Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

El objetivo general de este método es cuantificar la expresión en la superficie celular de proteínas de membrana utilizando un ensayo con espaciado fluorescente. La principal ventaja de esta técnica es que los ensayos de citometría de flujo proporcionan puntos finales cuantificables en grandes volúmenes de células vivas en un solo experimento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y la terapia de arritmias ventriculares cardíacas, ya que estas patologías están frecuentemente asociadas con mutaciones genéticas que causan defectos en el tráfico de canales iónicos cardíacos.

Generalmente, las personas nuevas en este método tienen dificultades para identificar un sitio de inserción extrorsal adecuado para el epítopo que no afecte la función de su proteína y que genere una señal fluorescente fuerte en presencia del anticuerpo conjugado. Este procedimiento será demostrado por Benoite Bourdin, una asistente de investigación de mi laboratorio. Para comenzar, marque doblemente las construcciones de ADN con mCherry en el extremo C intracelular.

Además, exprese un epítopo de hemaglutinina orientado hacia el exterior celular, que puede medirse mediante un anticuerpo fluorescente para estimar la expresión en la superficie celular de proteínas de membrana. A continuación, cultive una placa de células TSA201 utilizando técnicas estándar hasta que alcancen una confluencia del 90 %. Para cada muestra, prepare los reactivos de transfección en dos tubos.

Prepare un tubo de 1,5 mililitros con cuatro microgramos de ADN y 250 microlitros de medio con suero reducido, y un segundo tubo con 10 microlitros del reactivo de transfección mediada por liposomas y 250 microlitros de medio de cultivo con suero reducido. Mezcle suavemente los dos tubos e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, combine suavemente el contenido del tubo uno y el tubo dos e incube los complejos de ADN liposómico durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Agregue los complejos a las células cultivadas y agite suavemente la placa de cultivo. Devuelva la placa a 37 grados Celsius y bajo una atmósfera de 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Veinticuatro horas después de la adición del reactivo de transfección, retire el medio de la placa de cultivo y lave cuidadosamente las células con 400 microlitros de tripsina-EDTA precalentada.

Luego, agregue 400 microlitros de tripsina-EDTA e incube la placa durante cinco minutos para permitir que las células se desprendan de la placa. Una vez que se hayan desprendido, detenga la digestión enzimática añadiendo un mililitro de medio de cultivo frío sin penicilina ni estreptomicina a las células. Pase suavemente el medio con una pipeta sobre la placa de cuatro a cinco veces para lavar todas las células de la superficie.

Luego, recolecte las células en tubos estériles de 1,5 mililitros e inmediatamente colóquelos en hielo. Para los siguientes pasos, use soluciones frías y mantenga las células a cuatro grados para evitar la internalización del epítopo de superficie. Asimismo, reduzca la exposición de las células a la luz con el fin de limitar el fotoblanqueo de la señal fluorescente.

A continuación, centrifugue los tubos para sedimentar las células. Luego, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante resultante. Re suspenda el sedimento para preparar una suspensión individual de células utilizando un mililitro de PBS.

Luego, centrifugar brevemente los tubos. Precipitar y resuspender las células una vez más para eliminar completamente el medio de cultivo. A continuación, resuspender el precipitado celular en 600 microlitros de PBS.

Mida la concentración celular y ajústela a al menos tres millones de células por mililitro. A continuación, divida las células en nuevos tubos de 1,5 mililitros. Asegúrese de incluir los controles apropiados para discriminar la tinción específica de la no específica, así como para tinción extracelular y también para tinción intracelular.

El anticuerpo control de isótopo ayudará a evaluar el nivel de tinción de fondo y debe coincidir con el anticuerpo primario, el isótopo adecuado y el fluoróforo. Es importante utilizar el anticuerpo control de isótopo y el anticuerpo fluorescente en la misma concentración. Para estimar la expresión en la superficie celular de las proteínas de membrana, primero marque únicamente el epítopo HA orientado hacia el exterior celular utilizando un anticuerpo conjugado con fluorescencia.

Luego, agregue un anticuerpo monoclonal anti-HA conjugado con FITC a cinco microgramos por mililitro al tubo. Agite brevemente las células mediante vortex y luego incúbelas en una plataforma agitadora en la oscuridad. Retire las células de la oscuridad y agregue 900 microlitros de PBS.

Luego, centrifugue el tubo para formar un pellet de células y aspire el sobrenadante. A continuación, lave las células resuspendiendo el pellet en un mililitro de PBS y vortexe brevemente las células. Después, repita el paso de centrifugación para volver a formar el pellet de células.

