La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando

El objetivo de este procedimiento es utilizar la electrotransferencia in utero para visualizar y manipular genéticamente las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón. Esto se logra primero inyectando la solución de ADN del plásmido deseado en el ventrículo lateral de embriones in utero. A continuación, utilizando diferentes posiciones de los electrodos Palo.

Según la inyección de ADN, se realiza una electro poración en la corteza cerebral o en el hipocampo, seguida de las etapas posnatales o adultas deseadas. Los ratones se perfunden y se recolectan los cerebros. Finalmente, los cerebros se seccionan con un vibram.

Finalmente, las dendritas y las espinas pueden visualizarse mediante microscopía confocal. La técnica de electroforesis unitaria presenta varias ventajas en comparación con los métodos para estudiar las dendritas y las espinas. De hecho, esta técnica permite en primer lugar estudiar este aspecto directamente in vivo.

Además, en comparación con la generación de ratones knockout, la electrooperación es un enfoque rápido para estudiar el efecto de la supresión génica o la expresión génica en el desarrollo del cerebro y las espinas, no solo en estructuras celulares específicas, sino también en un momento específico del desarrollo. El uso de un sistema inducible en la electrooperación intermedia también es una herramienta útil para identificar interacciones funcionales entre genes implicados en el desarrollo del cerebro y las espinas. De hecho, en contraste con los virus, por ejemplo, es posible para nosotros combinar múltiples ARN o múltiples genes en la misma población de células. Para comenzar, diluya el ADN a las concentraciones deseadas en agua y agregue el colorante azul de metilo a una concentración final del 0,05 %. Utilice un micropipeteador para elaborar agujas de vidrio para la inyección.

Coloque un ratón preñado en una cámara de inducción anestésica utilizando isoflurano y abra el oxígeno hasta dos litros por minuto. Cuando el animal pierda el reflejo de parpadeo, transfiera el animal a una máscara de pre-cirugía. Coloque una gota de IGEL en cada ojo y use una afeitadora eléctrica para afeitar el vello del abdomen.

Limpie el área afeitada una vez con clorhexidina para recoger el vello suelto. Transfiera el animal a una segunda máscara en el área quirúrgica con su dorso sobre la almohadilla calefactora. Comience la cirugía cuando se haya perdido el reflejo palpebral.

Póngase una mascarilla y guantes estériles, y cubra al animal con un campo estéril. Limpie el área afeitada al menos tres veces con clorhexidina. Utilice un bisturí para realizar una incisión vertical a lo largo de la línea media a través de la piel.

Utilizando tijeras, realice una incisión similar en el músculo del abdomen a lo largo del codo lineal. Seleccione los embriones más accesibles.

Coloque la pinza de anillo entre dos embriones y extraiga cuidadosamente la cadena embrionaria de la cavidad abdominal. A partir de este momento, mantenga los embriones hidratados con PBS estéril precalentado. Utilizando la pinza de anillo.

Manipule suavemente la posición del embrión dentro de la bolsa amniótica y estabilice la cabeza entre los anillos. Presione suavemente para empujar al embrión hacia arriba, acercándolo más a la pared uterina. Con la otra mano, tome el porta-capilares e inserte cuidadosamente la aguja en el centro del hemisferio para dirigirla al ventrículo lateral.

Teniendo cuidado de minimizar el movimiento de la aguja en la superficie de la pared uterina y evitando perforar vasos sanguíneos, presione el pedal para inyectar aproximadamente 0,5 microlitros de solución verde de ADN. Coloque los electrodos a los lados de la cabeza del embrión, con el pedal positivo del mismo lado que el ventrículo inyectado para la electroforesis cortical, o en el lado opuesto al ventrículo inyectado para la electroforesis del hipocampo. A continuación, aplique cinco pulsos eléctricos de 30 voltios con una duración de 50 milisegundos cada uno, a intervalos de un segundo.

Evite aplicar corriente a través de la placenta, ya que esto provocará la muerte del embrión. Para aumentar las probabilidades de supervivencia, inyecte y realice la electrooperación a todos los embriones en menos de 30 minutos. Una vez finalizado en PBS, la cavidad abdominal, utilice fórceps en forma de anillo para reposicionar el cuerno uterino en su ubicación original. Cierre el abdomen, la pared y la piel con suturas absorbibles de vicril. Coloque al animal en una cámara de recuperación hasta que despierte.

Luego transfiera el espécimen a una jaula sobre una almohadilla calefactora 24 y 48 horas después de la cirugía. Revise el comportamiento del ratón para evaluar dolor, sufrimiento o malestar, y pese al animal para analizar los cerebros. En etapas posnatales, utilice un vibrátomo para seccionar cerebros previamente perfundidos y postfijados; monte las secciones en aqua poly mount para imaginar dendritas y espinas.

Esta figura muestra ejemplos de células electro poradas en la corteza cerebral, el cuerpo amigdalino y el giro dentado del hipocampo, mientras que ratones tipo fueron electro porados en el día 14,5 de desarrollo embrionario, momento en el que se obtuvieron el constructo GFP y los cerebros al día 14 posnatal. Al inyectar un pequeño volumen de solución de ADN, se marcan pocas células, lo que permite la visualización de la arborización dendrítica de células aisladas positivas para GFP, así como de sus espinas a mayor aumento. Al realizar este procedimiento, es importante recordar inyectar un pequeño volumen de ADN para dirigirse solo a pocas células y poder visualizar y cuantificar las espinas dendríticas o los electro neuronas.