Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante
28 de febrero de 2016
Este manuscrito describe cómo la entrega de genes locales mediada por vectores virales proporciona una forma atractiva de expresar transgenes en el sistema nervioso central. El protocolo describe todos los pasos cruciales para realizar una inyección de vector viral en la sustancia negra de la rata para desarrollar un modelo animal basado en vectores virales para la enfermedad de Parkinson.
El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo animal basado en vectores virales para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáxica en el sistema nervioso central. Este método puede utilizarse para desarrollar modelos animales normales que permitan pruebas preclínicas de fármacos y que pueden ser útiles para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad de Parkinson, así como de muchos otros trastornos neurodegenerativos. La principal ventaja de esta técnica es que puede emplearse para dirigirse específicamente a regiones cerebrales determinadas.
Se puede lograr una alta expresión cerebral mediante la técnica de trenching y se puede utilizar para crear modelos animales en cepas y especies animales específicas. Se han desarrollado diferentes sistemas vectoriales finales. La elección del sistema vectorial depende del tamaño del trenching que se desea expresar, la duración de la expresión génica, las estructuras que se desean dirigir y las consideraciones de bioseguridad.
La procedura será demostrada por Annelies Aertgeerts, una técnica de nuestro laboratorio. Comience por anestesiar adecuadamente una rata hembra Wistar de ocho semanas de edad según los protocolos aprobados. Verifique que se ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia apretando cada pata y observando la ausencia del reflejo de retirada.
A continuación, utilice un implantador MicroTransponder para colocar un MicroTransponder en la espalda de la rata. Verifique que el MicroTransponder esté posicionado correctamente y que se pueda obtener una lectura. Ahora corte el pelo del cuero cabelludo de la rata y aplique anestésico local en el cuero cabelludo y las orejas.
Transfiera la rata a un cabina de flujo laminar y realice el resto del procedimiento utilizando técnica aséptica. Coloque la rata en el marco estereotáxico, asegurando primero las barras para los oídos y luego la barra para la boca y la nariz. Cubra el cuerpo de la rata con una manta de papel para evitar una caída en la temperatura corporal.
Aplique un lubricante ocular para prevenir que los ojos se sequen. A continuación, desinfecte el cuero cabelludo según los procedimientos aprobados. Se utiliza aquí 1% de yodo en isopropil al 70%.
Después de realizar una pequeña incisión en la línea media del cuero cabelludo, raspe suavemente las membranas del cráneo y enjuague con solución salina. Después de permitir que el cráneo se seque, asegúrese de que bregma y lambda sean claramente visibles. Ahora, llene una jeringa microinyectora de 10 microlitros, calibre 30, de 20 milímetros, con AAV recombinante y colóquela en la bomba microinyectora motorizada conectada al instrumento estereotáxico.
Para la transducción específica de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, los vectores AV recombinantes son la primera opción debido a sus altos títulos y eficiencia para transducir neuronas dopaminérgicas. Compruebe el flujo liberando una gota de AAV. Deseche cualquier AAV liberado en un detergente limpiador polivalente.
Verifique visualmente que la cabeza esté fijada recta en el marco craneal. Luego, compruebe que el cráneo esté nivelado moviendo primero la punta de la aguja hasta el bregma y midiendo la altura en este punto, bajando la punta de la aguja en la dirección dorsal-ventral hasta que toque el cráneo. Repita el procedimiento en el lambda.
Después de regresar la aguja al bregma, mueva la aguja en la dirección anteroposterior y mediolateral hasta las coordenadas estereotáxicas para la microinyección. Anote las coordenadas. En el sitio de inyección, mida la altura del cráneo como antes, y asegúrese de que no difiera en más de 0,3 mm con respecto a la altura del bregma.
Luego, taladre cuidadosamente un orificio de dos milímetros en el cráneo. Una vez hecho el orificio, mida la altura de la duramadre para determinar el punto de referencia desde el cual aplicar la coordenada dorsal-ventral. Penetre la duramadre utilizando una aguja de calibre 26.
Absorba cualquier sangre con el tejido estéril y continúe solo después de que haya cesado completamente el sangrado. Ahora, baje lentamente la aguja de la jeringa de microinyección precargada hacia el cerebro hasta la coordenada dorsoventral. Espere un minuto.
