i los cambios en el esperma humano provocado por la progesterona (a excepción de la citometría de flujo, en el que se midió la [Ca 2 + ] i inducida por aumento durante el proceso de capacitación in vitro). En este caso particular, se utilizó Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorante de la membrana permeable a los con una Kd = 325 nM. In vitro que supervisó cambios de fluorescencia como una función del tiempo con tres de las metodologías, y con la cuarta técnica que mide los valores de fluorescencia en un punto dado en el tiempo. Estos diferentes enfoques se complementan entre sí, ya que en conjunto proporcionan resolución espacial y temporallución en tanto la célula individual y los niveles de población de células. Población celular o experimentos a granel Técnicas granel se utilizan ampliamente no sólo porque los instrumentos que requieren están fácilmente disponibles, sino también porque son simples, bien establecida, y permiten el cálculo del promedio de la información a partir de mediciones realizadas en millones de células en un solo experimento. Técnica # 1. Fluorometría convencional Esta técnica monitorea los cambios en la fluorescencia como una función de tiempo; los experimentos se llevan a cabo en cubetas de vidrio con volúmenes de muestra que van de 200 a 1000 l. Mezcla adecuada de los reactivos añadidos requiere agitación magnética, y por lo tanto, la resolución temporal obtenida es del orden de segundos. El intervalo de concentración celular típica de las muestras analizadas es 10 5 -10 8 células / ml. Técnica # 2. Detenido Fluorometría Flow Tsu técnica también monitorea los cambios en la fluorescencia como una función de tiempo, pero los reactivos se mezclan juntos rápidamente (utilizando la presión) en una cubeta de grabación que contiene un volumen muy pequeño de la muestra (que van de 25-100 l). Por lo tanto, la homogeneización de los reactivos es instantánea, lo que permite una alta resolución temporal en el orden de milisegundos. El análisis de la fluorescencia frente al tiempo huellas resultantes son adecuados para la determinación de las velocidades de reacción, la aclaración de la complejidad del mecanismo de reacción, la obtención de información sobre los intermedios de reacción de vida corta, etc El intervalo de concentración celular común de las muestras analizadas es 10 5 -10 7 células / ml. Experimentos sola célula Experimentos granel informan el comportamiento medio de un gran número de células, sin embargo, una población puede con frecuencia exhiben propiedades heterogéneas que se pasan por alto durante tal tipo de mediciones. Técnicas de células individuales por lo tanto se utilizan para complementar ªinformación de correo obtiene con experimentos población de células. Técnica # 3. Citometría de Flujo A pesar de la importancia de la información que surge a partir de mediciones de células individuales, es importante analizar un gran número de células con el fin de evitar que la extrapolación errónea de las propiedades de células específicas para una población entera. Por esta razón, las técnicas de alto rendimiento se ven favorecidos y el método más popular es la citometría de flujo, en la que 10.000 células por condición se analizan de forma convencional. Este método permite el análisis de múltiples paramétrica de poblaciones heterogéneas, ya que clasifica las células en función de su tamaño (dispersión hacia adelante (FSC)), granularidad (dispersión lateral (SSC)) y la intensidad de fluorescencia (etiquetado específico con un anticuerpo, marcador de viabilidad, etc) , lo que proporciona información sobre la distribución de los parámetros &quot;de un grupo de células. La citometría de flujo proporciona información instantánea en lugar de en función del tiempo 8. Adelante y lateral valores de dispersión are también es útil para la selección de una puerta que incluye células, pero discrimina los restos celulares, el polvo, etc Para las mediciones de fluorescencia, fluorescencia controles negativos y positivos también deben ser incluidos. Si se utiliza más de un canal de fluorescencia, se debe realizar un proceso conocido como compensación (para detalles ver <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensación permite la superposición espectral de la discriminación entre los fluoróforos. La citometría de flujo también permite la discriminación de las células muertas, generalmente por medio de tinción con yoduro de propidio. Técnica # 4. Soltero imágenes de células Microscopía es otro método común para estudiar el comportamiento de células individuales, sino que es muy adecuado para estudios dependientes del tiempo y también proporciona resolución espacial. Un gran inconveniente es que el análisis de alto rendimiento es sólo en su infancia en la actualidad <sa&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado aprox. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Makler Cámara de recuento</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 viales/50 &mu; g cada uno</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reactivos para medio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reactivos para medio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reactivos para medio esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reactivos para medio esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reactivos para medio esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reactivos para medio esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reactivos para esperma humano medio (HSM)</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reactivos para medio espermática humana (HSM)</td></tr><tr><td>L-lactato de sodio (aprox. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L- 7022</td><td>Reactivos para medio esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Componente B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>X-100 Solución de</td><td>2,4 mM en agua </td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm</td></tr><tr><td>de diámetro Solución de poli-L-lisina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Cámara celular, para microscopía</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuro de dimetilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

medición de ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: fluorometría convencional, se detuvo fluorometría flow, citometría de flujo y single imágenes de células

