La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando En el útero La electroporación

El objetivo de este procedimiento es su uso en el útero, la electroporación, para visualizar y manipular genéticamente dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón. Esto se logra inyectando primero el plásmido deseado, la solución de ADN, en el ventrículo lateral de los embriones en el útero. A continuación, utilizando diferentes posiciones de los electrodos de Palo.

De acuerdo con la inyección de ADN, se electropora la corteza cerebral o el hipocampo, y luego se desea una etapa postnatal o adulta. Se perfunden ratones y se recolectan cerebros. Finalmente, los cerebros se seccionan con un vibram.

En última instancia, las dendritas y las espinas se pueden visualizar mediante microscopía confocal. La técnica de electroporación unitaria presenta varias ventajas en comparación con los métodos de estudio de la columna vertebral y la no derecha. De hecho, esta técnica permite estudiar primero este aspecto directamente in vivo.

Por otra parte, en comparación con la generación de ratones knockout en electro operación es un enfoque rápido para estudiar el efecto de la supresión de genes o la expresión génica y el color blanco y la columna vertebral, no solo en la estructura celular específica, sino también en un punto específico de desarrollo. El uso de un sistema inducible en la operación inter electro también es una herramienta útil para identificar la interacción funcional entre los genes involucrados en la escritura y el desarrollo de la columna vertebral. De hecho, a diferencia de los virus, por ejemplo, nos resulta difícil combinar varios genes HNA o varias toneladas en la misma población de células Para comenzar, diluya el ADN a las concentraciones deseadas en agua y agregue un tinte verde rápido hasta una concentración final de 0.05%Utilice un extractor de micro perpeto para extraer agujas de vidrio para la inyección.

Coloque una rata embarazada en una cámara de inducción anestésica con flúor y abra el oxígeno hasta dos litros por minuto. Cuando el animal pierda su reflejo de escritura, transfiéralo a una máscara preoperatoria. Coloque una gota de IGEL en cada ojo y use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el vello del abdomen.

Limpie el área afeitada una vez con clorhexidina para recoger el vello volador. Transfiera al animal a una segunda mascarilla en el área quirúrgica con la espalda sobre la almohadilla térmica. Comience la cirugía cuando se haya perdido el reflejo pétalo.

Colóquese una mascarilla y guantes estériles y cubra al animal con un paño estéril. Limpie el área afeitada al menos tres veces con clorhexidina. Use un bisturí para hacer una incisión vertical a lo largo de la línea media a través de la piel.

Con unas tijeras. Haga una incisión similar en el músculo del abdomen a lo largo del codo lineal. Elegir los embriones más accesibles.

Coloque pinzas de anillo entre dos embriones y extraiga con cuidado la cadena embrionaria de la cavidad abdominal. A partir de este momento, mantener los embriones hidratados con PBS precalentado estéril. Uso de pinzas de anillo.

Manipule suavemente la posición del embrión dentro del saco amniótico y estabilice la cabeza entre los anillos. Aprieta suavemente para empujar el embrión más cerca de la pared uterina. Con la otra mano, tome el soporte capilar e inserte con cuidado la aguja en el centro del hemisferio para apuntar al ventrículo lateral.

Teniendo cuidado de minimizar el movimiento de la aguja en la superficie de la pared uterina y evitando perforar los vasos sanguíneos, presione el pedal para inyectar alrededor de 0,5 microlitros de solución de ADN verde. Coloque los electrodos a los lados de la cabeza del embrión con el pedal positivo en el mismo lado que el ventrículo inyectado para la electroporación de la corteza, o en el lado opuesto del ventrículo inyectado, la electroporación del hipocampo. A continuación, aplique cinco pulsos eléctricos de 30 voltios de 50 milisegundos de duración a intervalos de un segundo.

Evite aplicar corriente a través de la placenta, ya que esto provocará la muerte del embrión. Para aumentar las posibilidades de supervivencia, inyecte y electroopere todos los embriones en menos de 30 minutos cuando se completen en PBS, la cavidad abdominal, y use las pinzas de anillo para reemplazar el cuerno uterino en su ubicación original. Utilice suturas absorbibles de vicryl para cerrar el abdomen, la pared y la piel. Coloque al animal en una cámara de recuperación hasta que despierte.

Luego, transfiéralo a una jaula en una almohadilla térmica 24 y 48 horas después de la cirugía. Comprobar el comportamiento del ratón para evaluar el dolor, el sufrimiento o la angustia, y pesar al animal para analizar el cerebro. En las etapas postnatales, use un vibrador para seccionar los cerebros previamente perfundidos y los cerebros postfijos monten las secciones en montaje de polietileno acuático para obtener imágenes de dendritas y espinas.

Esta figura muestra ejemplos de células electroporadas en la corteza cerebral, el crono ca uno y dentado del hipocampo, mientras que los ratones tipo fueron electroporados en E 14.5, donde la construcción de GFP y los cerebros se recolectaron en el día postnatal 14. Al inyectar un pequeño volumen de solución de ADN, se marcan unas pocas células, lo que permite la visualización de la arborización dendrítica de las células aisladas positivas para GFP, así como sus espinas a mayor aumento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar inyectar un pequeño volumen de ADN para dirigirse solo a unas pocas células, y para poder visualizar y cuantificar las neuronas electrónicas.