Luego, inyecte tres microlitros de AAV a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto. Tras la inyección, deje la aguja en su lugar durante otros cinco minutos para prevenir el flujo de retroceso a lo largo del trayecto de la aguja antes de retirarla lentamente. Suture el cuero cabelludo utilizando poliéster trenzado codificado 3,0 y desinfecte la piel con yodo al uno por ciento y alcohol isopropílico al 70 %.
Para aflojar la barra nasal y bucal, y luego las dos barras auriculares, y retirar suavemente al animal del instrumento estereotáxico. En este momento, administre analgesia y, si es necesario, un agente reversor de la anestesia. Luego, coloque la rata en una jaula limpia sobre una placa calefactora ajustada a 38 grados Celsius y observe atentamente hasta que despierte.
Tras la cirugía, la cinética de la neurodegeneración puede estudiarse en el animal completo mediante pruebas conductuales y tomografía por emisión de positrones (PET), y tras el sacrificio, mediante técnicas de inmunohistoquímica. Se realizó la prueba del cilindro para evaluar el uso espontáneo de las extremidades anteriores en diversos momentos tras la microinyección de AAV recombinante que expresa la alfa-sinucleína con la mutación A53T en la sustancia negra. A partir de las tres semanas posteriores a la inyección, se observó una alteración motora significativa en las ratas que recibieron la dosis media.
A las cuatro semanas posteriores a la inyección, se observó una disminución del 50 % en el uso espontáneo de la pata delantera contralateral. Mientras que los animales control inyectados con eGFP no mostraron asimetría en el uso de la pata delantera. Las ratas que recibieron una dosis más alta del AAV recombinante 2/7A53T alfa-sinucleína mostraron un deterioro más pronunciado en el uso de la pata delantera a los 29 días después de la inyección.
Para demostrar que la alteración motora observada era dependiente de la dopamina, se administró una sola dosis de L-dopa. Cuando se repitió la prueba del cilindro 45 minutos después del tratamiento con L-dopa, se observó una recuperación completa del uso de las patas delanteras en los animales inyectados con el AAV recombinante 2/7A53T alfa-sinucleína. Para realizar un seguimiento no invasivo de la cinética de la neurodegeneración dopaminérgica nigroestriatal a lo largo del tiempo, en animales individuales, se cuantificó la unión del transportador de dopamina mediante tomografía por emisión de positrones en pequeños animales, utilizando F-18FECT como radioligando.
La unión al DAT disminuyó significativamente en el cuerpo caudado ipsilateral de ratas inyectadas con el virus adenoasociado recombinante 2/7A53T alfa-sinucleína a lo largo del tiempo. Después de 32 días, se observó una disminución en la unión al DAT de hasta el 85 %. Como control positivo, la inyección de la neurotoxina 6-OHDA en la sustancia negra indujo una pérdida del 90 % de la unión al DAT en siete días.
Secciones cerebrales de ratas microinyectadas con AAV recombinante 2/7A53T de alfa-sinucleína durante un período de tiempo fueron inmunotincionadas para tirosina hidroxilasa, un marcador de neuronas dopaminérgicas. Esta figura demuestra la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas durante un período de 29 días tras la microinyección. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 45 minutos.
Al realizar este procedimiento, es importante utilizar coincidencias de alta calidad con el vector final. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como imágenes por tomografía por emisión de positrones (PET) no invasivas, análisis del comportamiento y análisis inmunohistoquímico, con el fin de determinar el grado de neurodegeneración y neuropatología. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar una inyección de vector viral en la sustancia negra para desarrollar modelos animales basados en vectores virales para la enfermedad de Parkinson.
No olvide que trabajar con vectores virales puede ser peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como trabajar bajo flujo laminar y descontaminar adecuadamente los desechos al seguir este procedimiento.
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Descripción general
Este manuscrito describe un método para desarrollar un modelo animal basado en vectores virales para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáxica en el sistema nervioso central. Esta técnica permite la expresión génica dirigida a regiones cerebrales específicas, facilitando las pruebas preclínicas de fármacos y el estudio de trastornos neurodegenerativos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Terapia génica
- Trastornos neurodegenerativos
Antecedentes
- La entrega de genes mediante vectores virales es un método eficaz para la expresión génica en el cerebro.
- Este enfoque puede crear modelos animales para estudiar enfermedades como la de Parkinson.
- La orientación específica a regiones cerebrales mejora la relevancia de los modelos.
- Distintos sistemas de vectores pueden adaptarse según las necesidades de la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo animal confiable para la enfermedad de Parkinson.