Repita este paso de lavado un total de tres veces para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Después del lavado final, re suspenda las células en 500 microlitros de PBS y transfiera la suspensión de células individuales a un tubo de citometría de flujo de cinco mililitros. Mantenga las células en la oscuridad a cuatro grados Celsius hasta que se analice la muestra.

Para estimar la expresión intracelular de proteína total, marque a continuación las células permeabilizadas. Esto se logra utilizando un protocolo similar al marcado extracelular, pero con la adición de un tampón de permeabilización celular a base de saponina. Precipite las células, deseche el sobrenadante y re suspenda las células en 100 microlitros de solución de fijación y permeabilización directamente del stock preparado.

Incube las células en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de lavado de permeabilización recién preparado y vortexe brevemente las células. A continuación, centrifugue para formar el pellet celular y lávelas dos veces más utilizando el tampón de lavado de permeabilización.

Luego, agregue el anticuerpo monoclonal anti HA conjugado con FITC a 5 microgramos por mililitro y 100 microlitros del tampón de lavado permeabilizante. Vortexe brevemente las células e incube las células a oscuras a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. A continuación, agregue 100 microlitros del tampón de lavado permeabilizante.

Centrifugar las células y lavarlas tres veces con 100 microlitros del mismo tampón mostrado anteriormente. Después del último lavado, resuspender las células en 500 microlitros de PBS y transferir la suspensión de células individuales a un tubo de citometría de flujo de cinco mililitros. Analizar las células no permeabilizadas y las permeabilizadas mediante citometría de flujo el mismo día.

Para comenzar, inicie el software de análisis de citometría de flujo e importe los archivos fcs creados durante la citometría de flujo. Haga clic en la primera muestra e inicie el proceso de selección en el gráfico de dispersión lateral versus dispersión anterior. A continuación, dibuje la compuerta P1 utilizando el icono de elipse alrededor de las células viables para eliminar cualquier resto, células muertas o agregados.

Luego, dibuje el gráfico de contorno de parámetros del tubo de la intensidad de fluorescencia de mCherry frente a FITC. Establezca la compuerta P2 alrededor de las células positivas para FITC y mCherry y la compuerta P3 alrededor de la población celular negativa para fluorescencia. A continuación, seleccione las compuertas P2 y P3 y haga clic en el icono de agregar estadísticas en la ventana del área de trabajo original.

Haga clic en contar y luego haga clic en media. Finalmente, aplique los parámetros de las compuertas y las estadísticas a todas las muestras analizadas por el citómetro. Este protocolo se utilizó para caracterizar el papel de la N-glicosilación en la expresión total y en la superficie celular de CaV Alpha 2 Delta 1 en células TSA201.

Para acceder a la expresión de proteínas de superficie celular, se midió la HA en células no permeabilizadas que presentaban sitios de N-glicosilación interrumpidos en cuatro sitios, 16 sitios o ningún sitio. Los niveles de FITC fueron fuertes en el tipo salvaje y en las células con N-glicosilación interrumpida en cuatro ubicaciones, pero solo se detectaron niveles de fondo en las células con 16 ubicaciones interrumpidas. En el caso de las células permeabilizadas, la fluorescencia de FITC aumentó en todas las condiciones, lo que indica que todas las proteínas transfectadas de CaV Alpha 2 Delta 1 marcadas con HA fueron teñidas y detectadas por el anticuerpo anti-HA conjugado con FITC.

Además, los niveles de fluorescencia de mCherry fueron similares en células permeabilizadas y no permeabilizadas, lo que indica que la permeabilización no altera la señal relativa de mCherry. Los ensayos realizados tras la permeabilización celular mostraron que la expresión total de proteína en las células con 16 localizaciones interrumpidas también se redujo significativamente, ya fuera inferida a partir de la fluorescencia de FITC en células permeabilizadas o a partir de la fluorescencia constitutiva de mCherry medida en células no permeabilizadas y permeabilizadas. Además de este procedimiento, se pueden realizar grabaciones fisiológicas adicionales con el fin de correlacionar la expresión y la función de los canales iónicos.

Esta técnica también allana el camino para que los investigadores en el campo médico estudien el impacto de las mutaciones genéticas, las modificaciones postraduccionales, los microARN, las pequeñas GTPasas y el papel de las chaperonas en el tráfico de proteínas de membrana expresadas en células recombinantes o nativas. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión sobre cómo realizar la transfección de ADN en células recombinantes, cómo teñir células NTAC y permeabilizadas, así como cómo realizar el análisis de datos en las muestras. No olvides que trabajar con células vivas requiere precauciones, como trabajar en el fluido helaminal durante la transfección y usar guantes al manipular productos químicos.