La administración oral de la rotenona con una sonda y Análisis de Imágenes de la alfa-sinucleína inclusiones en el sistema nervioso entérico

Los síntomas de la enfermedad de Parkinson, incluida la disfunción motora y del habla, son el resultado de la reducción de la actividad de las células secretoras de dopamina en el cerebro. El sistema nervioso entérico y el bulbo olfatorio son las estructuras nerviosas más expuestas y las primeras en verse afectadas. La enfermedad de Parkinson se ha asociado con la exposición a pesticidas.

Con el fin de analizar los efectos de los plaguicidas sobre el sistema nervioso entérico, el plaguicida roone se administra a ratones por sonda nasogástrica oral. A continuación, los ratones se perfunden intracardíacamente con un 4% de paraforme, aldehído cerebral y sistema nervioso entérico. Se extrae el tejido, se prepara y se inmunotiñen las proteínas asociadas a la EP.

Las imágenes de beta tres tubulina y alfa sinucleína adquiridas por microscopía confocal demuestran la acumulación de alfa sinucleína dentro de las neuronas del sistema nervioso entérico en animales expuestos a pesticidas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la administración sistémica de rotenona, es que al utilizar esta técnica, se garantiza que el efecto de la rotenona se limite al sistema nervioso entérico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la enfermedad de Parkinson, como su etiología y los mecanismos subyacentes a su progresión.

Las implicaciones de esta técnica amplían la terapia de torre y el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson, ya que permitirán el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas y métodos diagnósticos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson, también se puede aplicar a otros sistemas, como el estudio del efecto de otras toxinas ambientales en los sistemas nerviosos entérico, simpático y parasimpático, así como en la pared intestinal. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque lleva un tiempo dominar el sonda nasogástrica.

La primera vez que tuve la idea de estos métodos fue cuando leí sobre la relación entre los pesticidas y la enfermedad de Parkinson. También fue útil ver una conferencia de altos CORA en el Congreso Mundial de Parkinson en Berlín en 2005. Es necesaria una demostración pacífica de este método.

El método para administrar ol con la sonda nasogástrica es difícil ya que los ratones tienen una anatomía diferente a la de los humanos en el otro lado, el análisis de imágenes se realizó con pasos personalizados para estas imágenes. Comience el protocolo pesando al animal. Calcule el volumen adecuado de rotenona.

Se necesitan 0,01 mililitros por gramo de peso del animal, lo que corresponde a una dosis de cinco miligramos por kilogramo de peso. Cargue una jeringa de un mililitro con la solución roone, luego cargue una segunda jeringa con la solución para vehículos. Levanta el ratón y sostén la cola del ratón con una mano.

Estira la piel del cuello tirando de ella con los dos primeros dedos de la otra mano. Una vez que la cabeza esté fija entre los dos dedos, apóyala contra la palma de la mano y gírala boca abajo. Arregla la cola.

Con el cuarto y quinto dedo, manteniendo la cabeza hacia atrás, presione el paladar para abrir la boca del ratón. Introduzca suavemente la sonda nasogástrica en la boca. Mueva lentamente la sonda nasogástrica en dirección al estómago hasta que se inserte toda su longitud.

Con el fin de evitar que el material entre en los pulmones, administre la solución o el vehículo presionando suavemente el émbolo. Cuando haya terminado, extraiga lentamente la sonda nasogástrica, vuelva a colocar el animal en otra jaula hasta que todos los animales de una jaula estén listos. Después del tratamiento, los ratones se profunden intracardíacamente con aldehído paraforme al 4%.

En PBS, las tripas se extraen por disección y se colocan en sacarosa al 15% durante la noche. Al día siguiente, el tejido se transfiere a sacarosa al 30% y se incuba de nuevo durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, el tejido se coloca en un congelador a menos 80 grados centígrados y se almacena hasta su uso utilizando un criostato de 20 micras en el intestino

Las secciones transversales se transfieren a portaobjetos rost, procedimientos de bloqueo e inmunotinción. A continuación, se utilizan anticuerpos anti beta tres tubulina y antifa sinucleína. Se recomienda que una persona externa realice un análisis ciego de los datos.

Para comenzar el análisis, abra el software Fiji. Abra el archivo de imagen confocal. A continuación, divida los canales para que sea posible trabajar en cada canal de forma independiente.

Cierre los canales que no se van a utilizar y seleccione, analice, establezca, escale y establezca el tamaño de píxel en uno. Establezca la distancia conocida en 0,13 y haga clic en global. El tamaño de la imagen ahora se mostrará en micras.

Seleccione el canal de alfa sinucleína y seleccione el ganglio. Asegurándose de que la selección encierre el ganglio en todas las rodajas. Duplica la imagen con el ganglio seleccionado, solo se duplicará una imagen del tamaño del ganglio.

Presione editar, borrar fuera de la parte de la imagen fuera de la región seleccionada se volverá negra. Vuelva a duplicar la imagen para determinar qué tan bien salió el procedimiento. Las imágenes que tienen una relación señal/ruido de fondo baja no deben utilizarse para el análisis de imágenes.

Seleccione el umbral de ajuste de imagen. A continuación, seleccione Entropía máxima. A continuación, pasa por encima de las rebanadas de la imagen recortada y de la original para asegurarte de que el procedimiento ha ido bien.

