Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

El objetivo general de este método es cuantificar la expresión de proteínas de membrana en la superficie celular mediante un ensayo espaciado fluorescente. La principal ventaja de esta técnica es que los ensayos de citometría de flujo proporcionan puntos finales cuantificables en grandes volúmenes de células vivas en un solo experimento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y la terapia de las arritmias ventriculares cardíacas, ya que estas patologías a menudo se asocian con mutaciones genéticas que causan defectos en el tráfico de los canales iónicos cardíacos.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tienen dificultades para identificar un sitio de inserción extrorsal adecuado para el epítopo que no dañe su función proteica y genere una fuerte señal fluorescente en presencia del anticuerpo conjugado. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Benoite Bourdin, asistente de investigación de mi laboratorio. Para empezar, marque dos veces las construcciones de ADN con mCherry en el extremo C intracelular.

Además, expresan un epítopo de hemmaglutinina extra celular, que se puede medir utilizando un anticuerpo de fluorescencia para estimar la expresión de proteínas de membrana en la superficie celular. A continuación, cultive una placa de células TSA201 utilizando técnicas estándar hasta que alcancen el 90% de confluencia. Para cada muestra, prepare los reactivos de transfección en dos tubos.

Prepare un tubo de 1,5 mililitros con cuatro microgramos de ADN y 250 microlitros de medio sérico reducido, y un segundo tubo con 10 microlitros del reactivo de transfección mediado por liposomas y 250 microlitros de medio de cultivo sérico reducido. Mezcle suavemente los dos tubos e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, combine suavemente el contenido del tubo uno y el tubo dos e incube los complejos de ADN liposomado durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Agregue los complejos a las células cultivadas y meca suavemente la placa de cultivo. Vuelva a colocar el plato a 37 grados centígrados y bajo una atmósfera de 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. 24 horas después de la adición del reactivo de transfección, retire el medio de la placa de cultivo y lave cuidadosamente las células con 400 microlitros de tripsina-EDTA precalentado.

A continuación, añade 400 microlitros de tripsina-EDTA e incuba la placa durante cinco minutos para permitir que las células se desprendan de la placa. Una vez desprendido, se detiene la digestión enzimática añadiendo un mililitro de medio de cultivo en frío sin penicilina ni estreptomicina a las células. Pipetee suavemente el medio sobre la placa de cuatro a cinco veces para lavar todas las células de la superficie.

Luego, recoja las células en tubos estériles de 1,5 mililitros y colóquelas inmediatamente en hielo. Para los siguientes pasos, use una solución helada y mantenga las celdas a cuatro grados para evitar la internalización del epítopo de la superficie. Además, disminuya la exposición de las células a la luz para limitar el fotoblanqueo de la señal fluorescente.

A continuación, centrifuga los tubos para pellet las células. Luego, aspire con cuidado y deseche el sobrenadante resultante. Vuelva a suspender el pellet para preparar una suspensión de una sola celda utilizando un mililitro de PBS.

Luego, centrifuga brevemente los tubos. Granular y volver a suspender las células una vez más para eliminar completamente el medio de cultivo. A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en 600 microlitros de PBS.

Mida la concentración de células y ajústela a al menos tres millones de células por mililitro. A continuación, divide las células en nuevos tubos de 1,5 mililitros. Asegúrese de incluir los controles adecuados para discriminar la tinción específica de la tinción inespecífica y para la tinción extracelular y también para la tinción intracelular.

El anticuerpo de control de isótopos ayudará a evaluar el nivel de tinción de fondo y debe coincidir con el anticuerpo primario, el isótopo auspicioso y el fluoróforo. Es importante utilizar el anticuerpo isótopo de control y el anticuerpo fluorescente a la misma concentración. Para estimar la expresión de las proteínas de membrana en la superficie celular, primero etiquete solo el epítopo de HA orientado hacia las células adicionales utilizando un anticuerpo conjugado con luz fluorescente.

A continuación, añada al tubo un anticuerpo monoclonal anti-HA conjugado con FITC a cinco microgramos por mililitro. Agita las células brevemente y luego incubalas en una plataforma basculante en la oscuridad. Retire las células de la oscuridad y agregue 900 microlitros de PBS.

A continuación, centrifugar el tubo para granular las células y aspirar el sobrenadante. A continuación, lave las células volviendo a suspender el pellet en un mililitro de PBS y vórtice brevemente las células. A continuación, repita el paso de centrífuga para volver a pellet las células.

