Expresión, la solubilización de detergente, y purificación de un transportador de membrana, la proteína de resistencia a múltiples fármacos MexB

Con el fin de purificar la proteína de membrana Mex B, Mex B se expresa primero en E. coli utilizando métodos de ADN recombinante. A continuación, se aíslan las membranas y las proteínas de la membrana se solubilizan con un detergente suave. La proteína de membrana solubilizada se purifica a través de iMac y la proteína se purifica aún más mediante cromatografía de filtración en gel.

El nivel de purificación de la proteína se determina mediante electroforesis en gel de poli acilamida SDS. Aunque este procedimiento puede proporcionar información sobre los transportadores transmembrana de resistencia a múltiples fármacos, también se puede aplicar a otras proteínas de membrana, lo que demuestra que los procedimientos de hoy serán formados por un estudiante graduado de mi laboratorio Para este procedimiento, Mex B de pseudomonas Aosa se subclonará en el vector de expresión PET 30 B plus para que Mex B se exprese con una etiqueta de histamina HEXA terminal C. Comience por la noche inoculando cuatro cultivos de micina de lata de tres mililitros lb con transformantes frescos o use un caldo congelado, cultive los cultivos en un rodillo a 37 grados Celsius durante la noche por la mañana.

Use los cultivos nocturnos para inocular 150 mililitros de LB que contengan 30 microgramos por mililitro. ¿Puede Mycin cultivar el cultivo a 37 grados centígrados en una coctelera por la tarde? Utilice el cultivo pequeño para inocular seis veces un litro, dos medios XYT que contengan 30 microgramos por mililitro.

¿Puede la micina en los matraces de lomo de helecho? Use 25 mililitros por cultivo para una dilución de uno a 40. Cultive los cultivos a 37 grados centígrados hasta que alcancen una densidad óptica.

600 de 0,4 a 0,6, alrededor de 1,5 horas. Cuando los cultivos alcancen la densidad adecuada, induzca la expresión de proteínas añadiendo 0,5 mililitros de un molar. IPTG. Vuelva a colocar todos los frascos en la coctelera y continúe cultivándolos a 30 grados centígrados durante la noche hasta cosechar las bacterias a la mañana siguiente.

Recupera los cultivos de la coctelera y enfríalos. Luego, para recolectar las células, transfiera los cultivos a tubos de centrífuga y centrifuga a cuatro grados centígrados durante 30 minutos a 5.000 rotaciones por minuto en una centrífuga a gran escala mientras las células se centrifugan. Complemente 100 mililitros de tampón de suspensión celular re con ADN, inhibidores de la proteasa y lisozima.

También complemente dos alícuotas de tampón de suspensión Resus de membrana con inhibidores de la proteasa como se muestra en esta tabla. Mantenga las tres soluciones en hielo cuando se complete la centrifugación. Resus gasta los pellets de la célula en 100 mililitros de tampón de suspensión de la célula Resus.

A continuación, extrae las células. La suspensión de la célula se carga en la célula de presión francesa y la célula se coloca en la prensa francesa. La presión se aplica hasta que alcanza las 12.000 libras por pulgada cuadrada.

La válvula se abre una cantidad muy pequeña para que las células rotas salgan por filtros. Es importante no abrir demasiado la válvula y dejar que las células salgan a borbotones porque se liberarán con muy poca presión y no se romperán de manera eficiente. Recoja el lisado celular en una botella, mantenida fría en hielo.

Pase la solución de la celda a través de una celda de presión francesa nuevamente a 12,000 libras por pulgada cuadrada. Transfiera el lisado celular a los tubos de centrífuga SS 34 y a la centrífuga para eliminar los desechos celulares a 10.000 rotaciones por minuto durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en un rotor SS 34. El lisado clarificado es el siguiente.