El umbral trópico selecciona un nivel de señal de intensidad basado en el histograma de la imagen, y solo los píxeles con intensidades superiores a este umbral se mostrarán en un proceso de selección de imagen en blanco sobre negro. A continuación, haga clic en suavizar. Este paso transforma los bordes pixelados de las imágenes en un proceso de selección de bordes suaves.

A continuación, haga clic en binario y elija Hacer binario. La imagen se mostrará como una imagen duplicada en blanco y negro para realizar el siguiente paso en la imagen duplicada, haga clic en analizar, analizar partículas. A continuación, seleccione Mostrar esquemas y haga clic en resumir.

El resto de la configuración debe dejarse en valor predeterminado. Esta función reconoce el número total de píxeles con una señal y los que están agrupados en la superficie total de píxeles con señal. Además, se informa del número de grupos de píxeles y el tamaño medio.

Compare y seleccione la porción con el área total más grande que se ajuste bien. Se marcará el sector. Copie la tabla de datos con la superficie total de alfa sinucleína, el número de inclusiones y el tamaño medio de partícula.

Pega los datos en una hoja de cálculo de Excel o anotándolos en otro lugar. Regreso a Fiyi. Busque el corte seleccionado anteriormente en el canal beta tubulina y selecciónelo.

Seleccione el área ganglionar y haga clic en analizar. A continuación, seleccione medir. Aparecerá otra tabla que muestra la superficie total del ganglio.

Extraiga los datos de la tabla en una hoja de cálculo de Excel cerca de la medición de alfa sinucleína o cópielos en otro lugar usando Excel. Dividir los diferentes parámetros obtenidos en la medición de alfa-sinucleína por la superficie ganglionar para obtener la superficie total de alfa-sinucleína y el número de inclusión normalizado por el tamaño del ganglionar con el fin de analizar los efectos de la acción local sobre el sistema nervioso entérico, se administraron cinco miligramos por kilogramo del pesticida podrido conocido por vía oral a ratones C 57 seis negros de 1 año de edad. El cromatograma que se muestra aquí muestra la presencia de un pico conocido de rotan una hora después de la administración, ratones tratados con ratones tratados con 20 miligramos por kilogramo de rotenona 10 y cinco miligramos por kilogramo de rotenona.

Los niveles de rotenona se determinaron para extracciones de sangre y cerebro y tronco encefálico por HPLC, como se muestra aquí. La administración de cinco miligramos por kilogramo de podrido por sonda oral no da como resultado niveles medibles en la sangre una, dos o tres horas después del tratamiento según lo determinado por H plc. Este gráfico muestra los niveles de pudrición en el cerebro y el tronco encefálico de los ratones tratados.

Una hora después de la extracción, la administración de 10 miligramos por kilogramo o menos de rotenona muestra que no hay niveles de rotón en muestras de encéfalo o tronco encefálico. Una hora después de la administración del complejo mitocondrial, se evaluó una actividad en muestras de músculo y cerebro de ratones tratados durante 1,5 meses. No hay diferencias significativas entre los grupos que no muestran inhibición del complejo mitocondrial uno, lo que confirma que no hubo ningún problema en estas regiones.

El análisis de la enfermedad de Parkinson, componente del cuerpo de Lewy alfa sinucleína después de la administración de rone permite la determinación confiable de la cantidad total de superficie de alfa sinucleína, la presencia de inclusiones de alfa sinucleína y el patrón de alfa sinucleína en la célula. Esta figura muestra la tinción de anti beta tres tubulina, alfa sinucleína y DAPI en secciones de duodeno e íleon, como se puede ver aquí. El tratamiento de 1,5 meses con Roach Known indujo un aumento del patrón de punteado de alfa sinucleína dentro de los ganglios del sistema nervioso entérico, incluso uno en comparación con los controles de tres meses.

Este patrón se puede ver tanto en el íleon como en el duodeno. Después de tres meses de tratamiento, se puede ver la formación de inclusiones de alfa sinucleína más grandes, la tinción inmunofluorescente utilizando anti alfas sinucleína, theof, flavina y DPI demuestra la agregación de acumulaciones de alfa sinucleína más grandes solo a los tres meses. Este experimento se analizó utilizando métodos de segmentación automática y umbrales basados en entropía.

En el gráfico de la izquierda, cada columna representa la superficie total de alfa sinucleína a la superficie ganglionar. En el gráfico de la derecha, cada columna representa el número total de inclusiones de alfa sinucleína por superficie ganglionar tomada. En conjunto, estos datos sugieren que la administración local de rotenona induce la fosforilación, acumulación y agregación de alfa sinucleína con gliosis en los ganglios del sistema nervioso entérico Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un minuto por animal si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante introducir la sonda nasogástrica suavemente, y si se encuentra algún obstáculo, es mejor sacarla e introducirla nuevamente siguiendo estos procedimientos. Se pueden realizar otros métodos como la HPLC, la inmunotinción y el análisis de imágenes. Esto permitirá analizar otras regiones, los efectos de la sustancia o incluso la presencia de la sustancia en la sangre después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los neurocientíficos investigaran los efectos de las neurotoxinas ambientales en el sistema nervioso entérico. Después de ver este video, debería poder aplicar el medidor correctamente y analizar las imágenes que provienen de la inmunoquímica. No olvide que trabajar con podrido puede ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, recomendamos el uso de guantes y mascarillas mientras se realiza este procedimiento. El.