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Los espermatozoides son las células reproductoras masculinas, especialmente diseñados para alcanzar, reconocer y fusionarse con el óvulo. Para realizar estas tareas, los espermatozoides deben estar preparados para enfrentarse a un entorno en constante cambio y superar varias barreras físicas. Siendo en esencia transcripcional y traduccional en silencio, estas células móviles dependen profundamente de diversos mecanismos de señalización para orientarse y nadar de una manera dirigida, y para lidiar con las difíciles condiciones ambientales durante su viaje para encontrar el huevo. En particular, Ca 2 +-señalización mediada es fundamental para varias funciones espermáticas: la activación de la motilidad, la capacitación (un proceso complejo que se prepara esperma para la reacción del acrosoma) y la reacción acrosómica (un evento de exocitosis que permite la fusión esperma-óvulo). El uso de colorantes fluorescentes para rastrear las fluctuaciones intracelulares de este ión es de notable importancia debido a su facilidad de aplicación, la sensibilidad, y la versatilidad de detexión. Utilizando un protocolo de tinte de carga solo utilizamos cuatro técnicas diferentes para controlar fluorométricas espermatozoides Ca 2 + dinámica. Cada técnica proporciona información distinta que permite la resolución espacial y / o temporal, la generación de datos tanto en una sola célula y los niveles de población de células.

<img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático del protocolo experimental para la preparación de la muestra de esperma por el método de la piscina. Los pasos principales para la separación de espermatozoides móviles y para el ajuste de su concentración se ilustran. La última etapa de incubación sólo se realiza cuando se requiere capaci...

Intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámicas son muy importantes en la fisiología de esperma y Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Delicados tintes fluorescentes constituyen una herramienta versátil para su estudio. Experimentos Población (fluorometría y dejó de fluorometría de flujo) y los experimentos de células individuales (citometría de flujo y la imagen única célula) se utilizan para realizar un seguimiento espacio-temporal [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Los cambios en los espermatozoides humanos.

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

El objetivo general de este procedimiento es medir las fluctuaciones de calcio intracelular en espermatozoides humanos mediante colorantes fluorescentes. Esto se logra primero preparando la muestra de espermatozoides mediante el método de ascenso y, si es necesario, promoviendo la capacitación. El segundo paso consiste en cargar los espermatozoides con un colorante fluorescente de calcio.A continuación, utilizando fluorometría convencional, fluorometría de flujo interrumpido, citometría de flujo o imágenes de célula individual, realice el experimento y registre las mediciones de calcio. Finalmente, se analizan los resultados para determinar los cambios en las concentraciones intracelulares de calcio inducidos por la progesterona o durante el proceso de capacitación. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los que implican radioactividad, es que se trata de un procedimiento muy sensible.Es seguro y fácil de realizar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de calcio mediante SPR, como la identificación de compuestos que inducen calcio intracelular, aumentos con alta resolución espacial y temporal, y la identi

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Aquí, presentamos a metodologías para evaluar la integridad de la membrana de spermatozoan, una característica celular asociada con la capacidad de fertilización del esperma. Se describen tres técnicas para la evaluación de fluorimétrico de las membranas del esperma: coloración simultánea con sondas fluorescentes específicas, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo avanzada dedicado de esperma. También se presentan ejemplos de la combinación de las metodologías.

Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

Aquí, dos ensayos de rendimiento medio para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos se describen. Estos ensayos se pueden utilizar para rápidamente y fácilmente grandes cantidades de compuestos de efectos sobre la Ca2 +-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos.

Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

Este protocolo describe cómo realizar registros eléctricos de espermatozoides de mamíferos en una configuración de célula completa, con el objetivo de registrar directamente la actividad de los canales iónicos. El método ha sido fundamental para describir los perfiles electrofisiológicos de varios canales iónicos de espermatozoides y ha ayudado a revelar su identidad molecular y regulación.

Registro de corrientes eléctricas a través de la membrana plasmática de espermatozoides de mamíferos

El presente protocolo proporciona una solución práctica que permite medir la apoptosis, el potencial de membrana mitocondrial y el daño al ADN en espermatozoides humanos con un solo citómetro.

Análisis citométrico de flujo de biomarcadores para la detección de defectos funcionales en espermatozoides humanos

El modelo de ratón AcroSensE y los métodos de obtención de imágenes de células vivas descritos aquí proporcionan un nuevo enfoque para estudiar la dinámica del calcio en el compartimento subcelular del acrosoma, el espermatozoide, y cómo regulan los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.

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Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca2+) en células utilizando imágenes de Ca2+ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca2+ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Un método eficaz para obtener fracciones altamente purificadas meiótica viables de ratón testículos se describe, que combina un refinado protocolo de disociación celular, con la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Este método aprovecha las diferencias en el contenido de ADN nuclear y la densidad de las fracciones discretas meióticas.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Aprende a medir fluctuaciones de calcio intracelular en esperma humano mediante fluorometría convencional, fluorometría de flujo detenido, citometría de flujo e imágenes de células individuales.

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Medición de Ca intracelular

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