Se utiliza para preparar la fracción de membrana. Transfiera con cuidado el supinato a ti. 6 4, 7 0,5 tubos ultra centrífugos, centrífuga en un rotor TI 6 4 7 0,5 a 40.000 rotaciones por minuto durante 50 minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el supinado. Utilice una pipeta para resuspender suavemente el pellet, que contiene las membranas celulares en aproximadamente 25 mililitros de tampón de suspensión Resus de membrana, transfiera la suspensión de la membrana a un tubo de centrífuga limpio y la ganancia de centrífuga en un rotor TI I 6 4 7 0.5 de 40.000 rotaciones por minuto durante 50 minutos de cuatro grados Celsius y vuelva a suspender la paleta de membrana lavada en 25 mililitros de tampón de suspensión Resus de membrana. A continuación, solubilice las proteínas de membrana a las membranas resuspendidas a unos 25 mililitros.

Agregue seis mililitros de 10% DDM para que la concentración final de detergente sea 2%DDM, balancee la mezcla a cuatro grados Celsius durante dos horas después de la incubación de dos horas en presencia de centrífuga DDM, la mezcla a 40, 000 rotaciones por minuto durante 40 minutos a cuatro grados Celsius en el rotor TI I 6 4 7 0.5. Con el fin de separar los complejos detergentes de proteínas solubles de las proteínas insolubles. Guarde el natante supino que contiene los complejos detergentes de proteínas Mex B para usar en la purificación, mezcle el natante supino que contiene los complejos de detergentes proteicos Mex B con dos mililitros de las perlas de afinidad del metal lon equilibradas en la suspensión Resus Buffer incube durante una hora en un rodillo a cuatro grados centígrados después de la unión de las proteínas a la resina.

Vierta la lechada en un cuerpo de columna de flujo por gravedad y deseche el flujo a través de él. Lave la columna con 20 mililitros o 10 volúmenes de columna de encuadernación y tampón de lavado para iMac cuando se complete el lavado de la columna. Eluir las proteínas unidas con 10 mililitros de tampón de elución iMac.

Tome 10 muestras de microlitros de cada fracción de elución. Mezclar con 10 microlitros de muestra de dos veces SDS, tampón y analizar en un 10% de poliacrilamida. Gel SDS.

Estimar la cantidad y pureza de mex B en cada fracción. Extraer las fracciones que contienen los complejos detergentes de proteína Mex B y concentrarlas en un concentrador de centrifugado a cuatro grados centígrados. Tenga cuidado de que la proteína no se precipite en este paso.

Use varios giros cortos y esté atento a las precipitaciones. Después de cada centrifugado, proceda a purificar las fracciones agrupadas utilizando una columna de filtración de gel. Preequilibre una columna Super Rose 12 HL 30 sobre 10 con 24 mililitros de tampón corriente y espere una línea de base plana.

A continuación, enjuague el bucle de carga del sistema del actor con el búfer en ejecución. Antes de aplicar la proteína a la columna, filtre la solución proteica con un filtro de jeringa. A continuación, cargue hasta 240 microlitros de la solución de proteínas en la columna con una proteína de hasta cinco miligramos por mililitro.

Ejecute volúmenes de 1,5 columnas de tampón y recoja fracciones de 0,25 mililitros. Los complejos de detergente proteico XB eluyen como un pico en alrededor de 10 a 15 mililitros de volumen de elución. Tome muestras de cinco microlitros de las fracciones máximas.

Mezcle cada muestra una a una con un tampón de muestras SDS de dos veces. Analice las muestras en un gel de poliacrilamida al 10% para estimar la cantidad y la pureza de me Mex B en cada fracción, extraiga las fracciones que contienen ME B puro. Este gel de poliacrilamida se cargó con fracciones extraídas de la columna iMac y fracciones individuales de la columna de filtración de gel. Después de la columna de filtración de gel, la proteína aparece pura en el gel de poliacrilamida teñido con kumasi.

Un rastro de la columna de filtración de gel muestra el pico principal del complejo de detergente proteico que se eluye de la columna. El rendimiento promedio de la proteína mxb es de aproximadamente dos miligramos por seis litros de dos cultivos XYT Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en ocho horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar, solubilizar y purificar una proteína de membrana.