Repita este paso de lavado un total de tres veces para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS y transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo de citometría de flujo de cinco mililitros. Mantenga las celdas en la oscuridad a cuatro grados centígrados hasta que se muestre la muestra.

Para estimar la expresión intracelular de la proteína total, se marcan las células permeabilizadas. Esto se logra utilizando un protocolo similar al marcaje extracelular, pero con la adición de un tampón de permeabilización celular basado en saponinas. Granular las células, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 microlitros de solución de permeabilización de fijación directamente del stock preparado.

Incubar las células en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de lavado de permeabilización recién preparado y haga un vórtice breve de las células. A continuación, granule las células y lávelas dos veces más con el tampón de lavado de permeabilización.

A continuación, añadir el anticuerpo monoclonal anti HA conjugado con FITC a 5 microgramos por mililitro y 100 microlitros de tampón de lavado de permeabilización. Brevemente el vórtice de las células e incubar las células en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, agregue 100 microlitros del tampón de lavado de permeabilización.

Granular las células y lavarlas tres veces en 100 microlitros del mismo tampón que se muestra anteriormente. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS y transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo de citometría de flujo de cinco mililitros. Pase las células permeabilizadas y no permeabilizadas a través del citómetro de flujo el mismo día.

Para comenzar, inicie el software de análisis de citometría de flujo e importe los archivos fcs creados durante la citometría de flujo. Haga clic en la primera muestra e inicie el proceso de compuerta en el gráfico de dispersión lateral frente a dispersión directa. A continuación, dibuje la puerta P1 usando el icono de elipse alrededor de las celdas vivas para eliminar cualquier residuo, celda muerta o agregados.

A continuación, dibuje el gráfico de contorno de los parámetros del tubo del mCherry frente a la intensidad de fluorescencia FITC. Establezca la puerta P2 alrededor de las células positivas FITC y mCherry y la puerta P3 alrededor de la población de células negativas de fluorescencia. A continuación, seleccione las puertas P2 y P3 y haga clic en el icono de agregar estadísticas en la ventana del espacio de trabajo original.

Haga clic en contar y luego haga clic en media. Por último, aplique los parámetros de puertas y las estadísticas a todas las muestras sondeadas por el citómetro. Este protocolo se utilizó para caracterizar el papel de la N-glicosilación en la expresión total y superficial de CaV Alfa 2 Delta 1 en células TSA201.

Para acceder a la superficie celular, se midió la expresión de proteínas HA en células no permeabilizadas que tenían sitios de N-glicosilación interrumpidos en cuatro sitios, 16 sitios o ningún sitio. Los niveles de FITC fueron fuertes en el tipo salvaje y en las células con células de N-glicosilación alteradas en cuatro localizaciones, pero sólo se encontraron niveles de fondo en las células con 16 localizaciones alteradas. Para las células permeabilizadas, la fluorescencia de FITC aumentó para todas las condiciones, lo que indica que todas las proteínas CaV Alpha 2 Delta 1 transfectadas, marcadas con HA, se tiñeron y detectaron mediante el anticuerpo anti HA FITC.

Además, los niveles de fluorescencia de mCherry fueron similares para las células permeabilizadas y no permeabilizadas, lo que significa que la permeabilización no altera la señal relativa de mCherry. Los ensayos realizados después de la permeabilización celular mostraron que la expresión total de proteínas para las células con 16 ubicaciones alteradas también disminuyó significativamente, ya sea que se dedujera de la fluorescencia FITC en células permeabilizadas o de la fluorescencia constitutiva de mCherry medida en células no permeabilizadas y en células permeabilizadas. Además de este procedimiento, se pueden realizar registros fisiológicos adicionales para correlacionar la expresión y la función de los canales iónicos.

Esta técnica también abre el camino a los investigadores del campo de la medicina para estudiar el impacto de las mutaciones genéticas, las modificaciones postraduccionales, los microRNAs, las pequeñas GTPasas y el papel de las chaperonas en el tráfico de proteínas de membrana expresadas en células recombinantes o nativas. Después de ver este video, debería obtener una buena comprensión de cómo realizar la transfección de ADN en células recombinantes, para teñir NTAC y células permeabilizadas, así como para realizar análisis de datos en las muestras. No olvide que trabajar con células vivas requiere precauciones como trabajar en el líquido helaminal para la transfixión y usar guantes cuando se manipulan productos químicos.