- Facilitar las pruebas preclínicas de terapias potenciales.
- Explorar los mecanismos moleculares que subyacen a la enfermedad de Parkinson.
Métodos Utilizados
- Inyección estereotáxica de vectores virales en la sustancia negra.
- Selección de sistemas de vectores según el tamaño del gen y la duración de la expresión.
- Dirigirse a cepas y especies animales específicas para el desarrollo del modelo.
- Evaluación de los niveles de expresión génica en el cerebro.
Resultados principales
- Entrega exitosa de genes a regiones cerebrales diana.
- Establecimiento de un modelo animal funcional para la enfermedad de Parkinson.
- Altos niveles de expresión del transgén observados.
- Potencial para estudios adicionales sobre los mecanismos neurodegenerativos.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para la investigación de la enfermedad de Parkinson.
- La administración mediada por vectores virales puede mejorar la comprensión de la neurodegeneración.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el desarrollo de un modelo dirigido de rata para la enfermedad de Parkinson mediante la administración estereotáxica de vectores AAV recombinantes a la sustancia negra, lo que apoya la reducción mecanicista del riesgo asociado a la patología de alfa-sinucleína. El modelo facilita la evaluación preclínica de la neurodegeneración dopaminérgica y de intervenciones terapéuticas, proporcionando confianza predictiva para la validación de dianas en programas de enfermedades neurodegenerativas. Al lograr una expresión transgénica específica de región y puntos finales cuantificables en comportamiento y en imágenes, este enfoque se alinea con flujos de trabajo de descubrimiento temprano centrados en la aclaración de vías y en la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la neurodegeneración dopaminérgica mediada por alfa-sinucleína en un sistema relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de objetivos mediante la expresión transgénica específica de región y la fenotipificación conductual.
- Valor predictivo: Proporciona lecturas cuantitativas motoras y de imágenes que se correlacionan con la pérdida dopaminérgica, ayudando en la triage preclínica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados con fenotipos neurodegenerativos medibles para la selección de compuestos.
- Valor operativo: Proporciona resultados estandarizados y reproducibles mediante la prueba del cilindro y la imagen por tomografía por emisión de positrones (PET) de unión al transportador de dopamina (DAT) para disponibilidad del ensayo.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en distintos objetivos neurodegenerativos mediante la adaptación del vector y de las coordenadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Modela una pérdida progresiva nigroestriatal de las neuronas dopaminérgicas que refleja la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Relaciona la sobreexpresión de alfa-sinucleína con déficits conductuales dependientes de dopamina y neurodegeneración.
- Avance con Ajuste de Riesgo: Permite tomar decisiones de avance o interrupción del estudio basadas en la neurodegeneración dependiente de la dosis y la respuesta a la L-dopa.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento desde la validación del blanco, pasando por la identificación de compuestos iniciales, hasta la evaluación preclínica de la eficacia, permitiendo la evaluación iterativa de los mecanismos neurodegenerativos y de los candidatos terapéuticos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre la toxicidad de la alfa-sinucleína y la aclaración de vías en neuronas dopaminérgicas.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos con puntos finales cuantitativos en comportamiento y neuroimagen para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Proporciona la cuantificación de la unión al DAT mediante PET e inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa como biomarcadores traslacionales de neurodegeneración.
- Investigación Traslacional: Conecta la manipulación molecular con resultados funcionales, apoyando la continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para modelar dianas neurodegenerativas mediante la administración viral estereotáxica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la recapitulación de fenotipos clave de la enfermedad de Parkinson.
- Valor operativo: Procedimientos quirúrgicos y de inyección estandarizados garantizan la reproducibilidad entre diferentes centros y estudios.
- Valor estratégico: Permite decisiones tempranas de avance/no avance basadas en datos, al reducir la ambigüedad mecanicista en la interacción con la diana.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de terapias dirigidas contra la alfa-sinucleína, basada en datos de respuesta a la dosis y reversibilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica, manipulación de vectores virales y anestesia en roedores.
- Depende de la infraestructura para microtomía, inmunohistoquímica, imágenes por tomografía por emisión de positrones (PET) y pruebas conductuales.
- Necesita la estandarización entre equipos de coordenadas, títulos de vectores y regímenes de dosificación.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la selección del promotor, el tropismo del serotipo y el diseño del transgén para diferentes objetivos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad quirúrgica, la difusión del vector más allá de los núcleos diana y la cinética de expresión específica a la especie.
